基于VP1基因的小鵝瘟病毒PCR快速檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用

1、    基于vp1基因的小鵝瘟病毒pcr快速檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用    于新友+李天芝+沈志強(qiáng)摘要：根據(jù)genbank公布的小鵝瘟病毒vp1基因保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，建立了檢測(cè)小鵝瘟病毒pcr方法，并對(duì)其特異性、敏感性進(jìn)行了研究。該pcr方法對(duì)小鵝瘟病毒擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì)照毒株擴(kuò)增結(jié)果均為陰性;對(duì)小鵝瘟病毒檢測(cè)的靈敏性為1pg總dna量。以上結(jié)果表明，該pcr方法特異性強(qiáng)、敏感性高、簡(jiǎn)便、快速，可用于小鵝瘟的早期確診和病毒鑒定。關(guān)鍵詞：小鵝瘟病毒;pcr;檢測(cè)：q789      ：b     

2、0;：1673-1085（2015）03-0031-04小鵝瘟（gosling plague，gp）是由小鵝瘟病毒（gosling plague virus，gpv）所引起的雛鵝的一種急性或亞急性敗血性傳染病。病鵝臨床表現(xiàn)為下痢、腿癱瘓、精神萎靡、食欲廢絕，主要病理學(xué)特征為小腸中后段黏膜壞死、脫落，有纖維素性滲出物凝固形成臘腸狀栓子1。該病主要危害320日齡小鵝，特別是10日齡之內(nèi)的雛鵝更易感染，發(fā)病率和死亡率高達(dá)100%，且傳播速度快，是對(duì)養(yǎng)鵝業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重危害的一種重要傳染病2。1956年我國(guó)科研工作者首先報(bào)道了小鵝瘟這種疾病3，此后世界上許多國(guó)家都有該病的報(bào)道。目前，gpv診斷方法有病毒的分

3、離和鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)4、反向間接血凝試驗(yàn)5、免疫酶瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)6和pcr方法7等，但是上述方法均存在不同的缺點(diǎn)，或檢測(cè)靈敏度低，或檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，或操作復(fù)雜。近年來(lái)，發(fā)展pcr檢測(cè)方法具有檢測(cè)速度快、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的檢測(cè)。筆者通過(guò)不斷優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)小鵝瘟病毒pcr方法，為小鵝瘟的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了一種簡(jiǎn)便、快速、有效的方法。1  材料和方法1.1  病毒株與病料  小鵝瘟病毒、鵝副粘病毒、鵝病毒性肝炎病毒、鵝源鴨瘟病毒、鵝圓環(huán)病毒、鵝h9亞型禽流感病毒和鵝呼腸孤病毒由本實(shí)驗(yàn)室保存，臨床檢測(cè)病料為2014年采自

4、山東省各地小鵝場(chǎng)臨床診斷為gpv感染的小鵝的肝臟、脾臟等。1.2  工具酶及試劑盒  pmd18-t載體、premix tag、dl2000 marker購(gòu)自大連寶生物公司，axyprep體液病毒dna小量試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司，dna凝膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。1.3  pcr引物設(shè)計(jì)與合成  根據(jù)genbank中登錄的gpv基因序列（ay382889），應(yīng)用primer premier5.0軟件，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，擴(kuò)增gpv的vp1基因507bp部分片段。引物在生工生物工程（上海）股份有

5、限公司合成。上游引物：5-atgtgagaaagcaaactt-3，下游引物：5-ctatctataaagtcctgg-3。1.4  gpv基因組dna的提取  按axyprep體液病毒dna小量試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取gpv的dna，并提取其它幾種病毒的核酸。1.5  gpv vp1基因的pcr反應(yīng)條件的確立  以提取的gpv dna作為模板，進(jìn)行pcr反應(yīng)，擴(kuò)增vp1基因。在其它條件不變的情況下，對(duì)反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，分別采用42、44、46、48、50、52等6種不同的退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增;在其它條件不變的情況下，對(duì)反應(yīng)的引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，分別采用0.

6、2mol/l、0.4mol/l、0.6mol/l、0.8mol/l、1.0mol/l、1.2mol/l等6種不同引物濃度進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系保持為25l，pcr反應(yīng)的條件保持不變，為95預(yù)變性5min，95 30s、46 30s，72 30s ，共30個(gè)循環(huán)，最后72延伸10min。1.6  pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及鑒定  取5l pcr產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果。如果有目的條帶，則切下目的條帶，按照dna凝膠回收試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，回收目的片段vp1。將回收后的vp1與pmd18-t連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)dh5，37過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取

7、單菌落搖菌過(guò)夜，按質(zhì)粒提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)抽提培養(yǎng)菌液的質(zhì)粒，用建立的pcr方法檢測(cè)質(zhì)粒是否含有vp1基因。如果含有vp1基因，將提取的質(zhì)粒發(fā)送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與參照的gpv基因序列進(jìn)行基因相似性分析。1.7  特異性試驗(yàn)  分別提取小鵝瘟病毒、鵝副粘病毒、鵝病毒性肝炎病毒、鵝源鴨瘟病毒、鵝圓環(huán)病毒、鵝h9亞型禽流感病毒和鵝呼腸孤病毒等7種不同的病毒核酸作為模板，用已建立的pcr檢測(cè)方法進(jìn)行擴(kuò)增。1.8  敏感性試驗(yàn)  提取gpv基因組dna，用儀器測(cè)定含量，然后10倍系列稀釋?zhuān)筭pv基因組dna的含量分別為10ng

8、dna、1ng dna、100pg dna、10pg dna、1pg dna、0.1pg dna。分別將其作為模板，用建立的方法分別進(jìn)行pcr檢測(cè)擴(kuò)增，確定pcr檢測(cè)方法的敏感性。1.9  重復(fù)性試驗(yàn)  為了驗(yàn)證所建立pcr檢測(cè)方法的重復(fù)性，分別提取3批小鵝瘟陽(yáng)性病料、陰性病料以及6種陰性對(duì)照病毒如鵝副粘病毒、鵝病毒性肝炎病毒、鵝源鴨瘟病毒、鵝圓環(huán)病毒、鵝h9亞型禽流感病毒和鵝呼腸孤病毒的核酸作為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)。1.10  臨床樣品的檢測(cè)  提取臨床上送檢的25份gp疑似病料的基因組dna作為模板，用建立的pcr檢測(cè)方法擴(kuò)增檢測(cè)，并用生物學(xué)軟件

9、分析擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。endprint2  結(jié)果2.1  擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)  用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr產(chǎn)物，結(jié)果在507bp出現(xiàn)目的dna條帶，見(jiàn)圖1，和預(yù)期大小一致（預(yù)期大小為507bp）。2.2  特異性試驗(yàn)  利用所設(shè)計(jì)的引物及所確定的最佳反應(yīng)條件分別對(duì)小鵝瘟病毒、鵝副粘病毒、鵝病毒性肝炎病毒、鵝源鴨瘟病毒、鵝圓環(huán)病毒、鵝h9亞型禽流感病毒和鵝呼腸孤病毒進(jìn)行pcr擴(kuò)增。結(jié)果7個(gè)毒株中只有小鵝瘟病毒能擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，大小為507bp（預(yù)期507bp），而其它均未擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，見(jiàn)圖2。說(shuō)明本研究建立的方法特異性好。2.3 

10、0;敏感性試驗(yàn)  用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分別檢測(cè)5lpcr擴(kuò)增產(chǎn)物，5份樣品產(chǎn)物在507bp位置均有目的條帶，與預(yù)期一致;1份樣品產(chǎn)物無(wú)擴(kuò)增條帶。結(jié)果顯示，引物的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1pg dna，見(jiàn)圖3。2.4  重復(fù)性試驗(yàn)  重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，3批不同的病料的檢測(cè)結(jié)果相同，說(shuō)明建立的pcr檢測(cè)方法重復(fù)性好、可靠、穩(wěn)定。2.5  擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序  測(cè)序結(jié)果如下：                           &#

11、160;             atgtgagaaagcaaactttcctgaatttcaacctctgggagaaaattattgtgatgaacatgggtggtatgattgtgctatatgtaaagagttgaaaaatgaacttgcagaaattgagcatgtgtttgaacttgatgatgctgaaaatgaacaataaagatgactcaaagcagatatgtctacttttttagattcttttgaagagtggtatgaaactgcagccgcctcgtggcggaatctgaaagctggagcc

12、cctcacccaaaaccaaaccagcagactcagtctgtgtctccagccagagaacccgaacgaagagataataaccggggctttgtacttcctggctataagtatcttggccctggtaacggccttgataaagggccacccgttaataaggcggacagcgtcgcgcttgaacacgacaaggcctacgaccaacagcttaaagcgggagacaacccatatataaaattcaatcacgctgaccaggactttatagata將測(cè)序結(jié)果與參照的gpv基因序列進(jìn)行基因相似性分析，其同源性為100%。2.6  臨

13、床樣品的檢測(cè)  用建立的方法檢測(cè)的25份gp病料中，有7份結(jié)果呈陽(yáng)性。3  討論邵洪澤等8根據(jù)小鵝瘟病毒vp3基因設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，建立了用于檢測(cè)小鵝瘟病毒的pcr方法。該法每 5l樣品中獲得陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果中最小檢出量為2.5×10-1.58eld50小鵝瘟病毒量。本試驗(yàn)對(duì)genbank公布的gpv基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)gpv vp1基因相對(duì)比較保守，查找出其高度保守區(qū)域，參照genbank中登錄的gpv基因序列（ay382889），利用primer premier5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物，通過(guò)pcr擴(kuò)增出目的基因，連接到pmd18-t載體，送樣測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果與模板序列

14、進(jìn)行比對(duì)，其同源性為100%。對(duì)退火溫度優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)退火溫度值為46時(shí)，才能獲得較為理想的產(chǎn)物，即使相差2也不能獲得理想的試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，在引物濃度為0.21.2mol/l時(shí)不影響pcr反應(yīng)的擴(kuò)增效率，擴(kuò)增效率相對(duì)較高的引物濃度為0.6mol/l，增效率相對(duì)較低的引物濃度為1.2mol/l。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，引物的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1pg dna。本試驗(yàn)所建立的gpv pcr檢測(cè)方法能夠擴(kuò)增出507bp目的片段，而對(duì)常見(jiàn)的小鵝病病毒：如小鵝細(xì)小病毒、小鵝圓環(huán)病毒、鵝源鴨瘟病毒、小鵝肝炎病毒、小鵝h9亞型禽流感病毒和小鵝副粘病毒均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，證明本方法具有很好的特異性。用建立

15、的gpv pcr檢測(cè)方法，檢測(cè)20份小鵝瘟病料，檢出7份陽(yáng)性病料，因此，本試驗(yàn)所建立的方法為gp的流行病學(xué)調(diào)查和檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單、快速和有效的方法。參考文獻(xiàn)：1  calnek b w.禽病學(xué)m.10版.高福，蘇敬良，譯.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1999：988-995.2  盤(pán)磊，李福偉，李惠敏.小鵝瘟的生物學(xué)特性研究概況j.水禽世界，2007（2）：49-52.3  殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)m.2版.北京：科學(xué)出版社，1997：165-168.4  李新華.應(yīng)用斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)快速診斷小鵝瘟j.中國(guó)獸醫(yī)科技，1998，28（1）：13-18.5  徐為燕，周陽(yáng)生.小鵝瘟病毒反向間接血