微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)104P

1、會(huì)計(jì)學(xué)1微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)104P一、目的要求一、目的要求學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色的方法。二、實(shí)驗(yàn)材料二、實(shí)驗(yàn)材料1.菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金 黃色葡萄球菌。2.染料：草酸銨結(jié)晶紫液、路哥氏碘 液、95%乙醇、番紅液。3.其他：顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、酒 精燈、無(wú)菌生理鹽水、香柏油、二甲 苯等。三、基本原理三、基本原理 革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。的一種鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。創(chuàng)立。細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，再經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌紫色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為

2、兩大類，前者叫做革蘭氏陽(yáng)性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G-）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料，如堿性番紅等進(jìn)行復(fù)染。陽(yáng)性菌仍帶為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料，如堿性番紅等進(jìn)行復(fù)染。陽(yáng)性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)球菌，以及所有的放紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)球菌，以及所有的放線菌和真菌都成革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無(wú)芽孢桿菌線菌和真菌都成革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無(wú)芽孢桿菌都成負(fù)反應(yīng)。都成負(fù)反應(yīng)。 革蘭式陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌在化革蘭式陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色學(xué)組成和生理性

3、質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣。反應(yīng)不一樣。 一般認(rèn)為革蘭氏陽(yáng)性菌體內(nèi)含有特殊一般認(rèn)為革蘭氏陽(yáng)性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度低，吸附染色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度低，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。據(jù)。 另外，與細(xì)菌細(xì)胞壁的化學(xué)組成及結(jié)另外，與細(xì)菌細(xì)胞壁的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)有關(guān)。構(gòu)有關(guān)。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌由于細(xì)胞壁肽聚糖含量高革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌由于細(xì)胞壁肽聚糖含量高，脂類含量低，乙醇處理使細(xì)胞壁脫水，脂類含量低，乙醇處理

4、使細(xì)胞壁脫水，肽聚糖層孔徑變小，通透性降低，結(jié)晶紫肽聚糖層孔徑變小，通透性降低，結(jié)晶紫碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞不被脫色碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞不被脫色。 再有陽(yáng)性菌菌體等電點(diǎn)較陰性菌低，再有陽(yáng)性菌菌體等電點(diǎn)較陰性菌低，在相同在相同pH條件下進(jìn)行染色，陽(yáng)性菌吸附堿條件下進(jìn)行染色，陽(yáng)性菌吸附堿性染料較多，因此不易脫去，陰性菌則相性染料較多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時(shí)的條件要嚴(yán)格控制。反。所以染色時(shí)的條件要嚴(yán)格控制。四、方法與步驟四、方法與步驟操作過(guò)程如下：操作過(guò)程如下：涂片涂片干燥干燥固定固定草酸銨結(jié)晶紫染色（草酸銨結(jié)晶紫染色（1min）水洗水洗路哥氏碘液媒染（路哥氏碘液媒染（

5、1min）水洗水洗95%乙醇脫色（乙醇脫色（30s）水洗水洗番紅復(fù)染（番紅復(fù)染（1min）水洗水洗干燥干燥鏡鏡檢。檢。 關(guān)鍵點(diǎn)：關(guān)鍵點(diǎn)： 嚴(yán)格掌握嚴(yán)格掌握乙醇脫色程度乙醇脫色程度，如脫色過(guò)度，如脫色過(guò)度，則陽(yáng)性菌被誤染為陰性菌；而脫色不，則陽(yáng)性菌被誤染為陰性菌；而脫色不夠時(shí)，陰性菌被誤染為陽(yáng)性菌。夠時(shí)，陰性菌被誤染為陽(yáng)性菌。 菌齡菌齡也影響染色結(jié)果，如陽(yáng)性菌培養(yǎng)也影響染色結(jié)果，如陽(yáng)性菌培養(yǎng)時(shí)間很長(zhǎng)，或已死亡及部分自行溶解了時(shí)間很長(zhǎng)，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。，都常呈陰性反應(yīng)。 五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡 萄球

6、菌分別進(jìn)行革蘭氏染色。萄球菌分別進(jìn)行革蘭氏染色。2.對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌混合涂片進(jìn)對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌混合涂片進(jìn) 行革蘭氏染色。行革蘭氏染色。大腸桿菌（大腸桿菌（G-）枯草芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌（G+）金黃色葡萄球菌與大腸桿菌金黃色葡萄球菌與大腸桿菌六、實(shí)驗(yàn)思考題六、實(shí)驗(yàn)思考題1.繪出大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄繪出大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄 球菌的形態(tài)圖，注明放大倍數(shù)及顏色。球菌的形態(tài)圖，注明放大倍數(shù)及顏色。2.為什么革蘭氏染色所用細(xì)菌的菌齡一般不能為什么革蘭氏染色所用細(xì)菌的菌齡一般不能 超過(guò)超過(guò)24小時(shí)？小時(shí)？3.你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與課本中所述是否一致？如果你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與課

7、本中所述是否一致？如果 不一致，試分析原因。不一致，試分析原因。4.當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣 才能確保你的操作正確，結(jié)果可靠？才能確保你的操作正確，結(jié)果可靠？ 產(chǎn)生無(wú)性孢子是放線菌主要的繁殖方式。產(chǎn)生無(wú)性孢子是放線菌主要的繁殖方式。l霉菌（霉菌（mould，mold）凡生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上形成絨凡生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀或絮狀菌絲體的小型真菌，統(tǒng)稱為霉菌。毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀或絮狀菌絲體的小型真菌，統(tǒng)稱為霉菌。 v在功能上，霉菌的菌絲已有分化，可分為：在功能上，霉菌的菌絲已有分化，可分為：營(yíng)養(yǎng)菌絲：營(yíng)養(yǎng)菌絲：氣生菌絲：氣生菌絲：繁殖菌絲：繁

8、殖菌絲：v產(chǎn)淀粉酶等，用于甜酒的釀產(chǎn)淀粉酶等，用于甜酒的釀制制v生產(chǎn)多種有機(jī)酸生產(chǎn)多種有機(jī)酸v轉(zhuǎn)化甾體類物質(zhì)轉(zhuǎn)化甾體類物質(zhì)v產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶等，用于產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶等，用于腐乳的釀制腐乳的釀制v生產(chǎn)多種有機(jī)酸生產(chǎn)多種有機(jī)酸v轉(zhuǎn)化甾體類物質(zhì)轉(zhuǎn)化甾體類物質(zhì)v產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶等，用于產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶等，用于醬油的釀制醬油的釀制v生產(chǎn)多種有機(jī)酸生產(chǎn)多種有機(jī)酸v產(chǎn)毒素產(chǎn)毒素v生產(chǎn)青霉素v纖維素酶和有機(jī)酸等v果品腐爛v產(chǎn)生毒素l青霉菌菌絲與曲霉相似，但無(wú)足細(xì)胞。青霉菌菌絲與曲霉相似，但無(wú)足細(xì)胞。l分生孢子梗頂端不膨大，無(wú)頂囊。分生孢子梗頂端不膨大，無(wú)頂囊。l分生孢子小梗多次分枝呈掃帚狀。分生孢子小梗多次分

9、枝呈掃帚狀。l分生孢子顏色為青綠色。分生孢子顏色為青綠色。實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七 酵母菌的形態(tài)觀察酵母菌的形態(tài)觀察 （4）染色約0.5h后再次進(jìn)行觀察，注意死細(xì)胞數(shù)量是否增加。（5）繪圖說(shuō)明你所觀察到的酵母菌的形態(tài)特征，并計(jì)算0.5h后酵母菌的死亡率。 實(shí)驗(yàn)六培養(yǎng)基的配制與滅菌實(shí)驗(yàn)六培養(yǎng)基的配制與滅菌 了解配制微生物培養(yǎng)基的基本原理；掌握配制了解配制微生物培養(yǎng)基的基本原理；掌握配制、分裝培養(yǎng)基的方法。通過(guò)常用細(xì)菌培養(yǎng)基的配制、分裝培養(yǎng)基的方法。通過(guò)常用細(xì)菌培養(yǎng)基的配制，了解常規(guī)配制培養(yǎng)基的方法；并學(xué)會(huì)各類物品的，了解常規(guī)配制培養(yǎng)基的方法；并學(xué)會(huì)各類物品的包裝、配制和滅菌。包裝、配制和滅菌。 1.1.實(shí)驗(yàn)

10、目的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.2.實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)除了配制培養(yǎng)基以外，還必本實(shí)驗(yàn)除了配制培養(yǎng)基以外，還必須準(zhǔn)備各種無(wú)菌物品，包括培養(yǎng)皿須準(zhǔn)備各種無(wú)菌物品，包括培養(yǎng)皿、移液管的包裝，稀釋水的準(zhǔn)備等、移液管的包裝，稀釋水的準(zhǔn)備等。 3.3.實(shí)驗(yàn)方法和步驟實(shí)驗(yàn)方法和步驟 （1 1）玻璃器皿的準(zhǔn)備）玻璃器皿的準(zhǔn)備 培養(yǎng)皿的包裝、移液管的包裝培養(yǎng)皿的包裝、移液管的包裝 、棉塞的制作、棉塞的制作 、稀釋水的配制、稀釋水的配制 （2 2）培養(yǎng)基的配制）培養(yǎng)基的配制 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方：牛肉膏牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方：牛肉膏0.3g0.3g，蛋，蛋白胨白胨1g1g，NaCl0.5gNaCl0.5g，瓊脂，瓊脂

11、2.0g2.0g，水，水100ml100ml，pH pH 7.2-7.47.2-7.4。 滅菌條件：滅菌條件：121121，151520min20min。 稱量、加熱溶解稱量、加熱溶解 、調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)pH pH 、分裝、加棉塞、斜面分裝、加棉塞、斜面 、滅菌、滅菌 思考題思考題 了解加壓蒸汽滅菌的原理和方法。了解加壓蒸汽滅菌的原理和方法。 配制培養(yǎng)基的基本步驟有哪些配制培養(yǎng)基的基本步驟有哪些? ?應(yīng)注意什么問(wèn)題應(yīng)注意什么問(wèn)題? ?v計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚玻璃片，玻片上有四個(gè)槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)，中央平臺(tái)又由一短槽隔成兩半，其上各刻有一小方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大格，中央的一大格作為計(jì)數(shù)用，稱為計(jì)數(shù)室。

12、v計(jì)數(shù)室刻度有2種：一種是25中格X16小格，而另一種為16中格X25小格，它們都是由400個(gè)小格組成。每個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1mm，則每個(gè)大方格面積為1X1=1mm2。蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間高度為0.1mm,所以每個(gè)計(jì)數(shù)室的體積為0.1 X 1 X 1=0.1mm3,每個(gè)大格有400個(gè)小格，所以每個(gè)小方格體積為0.1/400=1/4000mm3=1/4000,000ml。*#第一個(gè)中格第二個(gè)中格第三個(gè)中格第四個(gè)中格第五個(gè)中格第一次測(cè)定第二次測(cè)定平均細(xì)細(xì) 菌菌化學(xué)藥物化學(xué)藥物大腸桿菌大腸桿菌枯草桿菌枯草桿菌稀釋涂板法、稀釋混合平板法、劃線分離n制平板：制平板：每組制培養(yǎng)每組制培養(yǎng)皿皿3付。

13、付。在無(wú)菌培養(yǎng)皿底部注明分離菌名、稀釋度、組別、班級(jí)。圖圖1 土壤稀釋液的制備和土壤稀釋液的制備和稀釋液的取樣稀釋液的取樣圖6典型菌落典型菌落產(chǎn)氣產(chǎn)氣報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性不產(chǎn)氣不產(chǎn)氣報(bào)告為大腸菌群陰性報(bào)告為大腸菌群陰性乳糖蛋白胨培養(yǎng)基乳糖蛋白胨培養(yǎng)基乳糖蛋白胨培養(yǎng)基乳糖蛋白胨培養(yǎng)基乳糖起選擇作用；溴甲酚紫起產(chǎn)酸指示，還有抑制其他細(xì)菌作用乳糖起選擇作用；溴甲酚紫起產(chǎn)酸指示，還有抑制其他細(xì)菌作用六、實(shí)驗(yàn)思考題六、實(shí)驗(yàn)思考題1.繪出大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄繪出大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄 球菌的形態(tài)圖，注明放大倍數(shù)及顏色。球菌的形態(tài)圖，注明放大倍數(shù)及顏色。2.為什么革蘭氏染色所用細(xì)菌的菌齡一般不能為什么革蘭氏染色所用細(xì)菌的菌齡一般不能 超過(guò)超過(guò)24小時(shí)？小時(shí)？3.你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與課本中所述是否一致？如果你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與課本中所述是否一致？如果 不一致，試分析原因。不一致，試分析原因。4.當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣 才能確保