生物：3.1《酶的制備及活力測定》ppt課件

1、3.1 3.1 酶的制備及活力測定酶的制備及活力測定實驗?zāi)康暮鸵?.掌握鹽析法制備活性蛋白質(zhì)的原理及方法。2.掌握過氧化物酶的活力測定方法。辣根過氧化物酶的制備及活力測定辣根過氧化物酶的制備及活力測定過氧化物酶催化以下反響 2H 2 O 2 O 2 +2H 2 O 這一類酶以鐵卟啉為輔基，所以屬血紅素蛋白質(zhì)類 (hemeproteins)。過氧化物酶在生物界分布極廣，在細(xì)胞代謝的氧化復(fù)原過程中起重要的作用。辣根過氧化物酶 (horse radish peroxidase，簡稱HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研討得最深化的一種過氧化物酶，早在20世紀(jì)30年代就有人著手從辣根中分別此酶，

2、以后又制備出結(jié)晶。本實驗是以辣根為原料，經(jīng)過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級分別，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冰凍枯燥，便可得到高純度的辣根過氧化物酶。辣根過氧化物酶是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì) ,Mr在40 000左右，等電點7.2。溶于水，溶解度為5%(W/V)，溶液呈棕紅色，透明。HRP可溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上那么不溶。該酶最適pH7.0(對愈創(chuàng)木酚為氫給體而言)。在室溫下，HRP幾周內(nèi)穩(wěn)定，加熱到63，在15min內(nèi)穩(wěn)定。氧化復(fù)原電勢很低，pH6.08時，E 0 =-0.2070V，pH為7.71時，E 0 =-0.2787V。 1.RZ值：提純?nèi)蝿?wù)的后幾步，以

3、及純酶溶液可用RZ值闡明酶的純度。RZ= A403nm/A275nm，403nm處的吸收代表血紅素輔基的吸收，275nm的吸收是蛋白質(zhì)的吸收，結(jié)晶的HRP的RZ值為3.04。測定時的酶濃度為1mg蛋白/mL。 2.愈創(chuàng)木酚法：測k4。以愈創(chuàng)木酚(鄰甲氧基酚，guaiacol)為氫給體，其反響產(chǎn)物四鄰甲氧基連酚.有色產(chǎn)物四鄰甲氧基連酚生成的速度(dx/dt)與底物過氧化氫及氫給體愈創(chuàng)木酚的濃度有關(guān)。 本實驗是采用測定 k4的方法來判別酶的純度。一、 HRP的制備 1.水提取：稱取5kg用水沖刷干凈的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐富的HRP)，用菜刀切成小碎塊，在絞肉機(jī)中絞碎12次。碎渣漿用1倍體積的水

4、低溫下攪拌提取過夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干機(jī)(或離心機(jī))甩干，搜集濾液，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取1次，合并2次濾液，測得總體積。 2.硫酸銨分級分別：在不斷攪拌下，每1 000mL濾液中漸漸參與226g硫酸銨粉末(相當(dāng)于0. 40飽和度，0)，大約在12h內(nèi)加完，置冷室中放置過夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下面混濁液以3 000r/min離心15min，棄沉淀，合并上清液。再按每1 000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌，當(dāng)硫酸銨全部溶解后，置冷室過夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰凍離心機(jī)中以13 000r/min離心20min，棄去上清液，搜

5、集沉淀。將沉淀懸浮于100150mL蒸餾水中(加水量要使沉淀全部溶解為止)，分裝于透析袋內(nèi)，放在流動自來水中進(jìn)展透析12天，直到硫酸銨透析終了為止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進(jìn)展檢查)。然后改換成用蒸餾水透析，中間改換23次，用0.1mol/L硝酸銀溶液檢查透析外液無氯離子為止。將透析液合并，在冰凍離心機(jī)中以4 000r/min離心15min，棄去沉淀，量上清液的體積。 3.丙酮分級分別：將上清液倒入燒杯并置冰鹽浴中，在不斷攪拌下，用細(xì)滴管沿杯壁參與1倍體積預(yù)冷至15的丙酮，放置片刻，在冰凍離心機(jī)中以4 000r/min離心15min，棄去沉淀。上清液再參與0.8體積(按原上清液體積)15丙

6、酮，(操作同上)，靜置后，在冰凍離心機(jī)中離心搜集沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中，透析除丙酮。可得RZ值近于1的酶溶液。4.精制：將上步酶液適當(dāng)稀釋，滴加1mol/L硫酸鋅溶液，使酶液中鋅離子濃度為10 -3 mol/L，5 000r/min離心10min，得上清液。再將沉淀用少量蒸餾水洗滌，離心，洗液與清液合并，分裝于透析袋內(nèi)，用水透析除鹽，用微孔濾膜過濾，進(jìn)展真空冰凍枯燥(約得20mg)，產(chǎn)品呈米黃色纖維狀松軟物，HRP產(chǎn)品的RZ值可達(dá)3.0左右，置真空枯燥器中低溫保管。 二、 HRP的活力測定 1.活力測定：測定k4值的方法操作如下：取2個比色池(帶蓋，光程1cm)，按表參與反響物。對照樣品

7、反應(yīng)物磷酸鹽緩沖液2.91mL 2.90mL 愈創(chuàng)木酚溶液0.05mL 0.05mL 酶液0.0mL0.01mL酶液：將1mg蛋白/mL的酶液用磷酸鹽緩沖液稀釋10倍后運用。 加好反響物，搖勻，在 470nm讀出A470nm值，為t=0時的讀數(shù)。立刻加0.01mL40mmol/L過氧化氫溶液于2個比色池中，即刻搖勻并記時，每隔30s讀數(shù)1次，約5min，并記下實驗時的室溫。 將所測樣品的 A470nm值減去相應(yīng)時間對照的A470nm值，然后以A470nm值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)作圖，得不斷線，計算出平均每分鐘光吸收的添加，即求出x/t，按公式(8)求出k4值?；虿磺髃4值，而把在上述條件下，每

8、分鐘A470nm添加0.001所需酶量定為1個HRP活力單位。 2.蛋白質(zhì)含量的測定：將酶液適當(dāng)稀釋后，用Bradford法比色測定蛋白質(zhì)含量， 1.計算產(chǎn)品的RZ值及k4值。 2.計算產(chǎn)品的比活力。 1.鹽析法制備辣根過氧化物酶的原理是什么? 2.愈創(chuàng)木酚法測定辣根過氧化物酶的原理是什么? 3.測定辣根過氧化物酶的活力時，要求什么樣的pH和 溫度?能否需求先測定酶液的蛋白質(zhì)含量? 鳳凰平臺 fenghuangxuexiao/ 鳳凰平臺 twd36twu 一定不會少給的！耿正說：“倘假設(shè)如此，我們一定仔細(xì)履約！老板聽了很高興，又說：“還有，在我們酒店獻(xiàn)藝期間，他們每日上午來酒店的時間不可以晚于

9、午時初，午飯和晚飯酒店里免費提供，晚上分開酒店的時間通常不會晚于戌時中；假設(shè)晚于這個時間，酒店將現(xiàn)送數(shù)量不等的小費。耿正說：“謝謝，我們一定會在每日的午時初之前來酒店上班！老板再次依次看過眼前這舉止不俗的兄妹三人，非常有禮貌地問：“請問各位貴姓，怎樣稱謂??！耿正說：“免貴姓耿，我叫耿正，妹妹叫耿英，弟弟叫耿直。老板連聲說：“好名字，好名字??！耿英說：“請老板放心，我們一定會在貴酒店用心獻(xiàn)藝的！老板更高興了，揮手招呼周圍的伙計們：“他們都過來和這兄妹仨認(rèn)識一下吧，以后可要多照應(yīng)他們??！現(xiàn)實上，老板對原先經(jīng)常來該酒店獻(xiàn)藝的幾個藝人都不是非常稱心，因此并不曾與哪一個藝人簽署過任何方式的聘用契約。他們

10、只是隨意來隨意走，哪一個先到了就在這里做一次。后到的沒有位置了，就轉(zhuǎn)到其他的酒店另行招徠生意去了。至于酬金，雖然給得很夠意思，但也都只是以小費的方式當(dāng)日交給就是了。此外，酒店里也從來不為他們提供任何飯菜，只不過吩咐伙計們給以茶水照顧和禮貌接待而已。今日提出來要與耿正兄妹三人簽署聘用契約，不過是該老板的突發(fā)奇想而已。這個獨具慧眼的精明人看出來，這兄妹三人一定能給本人的酒店帶來豐厚的報答，因此不但想要留住他們，而且還要約束他們沒有時機(jī)再去其他的酒店展現(xiàn)人才。十天的試用期圓滿終了了，耿正兄妹三人組成的拉奏演藝說唱班獲得了空前的好效果，“盛元酒店的上座率日日添加！來這里吃飯的客人，一幫接著一幫在酒店門口排長隊等候。老板對耿正兄妹三人刮目相看，提出來情愿以每月三十兩紋銀的高薪，與他們簽署長期聘用契約，并慎重地征求耿正的意見，看他們兄妹三人究竟情愿與酒店簽署一份多長時間的契約。耿正和耿英商議后以為，在酒店獻(xiàn)藝期間除了每日需求自掏腰包吃簡單的早餐之外，再沒有其他消費了。因此，只需做滿了三個月以后，積累的銀子就足夠做一個小本的買賣了。雖然在這個大酒店獻(xiàn)藝確實是無本大利，但他們不想長期做這個。于是，耿正鄭重地對老板說：“多謝老板器重，我們想先簽署