番茄,茄子和辣椒枯萎病原菌分子鑒定及其致病性測定

1、茄科桔萎病原種群結(jié)構(gòu)及其致病性鑒定番茄、茄子和辣 /蟹型 ' / /椒扌古萎病原菌分子鑒定及其致病性.測崖aaaaaj 砂" 種比 茄科作物中的茄子、辣椒、番茄、馬鈴著等在蔬菜中占有重要地位,是百姓生活中必 七(帶格麗 不可少的蔬菜美食njgiu科作物萎焉病主要有3/+,分別為真菌性的枯萎病、黃萎病和細菌/鄉(xiāng) 性青枯病冋三，加i邪萎病，和黃晏病迖2種病宙在植株上衣現(xiàn)的癥狀只有很人和似性，.儀僅通過癥/ 狀犢難以區(qū)分，均表現(xiàn)為植株萎蔦，葉片變黃，維管束褐變等。，揚瑩瑩劉波二肖榮鳳i,朱育菁j福州大學生物科學與工程學院，福建福州 35ooo& 2、福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)隹物

2、資源研究所，福建福州* 350003吐m 爰：調(diào)查了福建省番茄、茄辣椒等2/中主耍茄科枯萎病的發(fā)生與癥狀，通過常觀分離，依據(jù).booth定 和分子鑒定相結(jié)合金的方法，對這齊種茄科作物i二采集的抄個菌株進行了病原曲種群:鑒定。結(jié)果農(nóng)明，少桃鐮刀菌 中有?5桃屬于尖抱鐮力菌,占總數(shù)的07.5%,為優(yōu)勢苗曲；。護為串珠鐮刀菌，另2牀為茄形鐮刀菌。x屮番茄、 與i-p和辣椒分離尖池歸丿j捕敎駅分別占歸丿j捕總敎的2.86險j1/13覽和用9/7準 進二步利川山。小,氏法則進行 ，.菌槐敦病性檢測，結(jié)果衣明尖抱鐮刀菌是本研究中兩采集的番茄、茄f典.辣椒谿科#物病株的病原菌,而?射珠 鐮刀菌和2林茄形鐮刀

3、菌均不造成寄主植物發(fā)病。帶格式的：字體：（中文）仿 宋一gb2312,小四，（國際 times new roman甬離的i.甬格式的縮進：首行縮進：2字 符帶格式的77t 7t7 ml 1次鍵詞:浙科：枯萎病；份子蠱定:致病怯一-一 帶格式的i 5 1沖圖分類號：s3,帶格式的i 6podulation comdosition pathogen molecular identification and pathogenicity帶格式的 . 71testing pathogen iderhifigation of fusarium wiltyfrom-t tomatoes, eggplants

4、 and peppershe-setehaeeae-gms”帶格式的：字體：四號yang yingying1,2, liu bo'： xiao rongfcng2, zhu yujing2(1 college of biological sciences and technology , fuzhou university , fuzhou fujian 350008 ; 2.agricultural bio resources research institute , fujian academy of agricultural sciences , fuzhou fujian350

5、003,)abstract: the occurrence characteristics and symptoms of fusarium wilt from the solanaceae crops were investigated and the symptomatic plants fi'oin tomatoes, eggplants and peppers were collected in fujian province. forty isolates were obtained and identified by booths method and molecular

6、identification method. the results showed that thirty-five isolates were fusarium oxysproum which was r 田qin p珀hegen and the rate was 87.5 %, three isolates were e monilifonne and two isolates were e solani. the-oeeuffenee frtee匸咼o：呼甲粉"丹4煦祜存8卜£01卅讎06£郎由疏&也出卩6卩卩15-¥&&9

7、2：86-險744亠總和 89：47-匸and, the results of pathogenicity testing confirmed that f. oxysproum were pathogen which caused wilt disease of the solanaceae wilt, however, three isolates of e monilifonne and two isolates of e solani did not caused帶格式的i.81帶格式的the wilt symptoms of host.keywords: solanaceae cro

8、ps; fusariumlccubr identification; pathogenicity帶格式的：77帶格式的：字體：（國際）times new roman金世界茄科植物大細心0屈3000種，分布范圍廣泛，遍及溫帶、熱帶地區(qū)；我國有24屈105懣金項目：國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)科研專項（200903049，福建省屬公益項目（2010r10206）,福建省杰出青年科學基金（2009j06010） 作者簡介：楊瑩瑩（1987年），女.在讀碩士。研究方向：應用微生物。巧11訊作者：劉波.e-mail: tzliubo帶格式的：縮進：首行縮進：0字 符：帶格土的1g帶格式的：字體：六號洪中由尖砲鐮

9、刀菌(fizsafiimi oxysporimi)引起的枯萎病，在南茅地區(qū)對茄科作物危害最大，r帶格芟的防治閑難,造成重大經(jīng)濟損失啓番茄枯萎病口本吐紀初發(fā)現(xiàn)以來，在世界上尖部緲査國家均育 z; 發(fā)生，該癮在我國l發(fā)癖牛嚴重，輕則減產(chǎn)10 %.以上，的種植工重則絕收，輕則減產(chǎn)10咒以上, 1 給番茄生產(chǎn)帶來巨大威脅巴°王全華.等號鑒足對了黑龍江省、部分地區(qū)采集的20個番茄枯萎病菌株進!合侵染于網(wǎng)，2014)。李園等對4匸慶甫平谷地徑儺勺垂 茹水士楽:鑿 d1:"形 j.學觀察與分嚴物學軫.】.77 13行鑒定，結(jié)果表期20傘供i船株，均曲為尖抱鐮丿j歯番茄&化型1號4

10、.理小種浮園翌®研究/ 表明，北京市平谷地區(qū)的帝茄枯萎病上孌山尖他鐮刀崗侵染所致，同時也可能存在出珠鐮刀菌的復、帶格式的'帶格式的：下劃線，字體顏色：裁= 色帶格式的. 15帶誌的t7161帶格式的.171批注arli1: it以“公頃”為規(guī)范 面積單位。帶格式的181帶格式的.斷鑒定，結(jié)果表明謀地區(qū)林姿病主要由尖袍鐮丿j荊侵染所斑-另如j冉能存鉀珠鐮沏的#合侵 ' 染(于園，234斗辣椒枯菱病h 1995年發(fā)現(xiàn)以來，在我國多省相繼發(fā)生警屮回.。，黃素芳等掣對福 建漳州地區(qū)的辣椒枯萎病進行/調(diào)查，確定病原菌為尖他鐮丿j菌。梁建根等'腳i分離白山兩太谷地i沌的m

11、齢儀病病菌的形態(tài)、用養(yǎng)形狀及致病性的研究，初步確足j'山西太谷地區(qū)的辣椒枯萎病該 病是山尖抱鐮刀菌莪蔦f化型所致。黃立志等丁研究表明，衣林地區(qū)采集分離的辣椒枯菱病病原菌 為尖抱鐮刀菌忙菊毛。茄于枯菱炳炳原嵐的報道相對較少,陳飪輝等巴從北京部分地區(qū)萎蔦的茄子 植株上分離到兩種類型病原菌，分別為茄子枯萎病菌(f oxysporum)和黃萎病vr( verticillium dahliae) 114,o.鑒jya菌性的枯萎病趴黃萎癮在癥狀上jv仃很人的相似性，單從癥狀難以區(qū)分，囚此，對山真一一快帶格式的 市菌引起的茄科植株萎鳶病害，需通過病原菌分離鑒定，特別利用分子鑒定并結(jié)合生物測定進行快速

12、/；準確鑒定。丨|前國內(nèi)對番茄、茄子和辣椒這3種茄科作物枯菱病的調(diào)杳打鑒定研究較少，因此，杏z研究通刪對福建肖多地的茄科真菌性萎蔦植株調(diào)住采樣、病原菌分離鑒定及致病性測淀，旨在了解造成福建省茄科作物萎蔦的真菌病害的病原菌，為病害的防治提供依據(jù)。，參考文獻.屮g般病特況介紹.,_對病害的硏-筠、容則址列舉例明呈不足廠l，研究方法， j.1沛科作物枯萎病害調(diào)查及其發(fā)病癥伏，調(diào)任方法:2009毎10月至2010年6月期間，調(diào)查福建省閩侯鴻尾、廈門同安、漳州平和等茄 科作物主產(chǎn)區(qū)種植番茄、茄子和辣椒實生苗枯萎病的發(fā)生悄況與癥狀，并采集病株進行病原菌的分 離鑒矩托訃算發(fā)病餐番茄、茄子和辣椒的調(diào)查區(qū)面積分

13、別約為處圧j.3公壩、氓0.3公t必/ 公頃闔。廠采樣方法：.從種植番茄、茄子、辣椒iii間隨和呉集發(fā)生枯萎癥狀的3,種作物植株各10,株。2菌株的分離與鑒定，采用常規(guī)的組織分離法進行病菌的分離*纓。切取植株莖基部變色/i勺木質(zhì)部，將病組織切成0.5x 0.3 cm大小的薄片-，經(jīng)75 %酒粕處理2 s,再用0.1 %升汞處理2-3 min后，用無菌水清洗3遍， .置于馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(psa)上培養(yǎng)，每皿放5片病組織，25 ± 1.5 °c培養(yǎng)。隨機挑選1020(帶格式的. 201個組織塊上的分離物進行單砲分離，分離物純化培養(yǎng)后采用80°c甘油冷凍保存。病原

14、鑒定依據(jù)booth /(1971)的鑒定方法：單砲分離純培養(yǎng)物，接在psa培養(yǎng)基上，25 °c培養(yǎng)4 d,測定單抱菌落的生長速度，取培養(yǎng)7 d的培養(yǎng)物進行抱子形態(tài)及產(chǎn)抱細胞觀察，測量各類型分生他子長度與寬度。一帶格式的 u121j.3，菌株的分子鑒定鐮刀菌基因組dna的提取參照曹文波等1"回方法，15() mg研磨的菌絲樣品，加入800 pl尿素提取緩沖液（7 mol/l urea, 50 mmol / l tris-hcl ph 8.0, 62.5 mmol/lnacl）和 160pl20%sds 搖勻，12000 r / min離心5 min,取上涓液相同轉(zhuǎn)速再離心5

15、min；將上消液移入到新離心管中,加 入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25/24/1, v/v/v）溶液，用力震蕩上下顛倒混勻,12000r/min 離心5 min：取上淸液到另一新離心管中并加入等體積的異丙醉和1 /10體枳的3 mol/lnaac溶液（ph 5.2）, -20 °c靜置20 min后離心5 min,棄上清，倒置使管壁液體流盡；用70 %的乙酹漂洗dna 沉淀兩次,離心1 min,棄上清,室溫風干揮發(fā)乙醇。加入50 ul滅菌ddh2o溶解，放置4 c冰箱 過夜溶解,-20 °c保存。鐮丿j菌屬的鑒定：引物 fu3 / fu4 序列舊ggagm4gaagp蟲g

16、aaa貝2$雖訊3, 40亠曲44>且田仔各 昭曲，甜地9氐8吐，pn7v模板 片b pgv擴增程庫： 9心獨變性變性30亦55 °c退火30 s, 72毛延伸-60 g,共35，個循環(huán)：最肩72 °c延伸 40血仏尖抱鐮刀菌種的鑒定：引物f0f1 / f0r1序列弋嚴acataccacttgttgcctcg / cgccaatcaatttgaggaacg<, pcr反應體系（20 gl）： 2.5 u / pl taq嗨0.2 gl, 10 x buller 2 gl, 2.5 mmdntp 0.4 pl, 100 ym primer各 1 pl, ddh2o

17、 14.4 pl, dna模板 1叫 pcr擴增程序:94 °c 預變性60s； 94 °c變性60s, 58 °c復性30s, 72 °c延伸60s,共25個循環(huán);72 °c最終延伸7min。鐮）菌 rdna-its 區(qū)測序分析：引物 its4 / its5 序列 tcctccgcttattgatatgc3/ ggaagtaaaagtcgtaac aaggo pcr反應體系（25 pl）： 2.5 u / pltaq酚0.25 gl, 10 x buffer 2.5 pl, 2.5 mm dntp0.2 pl, 100 pm primer各p

18、l, ddh2o 19.05 gl, dna模板 1 pl。pcr擴增程序: 94 °c預變性5 min； 94 °c變性1 min, 55 °c退火1 min, 72 °c延伸1 min,共30個循環(huán);最后72 °c延伸 10 min。pcr產(chǎn)物用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察。將回收的i的片斷送 交上海生工生物匚程技術服務有限公司c將測得的序列通過國際jt.聯(lián)網(wǎng)（jittp:/） 進行blast檢索，并下載和關序列，用clustal w軟件進行比對后進行手工校止。系統(tǒng)發(fā)育樹分析

19、采用 軟件mega 4中的鄰近相鄰法進行，利用bootstrap（1000次重復）檢驗各分支的置信度。應川dn am an version 5.220軟件對尖砲鐮刀菌、出珠鐮丿jl肖和茄形鐮丿jl肖3株菌株的its區(qū)序列進行筋重比較分析丄。 丄4，菌株的致病性測定根據(jù)koch氏法則進行分離物的回接測定。隨機挑選番茄、茄子和辣椒3種作物上分離到的尖他 鐮刀菌菌株各5株及從同一作物上分離的鐮刀菌屬的其他菌株，擴人培養(yǎng)后分別配成濃度為1.0 x 106 efu / ml砲子懸浮液，采用浸根法接種相對應的寄主健康植株，植株大小為地上部株尚約為15 cm的 健康植株，浸根時間為30 min,以清水作對照

20、，各菌株處理30棵，觀察發(fā)病情況，重新分離發(fā)病株 的病原物。2，結(jié)果與分析，2.1兩科作物枯萎病害調(diào)查及其發(fā)病癥狀帶格式的：沱義網(wǎng)格后自動調(diào)整 右縮進，調(diào)整中文9西文文？的間 ，距，調(diào)整中文與數(shù)字的間距帶格式的（域代碼已更改帶格式的讎式的：字體:（中文）黑體，非翳式的：字體:（中文）黑體，非帶格式的：字體：（中文）黑體，非 加粗帶格式的：字體：（中文）黑體，非 加粗驚式的:字體:（中文）黑體，非翳式的：字體:（中文）黑體，非麟式的：字體：（中文）黑體非帶格式的：字體：（中文）黑體，非 加粗批注arli2:維管束？帶格式的帶格式的帶格式的對蒂茄、茄子和辣椒3種主要茄科作物的枯萎病害調(diào)查表明，癥狀

21、的共同點表現(xiàn)為植株一般在 花期至結(jié)果期開始發(fā)摘，發(fā)病初期頂部葉片似缺水萎蔦，早晚尚能恢復，后期萎蔦加重下部葉片出 現(xiàn)黃化（圖iac）。該病傳染性強，但病程較為緩慢，一般需好兒周整株枯死。發(fā)病中后期的植株 根莖部會出現(xiàn)褐變，莖部皮層開裂11縱切后發(fā)現(xiàn)維束管|組織褐變莖部皮層開裂且縱切汗發(fā)觀維管束 組織褐變（圖1 df）。不同點表現(xiàn)為茄子打辣椒植株一旦受枯萎病侵染，35周間植株會立即死亡； 而番茄植株受枯萎病，危害的病程較長，口發(fā)病過程屮植株仍可正常開花結(jié)果，但是產(chǎn)量會冇大帕度 的減產(chǎn)。番茄、茄子和辣椒3種作物的,田間發(fā)病率分別為15.6%、25.5%和10.8 %。番茄、茄子和辣椒枯萎病癥慎w分

22、別為田間番茄.茄子和辣椒枯萎病植株癥狀：at分別為番茄、茄子和辣椒枯萎病植株的根莖部癥狀（帶格巫格22 茄科作物枯萎病原菌的分離與形態(tài)學鑒定i從番茄、茄子和辣椒上獲得的分離物，經(jīng)單砲分離保存。_決4種作物上備挑若i個分離物通過 平板培養(yǎng)與顯微觀察，結(jié)果表明,所分離的菌株在psa培養(yǎng)基上生長4 d的菌落平均直徑為43.3 ±2 mm,菌絲白色至淡紫色，棉絮狀儡2）。小型分牛-抱了數(shù)量多，呈橢圓形或卵圓形，大小17.6（9.5-23.9） x2.5 （2.03.0） pm；大梨分生抱子鐮刀型或紡錘型，稍彎，有足胞，14個隔膜，多為3個隔膜, 大小為25.7 （17.533.5） x 2.

23、5 （2.13.5）依據(jù)booth （1971）的鑒定方法，確定這些分離物為鐮刀菌（fusarium spp.）。.（帶格式的：字體（屮文）黑體帶格式的：字體（中文）黑體帶格式的：字體（中文）黑體帶格式的：字體（中文）黑體"帶格式的：字體 五（中文）黑體，小帶格式的：字體：（中文）黑體帶格式的：字體：（中文）黑體 ： 帶格去的：字體：（中文）黑體 帶格去的：字體：（中文）黑體，小' 五帶格式的：字體:（屮文）黑體希格式的：字體:（屮文）黑體附2鐮丿j菌的菌蒂形態(tài)注：毗番茄b：茄了 3棘椒帶格式的：字體：（中文）黑體，非 加和帶格式的字體：（屮文）黑體，非 加粗帶格式的：字體：

24、（中文）黑依非 加粗批注arli3:屬于方法內(nèi)容。帶格式的（帶格式表格帶格我的（帶格式的縮進：首行縮進：0虧= 符帶格式的：字體：（中文）黑體，非 加粗甬格壬的77 應7臥人小型分半絶實纟殳箭頭為人型分半抱幾 虛線箭頭為小型分牛砲c 產(chǎn)抱細胞（剋植）©詢絲23，茄科作物枯萎病病原菌的分子鑒定對從不同地區(qū)采集的40株來門番茄、茄了和辣椒菌株，利用尖砲鐮刀菌特界性引物fof1 / for1 進行了鑒定（表1）。結(jié)果表明，40株鐮刀菌屮有35株屈丁尖抱鐮刀斷 占總數(shù)的87.5%。4 _3 _21 一 m二三三一一5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

25、20 21 22 23彳帶格式的.2311/帶格式的24 1（帶格式的（帶格式的.2511i帶格式的：字體：六號帶格式的：縮進：首行縮進：1.38字符（帶格式表格麗格式的=26t帶格式的=27 1帶格式的二t 2叮 1帶格式的t77 291 1-帶格式的t7 301 1帶格式的t3iyl帶格式的t77 321 1帶格式的二33譏甫株名稱”物fof1 /for1的慕定結(jié)果afjat-9202番茄決他鐮刀閥fjat-9203番茄徘尖抱鐮刀麼fjat-9204番加i決他錘刀1禮fja1.9205番茄於他鋒刀直fjat-9206決他錢刀【禮ejat-9207尖他鐮刀就fjat-9208番茄關他錢刀【此

26、表2郡分菌株縱尖砲鐮刀菌種特異性引物的鑒定結(jié)果m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23soobpm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 18 1920 21 22 23圖卩卻份菌株pna,的特異引物jof1 /for13廣增結(jié)果八上圖於周去了, ”罔的已去掉匕piarkc.廠忑 分離自番茄的菌株fjat920&、戸人匸92（）3” ；fjat920t、fjat920* 戸人920 fjat.9207序口 / fiat-920&： & ;叫 分離

27、自茄子的菌株戸八丁-9241fjat924q、戸八t924 fjat924冬 戸八丁924丄、fjat9246護口 _ ；. fjat924£；工2# 分離自辣椒的菌株fjat3742、目皿375： fjat375q、fjat384： fjat384 jjat3844不1fjat-3845, 22：陽性對照23:陰性對照/.fjat-9209番茄決他鐮刀閥ejat-9210番茄伏他獲刀閥ejat-9211潯茄決他鎌刀苗厲fjat-9212番茄fja3213fjat-92i4番茄決他毎刀此fjat4215番笳fjat9241茄f川:尖抱鐮刀直fjat-9242茄子決他鐐刀曲卜 jat9

28、243茄子伏他鐮刀閥eja1-9244茄子決他聯(lián)刀菌.fjat9245茄子井尖抱灤刀閱fjaf9246金他錘刀昭，fjat-9247茄子謎鋒刀嵐1jat-3749尖他鐮刀此fjat3752辣椒非尖抱鐮刀阻fjat-3756辣椒非尖抱鐮刀直fjaf3842辣俶關怨綾刀應fjat3843辣椒ejat-3844決他聯(lián)刀菌.fjat-3845辣叔fjat-3s46辣椒金他錘刀昭，fjat3847盤燧刀嵐ejat-9083辣椒伏他鋒刀鳳1jat-9084辣俶尖他篠刀應fjat-9085辣椒決他麻刀應fjat-9086辣俶fjat4087fjat-9088辣俶決世鐮刀閥fjat-9089辣椒關他縑刀菌.e

29、ja1-9090辣椒金他錘刀昭，fja3091灰他鋒刀鳳fjat-9092辣秋尖他錘刀菌.對5株經(jīng)引物fof1 /f0r1擴增表現(xiàn)為陰性的菌株，采用真菌通用引物its4/its5擴增，陽性條 貫* 帶大小為600700 bp左右的片段。將擴増產(chǎn)物送至上海生工測序分析，所得序列登錄genbank進行1l blast分析，序列測定結(jié)果顯示序列中包含部分i8s rrna jtsl5.8s rrna jts2及部份28s rrnaow 有2個菌株基因序列與茄形鐮刀菌的rdna同源性達99 %以上、3個菌株與出珠鐮刀菌的rdna同源性 高達99 %以上。根據(jù)rcnskc landcwccrt等認為翼菌通

30、過its區(qū)域比對，序列相似性99%,鑒別為相 ' 同和序列相似性95 %且99%,鑒別為相同屬；序列相似性95%,鑒別為相同科。進一步下載數(shù)據(jù)庫中臨近屬或種同源性的its序列與其對位排列后,利用mega4軟件的鄰近相鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)帶格式的34ji帶格式的35帶格式的. 36（帶格式的. 371（帶格式的.7. 3811（帶格式的tt. 3911（帶格式的. 40（帶格式的. 41 1（帶格式的. 42 1帶格式的. 43帶格式的. 44 1帶格式的. 45 1帶格式的t. m6j l帶格式的二們n帶格式的48（帶格式的49丁i帶格式的t. l50j1i帶格式的t. 51i帶格式的7t.

31、 152帶格式的53丁帶格式的54丁i帶格式的t. ?55 1帶格式的t. 561帶格式的t. ?57j 1j帶格式的7t. 58 1j帶格式的777759i帶格式的7t. 601i帶格式的61 1i帶格式的7t. 621i帶格式的77. 63_o格式的tt 64?1冷格式的t7t 651 1i帶格式的t7t 6611（帶格式的,'j0 m帶格式的：縮進：首行縮進育樹，（bootstrap值大于50被顯示，樹枝上方數(shù)值為bootstrap值）。從系統(tǒng)發(fā)育樹中町以看出，菌株 fjat-3752、fjat-3756和fjat-9203與串珠鐮刀菌（f. moniliforme）的序列以99

32、 %的置信度聚在一 支上，親緣關系最近，結(jié)合它們之間的同源性大t99 %,可確定這3株菌為出珠鐮刀菌（圖5）。菌一 株fjat924"iifjat9245與gcnbank數(shù)據(jù)庫中茄形鐮刀菌（e solani）以9984 %的置倍度聚在支 上，因此確雄這2株菌為茄形鐮刀菌（圖5）。將串珠鐮刀菌和茄形鐮刀菌序列磁錄到genbank,獲得 序列號分別為jq277273 （fjat-9203） . jq277274 （fjat-3752）、jq277275 （fjat-3756）、jq277276(fjat-9241)、jq277277 (fjat-9245)。住格式的“帶格式的：首行縮進：

33、0字符，定 義網(wǎng)格汗不調(diào)整右縮進，不訓整 西文與中文z間的空格，不訓整 中文和數(shù)字之間的空格fjat 3752gg eu717682.1'fjat 3756 竺 fjat9203fusarium moniliforme972829eu839370.1f j at.9207fjat9206fjat-9208fuiarium oxysporumr fjat 9245fjat9241eu625405.1fusarium solanihq008678.1 fuiarlum graminearum周2串珠鐮刀菌和茄形鐮刀菌基于jis序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)肓樹，山于its1和its2這兩個區(qū)間進化較

34、快，含信息量豐富，故分別選取尖鞄鐮刀菌、串珠鐮刀菌 和茄形鐮刀菌3株菌株its1和its2兩個區(qū)間分析，應用dnaman version 5.220軟側(cè)算its1 和its2兩個區(qū)間.gc含量，具體見表1。從表中可以看出3種菌株的its2區(qū)序列長度均長于its1, 不同菌株its2區(qū)序列長度變界較小，從i63bp167bp,而區(qū)序列長度變并較大,從i37bp 151bpa its1區(qū)間gc含量在36.6 %52.3 %z間變化，its2區(qū)間gc含量在60.6 %73.1 %z間變 化，its2區(qū)間的gc含量高于its1, rits2區(qū)間的gc含最高達60 %以上。帶格選的字體：（中文）黑體 帶

35、格式的字體：（中文）黑體1 帶格丟的字體：（中文）黑體 帶格式的：字體：（中文）黑體 ; i我格式的：字體：（中文）黑體 我格式的：字體：（中文）黑體 ! 弟格式的3格式的:帶格式的表3腫供試菌株ts 1 和jts2j?列分機滬0菌株編號itsiits2長度（bp）gc含雖<%>k度（bp>gc含呈(%)1fjat-9202尖他鐮刀菌13749.716361.32fjat-9203串珠銖刀國14636.616460.6<3fjat-9241茄形鐮刀菌15152.316773.14應用dnaman version 軟件對尖砲鐮刀菌、串珠鐮刀菌和茄形鐮刀菌3株

36、菌株的its區(qū) 序列進行多垂比較分析，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，3種菌株的its區(qū)序列差異主要在于60bp 200bp和360bp600bp區(qū)間的差異,所對應的分別為its1和its2區(qū)間，如圖6所示（圖中陰影部 分表示在該位點的相同堿叢）。其中尖砲鐮刀菌與串珠鐮刀菌的序列差異為2 %,尖砲鐮刀菌與茄形 鐮刀菌的序列差界為11 %,串珠鐮刀菌與茄形鐮刀菌的序列差異達113%。0102030405060708090100110)帶格式的：字體：（中文）黑體 帝格耳的字體：（中文）黑體 ； 帶格匹的字體：（中文）黑體 : «式的：字體：（中文）黑體 ：式的：字體：（中文）黑體 : 直的i

37、字體：（中文）黑體 ; 帶格式的字體：（中文）黑體 帶格式的字體：（中文）黑體 帶格式的字體：六號帶格式的縮進：左側(cè)：-0.96字' 符，懸掛縮進：0晁 字符”帶格衣的:縮進：左側(cè)：-0.96字 符，懸拴縮進：0.96字符1 ggjulgtjuuuagtcgtaaclaggtctccgttggtgaaccagcggagggatcattaccgagtt tacjulctcccaaacccctgtgucrtaccact. tgttgcctcggcgg2 > tgg1agtjlula gtcgtaacaaggtctccgttggtgaaccagcggagggatcattaccgagtt

38、 tacjulctccc wlcccctctgucatacc act. tgttgcctcggcgg3 agtajulaaa tcgtaacaaggtctccgttcgtgaaccagcggagggatcattaccgagmtacaactcatcjulccc.tgtgucjltacctmacgttccctcggcgc110120130140150160170180190200210220聘格勰能進烏洱符2字1 cggatcigcccgctcccggtjlaaacgggacggccc. gccagaggacccctaaactctgtttctata tgtaacnctgaotulaccitlaat

39、ljultcimctttcaacaac2 cggltcigcccgctcccggtiaaacgggacggccc. gccagaggacccctuactctgectata tgtjlacttctglgtuaiccatljlitiaitciiajlctttcaacaac3 cgcgaacagacggccccg.taacacgggccgcccccgccagaggaccccctaactctgtttctataatgtttcttctgagt1ucugc11ataxjittaaaactttcaacaac2202302402502602702802903003103203301 ocggatctcttgct

40、tctggcatcgatcaagaacgcagcaaaatccgataagtaatgtciattgcagaattcagtgjutcatccjuitctttcucgcacattgcgcccgccag2 julc<watctctt<wttctg<x：atcgatguguc<kagcaaaatgcgata*otaatotgutt<k：aguttcagtgmtcatcg11tctttgajicgcacattgcgcccgccag3 ucggatctcttggctctggcatcgatgjuigaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgjiattgcagutt

41、cagtoutcatcgutctttgucgcacattgcgcccgccagttgacctcggatckttgacctcgg1tca.萌株名稱尖砲鐮刀鬲引物-cfof14for1）it5庫創(chuàng)比對結(jié)巣需定結(jié)果fttqtt豐，尖抱鐮門繭til 7<jh=r *晾八 vetfjapq2o4til 7<jh+< j ix ktt z jfmt-q2o5條卅itil 7jmeja49206於站fu尖他鐮刀荊rja49207番卅i pt農(nóng)打尖池鐮刀菌n i塵他懈ti舖j 匸/ j "1番時irij -vm.尖他鐮力菌fjat9210需粘ut77tt豐vmm齊門舖j u片t丿j

42、fjat9211番雷 rfttjn牛肅夠h詁v j lz./ j |eja2»242番雷 rfttjn牛肅夠h詁v j lz./ j |wat-q245jliuiuj "tt尖黠mi h j丨li > j叫waq244jliuiuj "tt尖黠mij ci ww z j rpr誓姑rfi fxx豐牛佝瞬71葡wap-9244-ju; fw j=豐尖砲鐐門繭/jll jj 12l k-t. 7 jfjapq244a； f /jll jj 12l k-t. 7 jdh j=帶格式的字體：（中文）黑體j帶格式的字體：（中文）黑體j帶格式的字體：（中文）黑體j帶格提

43、的字體：（中文）黑體（帶格式的字體：（屮文）黑體j帶格丘的字體：（屮文）黑體j帶格式的字體：（中文）黑體帶格式的字體：（中文）黑體帶格式的字體：（中文）黑體j帶格式的字體：（中文）黑體j帶格式的字體：（中文）黑體j柿格式的字體：（中文）黑體帶格式的字體：（中文）黑體j帶格式的字體：（中文）黑體）j帶格式的字體：（中文）黑體）j帶格式的字體：（中文）黑體j帶格式的字體：（中文）黑體j帶格式的字體：（中文）黑體j帶格式的字體：（中文）黑體j帶格式的字體：（中文）黑體j帶格式的字體：（中文）黑體（帶格式的字體：（屮文）黑體帶格式的字體：（屮文）黑體帶格式的字體：（屮文）黑體（帶格式的字體：（中文）黑

44、體（帶格式的字體：（中文）黑體i帶格式的字體：（中文）黑體（帶格式的字體：（中文）黑體（帶格式的（帶格式表格i帶格式的i帶格式的j帶格式的i帶格式的i帶格式的i帶格式的i帶格式的i帶格式的i帶格式的（需格式血（帶格式的（帶格式的帶格式的帶格式的.帶格式的帶格式的帶格式的330340350360370380390400410420430440cagtattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcaagccctcgggtttogtgttgcggatcggcgag.cccttgcggcaa.gccgxcccgaaatctcagtattctggcgggcatgcct

45、gttcgagcgtcatttcaaccctca入gccctcgggtttoctcttgawatcggcgag. .cccttgcggcaa. .gccggccccgaaatctcagtattctggcgcgcatgcctgttcgagcgtcattacaaccctcagccccccgggcctgccgttggggatcggcwaagccccctgcgggcacaacgccgtcccccaaatac440450460470480490500510520530540550.tctagtggcggtctcgctgcagcctccattgcgtagtagtwla.tctigtggcggtctcgct

46、gcagcctccjlttgcgtagtlgtauac .tacagtggcggtcccgccgcagcttccittgcgtagtigctucacctcgcuctggigigcggcgcggccacgccgtuucacccucttctgutgttgacctcgutcji550560570580590600610620630640650660周$ 3評供試菌株間丿ts序列的多重比疚,（序列為尖抱鐐刀菌fjat-920彳 序列2為串珠鐮刀菌j-jat-9203r序列？力茄形鐮刀菌/jat-9241a） a，注：陰影部分表示？種菌株在該位點的堿基完全相同：二二表示該位點堿基缺先對從不同地區(qū)釆集的4

47、0株來口番茄、茄了和辣椒的枯.頻病腺飆行j分了鑒忑（表1）-利 用鐮丿j菌fu3 /fm特開性引物鑒定的結(jié)果表明，岳有的#株均為獲得一條大小約畑仙左右皐條 帶l證-明供試蒂株均為鐮卻菌一溜4-ah-進-涉科出尖砲鐮井菌特異性弓沏fof1 / for鑒"，結(jié) 果表明，40株鐮力菌中有鋅株屬丁尖砲鐮刀菌，片總數(shù)的石為優(yōu)勢翩此其屮番茄、茄了 和辣椒上分離尖他鐮丿j菌數(shù)帛分別山鐮丿j曲總數(shù)的92$6%、7亠44%和89/4%°分了舉加結(jié)果農(nóng)明, 衣番茄枯萎病原小除了仃尖他鐮丿j菌外，還分離到串珠鐮丿j菌，山比例為1-/-1血亦茄了枯萎病原小 除了有尖砲鐮丿j繭外，還分離到茄形鐮刀繭

48、，占比例為247。在煉椒枯萎牯原屮除了令尖砲鐮丿j 外，還分離到小珠鐮刀肅，占比例為2/17（表1兒表2部分菌株分/鑒定結(jié)果fj at 9206豐fj a匸9247內(nèi)at 3加9 y ，小” j pi*出硃務h崗 y ，小” j pi*丿用it人丿用it人軸£忡丿八、n人尖砲鐮丿j菌fjat-3845豐豐r 尖抱鐮刀菌豐豐內(nèi)a"胸公創(chuàng)価/i |?ci內(nèi)af昭5袖陽7rl牛的無77舖1 li w- / j袖陽7rl牛的無77舖1 li w- / jm±l¥7/7* tja豐m±l¥7/7* tja豐f j atqorqfjap9o9o豐

49、pj at 9091w7ixj2u2a41i-jj4xilz w 7 j 11fjapw2+尖他鐮刀菌備注：+：陽性反應:陰性反應、帶格式的'帶格式的、帶格式的帶格式的'帶格式的；賈格麺：馬格亟帶格匹的i帶格式的；帶格式的（帶格式的帶格式的一f帶格式的馬格亟帶格或的 曲格式的'帶格式的2也5科作物枯萎病，病，原菌的致病性測定接種番茄尖抱鐮刀菌的植株約15 d開始發(fā)病，茄子尖抱鐮刀菌的植株約25 d開始發(fā)病，辣椒尖 砲鐮刀菌的植株約17 d開始發(fā)病。癥狀均表現(xiàn)為邊緣葉片出現(xiàn)輕微的黃化萎著，根部褐變，莖部縱 切可見維管束組織變褐色，與山間口然發(fā)病植株的癥狀相似。接種后第35

50、天的觀察結(jié)果表明，菌株 間存在致病性分化,番茄尖抱鐮刀菌中有3株發(fā)病率達100 %,另2株為90%：茄子尖抱鐮刀菌中 有2株發(fā)病率為100%,另3株達93 %以上；辣椒尖他鐮刀菌中有4株發(fā)摘率達100%,另一株為 83.33%。而3株串珠鐮刀菌、2株茄形鐮刀菌及清水對照所處理的植株，均表現(xiàn)正常。接種尖他鐮 刀菌的植株莖部均可再次分離到相應的分離物，經(jīng)分子鑒定為尖砲鐮刀菌;而接種串珠鐮刀菌、« 形鐮刀.屛奐淸水的就株的峑部均來分離到所接種分離物茄形鐮刀菌及淸水的植株的笙部均未分離到 所接種病廉物。進一步確認尖抱鐮刀菌是引起所供試茄科植物的病原菌。帶格式的（域代碼已更改()o o o o

51、 o o2 0 8 6 4 212345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 ck菌株編號jsj沛科作物枯萎病原菌的致病性測定結(jié)果，綢號丄二15,為尖抱鍍刀菌，對應的菌株分別為afjat-920.jjat-920.afjat-921 jjat-921 lr jjat-9212 jjat-924.帶格式的68帶格式的69/.帶格式的/ j帶格式的1（帶格式的、一 £（帶格式的：字體：小四）:帶格式的：縮進：首行縮進：0.49 字符，泄義網(wǎng)格后不訓整右縮進， 代 行距:最小值0磅,不對齊到網(wǎng)格直罷 帶格式的：字體：小五，字體顏色： 叭自動設迓屮 m 帶格式的：縮進：首行縮進：o49 字符.左0.99字符定義網(wǎng)格后 不調(diào)整右縮進，行距：最小色0磅 霞不對齊到網(wǎng)格i機叮帶格式的87帶格式的：不對齊到網(wǎng)格' v；a帶格式的：字體：小五，字體顏色： net自動設置¥«；（帶格式的841:帶格式的：縮進：首行縮進：0. 49 射：字符，左099字符，定義網(wǎng)格后 不調(diào)整右縮進，行距：垠小值0磅 書”，不對齊到網(wǎng)格關帶格式的：字體：小五，字體顏色： 加1動設宣f魚 帶格式