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文檔簡介

1、癌癥病人術(shù)后主動特異性免疫治療 發(fā)表者:張文忠(訪問人次:933) - ndv修飾自體腫瘤 細胞疫苗中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會科技部李剛毅中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科韓小紅北京朝陽慈濟醫(yī)院生物治療中心許麗南主 題詞:自體瘤苗(atv)新城雞瘟病毒(ndv) t細胞(tcell)主動特異性免疫 治療(asi)英文縮寫:hn神經(jīng)氨酸酶 濮陽市油e總醫(yī)院普外科張文忠atv-ndv ndv修飾口體腫瘤細胞疫苗taa腫瘤相關(guān)抗原tata腫瘤相關(guān)移植抗原或腫瘤排斥抗原tcr抗原特異性t細胞受體mhc主要組織相容性復合體mltc混合淋巴腫瘤細胞培養(yǎng)ctl細胞毒t淋巴細胞一、概述在腫瘤基因治療中,經(jīng)常采用的手段就是

2、利用病毒作載體,將保護性或治療性基因直 接轉(zhuǎn)移至腫瘤細胞制成瘤苗,但這種手段常受到可感染細胞的數(shù)量、組織選擇性和應用安全 性的限制。本文介紹一種更加安全、有效和組織選擇性好的感染人腫瘤細胞的方法-新城雞 瘟病毒(ndv),它是一種禽類的副粘液病毒,具有多組織親和性(pleiotropic)的免疫刺激 特性,能在腫瘤細胞質(zhì)屮選擇性地復制而不依賴于細胞的增殖,使用安全。作為一種佐劑, 這種病毒臨床使用最顯著的特點就是它具有誘導t細胞共刺激活性、防止無能誘導和誘導 局部趨化因子(如:rantes> ip-10)和細胞因子(如:ifna、0, tnfa)的產(chǎn)生。因子 影響t細胞的募集和活化。利用

3、病毒來治療腫瘤的概念可以追索到本世紀的早期,當時許多有意義的發(fā)現(xiàn)引起了 人們極大的興趣,這就是許多腫瘤患者在自然病毒感染后出現(xiàn)腫瘤緩解和自愈現(xiàn)象。(13) 例如:腮腺炎病毒(4)和風疹病毒(3)感染。從此,便開始了將不同病毒用于臨床治療的 嘗試,但是,引起了一系列嚴重問題和副作用,特別是神經(jīng)毒作用和由于中和抗體的產(chǎn)生而 導致的無效。1994年德國國家癌癥研究所的雜志社論(5)標志著利用病毒治療的新紀元。 在這篇社論中,ndv被認為是最有希望的治療性的病毒。以ndv為基礎(chǔ)的疫苗已經(jīng)成為極具經(jīng)濟價值的曽醫(yī)藥,許多國家已用它保護由致病 性ndv引起的非典型性禽類疾?。?)o長期以來,人們已經(jīng)很清楚的

4、知道ndv具有抗哺 乳動物(包括人)腫瘤的形成(7)和免疫刺激的特點(8、9)。與其它類病毒相比,ndv 具有相對安全的優(yōu)點,許多感染過ndv的農(nóng)場主和實驗室工作人員都有這樣的經(jīng)驗,即使 是感染了野生型的ndv也只是引起輕微的疾病,如輕度關(guān)節(jié)炎和喉炎。利用ndv治療人類腫瘤有三種不同的概念-病毒治療、非特異性免疫治療和主動特 異性免疫治療。早期的病毒治療主要是采用ndv73t和ndv italian兩種溶解性毒株,如 ndv73t它能感染人所有類型的腫瘤細胞并在其屮復制,引起細胞與細胞的融合和多核體的 形成,最終導致腫瘤細胞死亡。由于ndv不能在正常細胞中復制,因此,人們就注意到了 ndv介導

5、的對人腫瘤細胞的選擇性殺傷作用(10)。在裸鼠實驗中,人們觀察到了,經(jīng)過 ndv局部治療后,人異種移殖瘤溶解和完全緩解(11)。但是,這種利用病毒直接注射治療 腫瘤的方法沒有進入臨床應用,僅限于局部治療,因為由于人血清中和抗體的存在,病毒不 能到達腫瘤轉(zhuǎn)移灶。德國癌癥研究中心的進一步實驗證實,在人黑色素瘤裸鼠轉(zhuǎn)移模型中, 利用ndv italian毒株進行系統(tǒng)治療,沒有觀察到抗轉(zhuǎn)移效果(12);利用ndv治療人腫瘤 的第二個概念就是非特異性免疫刺激。在匈牙利,這種治療方法己經(jīng)進入臨床評估階段,他 們將減毒的禽類病毒疫苗(吸入劑)用于晚期腫瘤病人的治療。良好的臨床應用結(jié)果已經(jīng)發(fā) 表(13)。在體

6、外將非溶解性毒株ndv ulster感染的人黑色素瘤細胞在注射裸鼠前與過量的 非感染黑色素瘤細胞混合后,發(fā)現(xiàn)不能發(fā)生種植反應。這表明非特界性免疫刺激作用具有很 強的抗腫瘤旁觀者效應。(12)這就是眾所周知的,ndv能激活人免疫細胞產(chǎn)生細胞因子(8、 9)和抗腫瘤ctl (14);第三個概念就是利用ndv作為有效腫瘤疫苗的生物佐劑。其目的 就是聯(lián)合應用疫苗表達腫瘤相關(guān)抗原(taas)的特異組份和增加腫瘤細胞免疫原性的非特 界組份。在早期的開拓性研究工作中,william a.cassel用腫瘤溶解性毒株ndv73t制備黑 色素瘤裂解物疫苗用于臨床治療(15、16),他在一系列的模式系統(tǒng)中(17)

7、觀察到病毒增 強了裂解物的抗原性。1983年和1992年,他發(fā)表兩個令人振奮的改善長期生存率的報告。 在這個報告屮,83例ii期惡性黑色素瘤病人術(shù)后接受免疫治療的五年生存率到達69%而沒 有接受接種的病人五年生存率只有17% (15、16)。八十年代初,徳國癌癥研究中心的 schirrmacher教授開始了設(shè)計利用非溶解性毒株修飾腫瘤細胞的活細胞疫苗的研究。從此, ndv ulster這個低致病性毒株便被選擇用于此目的(18、19)。二、atv-ndv的概念和制備兩種組份(特異和非特異)的活細胞疫苗適用于所有尚未鑒定腫瘤排斥抗原的腫瘤。特異 性組份就是白體腫瘤細胞,它來自病人手術(shù)的新解組織,因

8、為它最能代表和體現(xiàn)腫瘤病人個 體所有腫瘤抗原的免疫原性。具有多種潛在腫瘤相關(guān)抗原的新鮮分離的腫瘤細胞是一個具有 許多異質(zhì)性克隆的細胞簇,這個總體的細胞群落都能被非溶解性毒株ndv ulster有效感染 而修飾。因此,細胞疫苗具有許多優(yōu)越性。第一,無須鑒定特異性taas的存在;第二,經(jīng) 過適當修飾的細胞疫苗可適用多種惡性腫瘤的有效免疫治療。ndv作為修飾劑的顯箸特點是它的細胞結(jié)合特性,在幾分鐘之內(nèi),它通過自身的神 經(jīng)氨酸酶分子與包含ndv受體的唾液酸(sialyl -a-2-3-gal pl-4)結(jié)合(20)。而唾液酸是 細胞表面廣泛存在的神經(jīng)節(jié)昔脂的組份。在雞種蛋里繁殖的具有感染性的ndv u

9、lster標準 株包含有經(jīng)過酶切而具有融合活性的融合蛋白f,病毒與細胞結(jié)合后,hn和f介導了病毒 外膜和宿主細胞膜的融合作用。包含病毒負鏈rna皋因組的病毒核殼體通過宿主細胞產(chǎn)生 的小孔進入宿主細胞質(zhì)。atv-ndv的制備通常是在pbs的環(huán)境中進行,每一千萬個細胞與 32hu ndv ulstei溫育1小時。細胞疫苗經(jīng)過200gy射線或mmc處理滅能后就可用于癌 癥病人的真皮內(nèi)注射,注射6-24小時內(nèi),在接種局部,病毒在感染的腫瘤細胞內(nèi)復制增殖, 增加了病毒分子(如hn)的數(shù)量,誘導許多宿主基因產(chǎn)生可溶性因子。女口:細胞因子、趨 化因子和卩丫片肽等。這些因子共同改變了接種局部的微環(huán)境,導致局部

10、非特異性炎癥反應。 t細胞通過ndv誘導的趨化因子(rantes和ip10)而募集于接種局部,有些t細胞表 達t細胞受體(tcr),這些受體與腫瘤細胞表面以mhc-taas復合物存在的taas肽相互 作用介導第一信號的產(chǎn)生,缺乏共刺激分子的腫瘤細胞就不能傳遞另外的共刺激信號,因此 就不能活化腫瘤特異的t淋巴細胞。相反,在atv-ndv接種局部,由于共刺信號的存在, 腫瘤特異性t淋巴細胞就能夠活化,一種共刺激信號(信號2)是由病毒hn分子與病毒受 體相互作用介導產(chǎn)生,另一種共刺激信號(信號3)是由細胞因子與其對應的受體相結(jié)合產(chǎn) 生的。如ifna與1型ifn受體相結(jié)合。募集于接種位點的腫瘤特異性t

11、淋巴細胞有兩種類 型,其一是在荷瘤機體接受過刺激(primed)的記憶細胞。其二是處女t細胞。這兩種細胞 活化后產(chǎn)生腫瘤特異性記憶t細胞,重新參與體液循環(huán),再一次接觸taas時,例如在轉(zhuǎn)移 灶處,就可以通過介導細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生而誘導局部抗腫瘤免疫反應,新產(chǎn)生的這 些因子又可進一步募集(recruit)其它t細胞,最終消滅腫瘤,淋巴結(jié)引流區(qū)的處女t細胞 也可被激活(primed),隨接種次數(shù)的增加抗腫瘤反應性t細胞的數(shù)量也不斷增加。atv-ndv臨床應用的另一個重要方面就是由于修飾劑(病毒或細菌)的存在對機體 反應狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)。病毒或細菌感染過中,炎癥原因子的釋放干擾了免疫耐受和自身免疫性

12、疾 病的誘導(21)。因此,利用病毒(如ndv)或細菌(如bcg (22)修飾自體腫瘤細胞在 逆轉(zhuǎn)機體無反應狀態(tài)(免疫耐受)方面似乎是非常合理的,這種無反應狀態(tài)受到腫瘤特異性 t細胞的沖擊。三、atv-ndv臨床應用安全性下面我們總結(jié)一下ndv ulster感染人腫瘤細胞的特點。該病毒可以在人的腫瘤細胞中大量 復制,這一特點可以采用流式細胞技術(shù)做定量分析。例如:ndv ulster感染人黑色素瘤細胞 后,用抗hn單抗染色顯示,細胞表面熒光強度隨ndv感染劑量的增強,呈劑量依賴性漂 移,用200gy r-射線輻射腫瘤細胞可以證實病毒在腫瘤細胞屮的復制是非宿主細胞增殖依賴 性的。因為射線處理并不影

13、響病毒在宿主細胞中的復制,所以射線處理可以在感染腫瘤 細胞之前或之后進行,或者在患者使用前進行。至于這種治療手段的安全性問題需要特別指 出的是:ndv ulster基因組不與宿主細胞dna整合,該病毒不能在人正常細胞中復制,刈* 人沒有感染性。另外,感染人腫瘤細胞后新產(chǎn)生的病毒顆粒沒有感染能力,至少有三種方法 可以證明這一點(23)。如果人們對應用活病毒還心存疑慮的話,紫外線滅活是一個很好的 辦法,因為ndv很容易被紫外線滅活而不破壞其細胞結(jié)合能力和ctl刺激活性(31)。四、ndv感染腫瘤細胞介導粘附分子、改善抗原呈遞、誘導細胞因子和趨化因子產(chǎn)生和t 細胞共刺激活性(一)介導粘附分子,改善抗

14、原呈遞本節(jié)將著重討論atv-ndv的功效、作用機制和相關(guān)的文獻綜述。1979年日本學者 kobayashi用鼠friend病毒感染大鼠腫瘤細胞進行腫瘤免疫治療的實驗(24),為了解釋其免 疫治療效果他首次提出了完整腫瘤細胞的“異種化”概念,他認為實驗中觀察到腫瘤消退現(xiàn)象 是由于t細胞介導的對外來病每抗原識別的輔助效應所致。在此文中kobayashi還報告了許 多移植瘤實驗的新發(fā)現(xiàn),即經(jīng)過輻射處理滅活的完整腫瘤細胞(inactived but live)的免疫原 性要比細胞裂解物和細胞膜的免疫原性強。徳國科學家schirremacher教授在混合淋巴-腫瘤 細胞培養(yǎng)(mltc)實驗中,也證實了這

15、一點。他們的實驗證實,滅能但存活的完整腫瘤細 胞在產(chǎn)生腫瘤特異性ctl的應答方面具有極其重要的作用而細胞裂解物的免疫原性極低 (25)。在l10豚鼠肝癌模型中,他們觀察到,腫瘤細胞疫苗屮腫瘤細胞的活力在形成局部 炎癥應答和抗轉(zhuǎn)移治療效果方面具有與上述同等的重要性(22)。進而,在一系列動物腫瘤 模型免疫/保護實驗屮證實,同種同基因腫瘤細胞系(allogeneic)或同源同基因細胞系 (syngeneic)間的低交叉反應性表明其腫瘤識別和系統(tǒng)保護性免疫的高特異性,抗高轉(zhuǎn)移鼠 淋巴瘤亞系esb的腫瘤特異性ctl識別i類mhc (kd)限制性腫瘤抗原表位而不與其親代 低轉(zhuǎn)移淋巴瘤細胞系eb發(fā)生交叉反

16、應(26、27)o利用ndv修飾、輻射處理的esb活腫瘤細胞疫苗,術(shù)后免疫接種發(fā)生微轉(zhuǎn)移同源 同基因小鼠dba/2實驗表明,接種這樣的疫苗能對這些小鼠產(chǎn)生明顯和長時期的保護效果(18、19)o所有以上這些實驗和觀察結(jié)果就構(gòu)成了病毒修飾自體腫瘤活細胞疫苗治療概念 的基礎(chǔ)。在早期的esb腫瘤模型asi研究中,德國學者觀察到用低劑量ndv ulster修飾比用高 劑量ndv ulster修飾能獲得最佳的治療效果(18),類似的結(jié)果在大鼠friend病毒修飾的實 驗屮也觀察到了(28),利用不同劑量ndv修飾的esb腫瘤細胞的大容量體外mltc研究 揭示了,低劑量病毒修飾在增強腫瘤細胞特異性ctl應答

17、方面,具有最佳的生物學功能 (29)。緊接著徳國學者在有限稀釋分析中發(fā)現(xiàn)ndv對腫瘤細胞的感染引起ctl的前體細 胞增加3倍;檢驗單個ctl克隆的特異性發(fā)現(xiàn),所有克隆都是腫瘤特異性的,而沒有一個 克隆是識別病毒抗原的(29)。另外,病毒修飾在增強體外免疫應答是非常迅速的,而這是 建立在病毒特異性t輔助細胞(th)誘導基礎(chǔ)上的”異種化“假設(shè)所不能解釋的,也就是從 那時候開始(1988年)由德國學者schirremacher教授等提出了由ndv感染介導的t細胞 共刺激活性概念?,F(xiàn)在我們知道,t細胞共刺激依賴于腫瘤細胞表面某些粘附分子作為配體與相應的t 細胞表面上的受體z間的粘附作用。例如cd80和

18、cd86與t細胞表面上的cd28相互作用 介導了一個共刺激信號(也稱為cd28途徑);lfa-3與cd2相互作用介導了另一個共刺激 信號(t細胞受體復合物相關(guān)途徑)。圖2說明了徳國科學家早期的ndv介導的t細胞共 刺激活性假說。在提供這一假說的最新實驗證據(jù)以前,我們先來討論直接引起免疫原性和t 細胞刺激能力改變的ndv感染后腫瘤細胞表面的分子變化。ndv感染腫瘤細胞后引入了 一個新的細胞表面粘附分子-神經(jīng)氨酸酶(hn),它增強腫瘤細胞表面對淋巴細胞的粘附作 用,通過各種病毒滅活方法檢驗證實,ndv增強腫瘤細胞免疫原性的能力與其腫瘤細胞表 面的結(jié)合能力密切相關(guān)(30)。進一步實驗證實,hncdn

19、a鼠成纖維細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株比 對照新感染株能結(jié)合更多的淋巴細胞。當抗原特異性t細胞與特異抗原肽共孵育并允許其 與各自的同一個細胞上的i類mhc呈遞的抗原肽相互作用時,表達hn的細胞增強了抗原 呈遞能力(31)。另一個重要發(fā)現(xiàn)就是,ndv誘導的干擾素(ifns)在抗腫瘤ctl的應答 方面具有重要的作用(32)。如果將a、卩干擾索的中和抗體加入mltc的培養(yǎng)液中,發(fā)現(xiàn) ctl活性明顯減小,說明i類干擾素在抗原特界性ctl應答方面具有重要的輔助功能。在 基因重組干擾素面世以前,ndv 直是用來生產(chǎn)不同細胞類型干擾素的最常用的病毒,但 是,干擾素不僅僅是ndv感染腫瘤細胞所產(chǎn)生的唯一可溶性介質(zhì)。(二)

20、誘導細胞因子和趨化因子產(chǎn)生業(yè)已證明,在腫瘤細胞或宿主細胞感染ndv后可產(chǎn)生的細胞因子、趨化因子和其它基因 產(chǎn)物達12種以上,其中:細胞因子有ifnot、p, tnfa, il-1, il-6;趨化因子有rantes> ip-10 ;其它基因產(chǎn)物如:hsp、acth endorphin,inos,epa/timp, nfkb 等。在本文所涉 及的t細胞活化和腫瘤細胞疫苗的主動免疫方面起重要作用ndv誘導介質(zhì)是tantes和 ip-10,它們對單核細胞和t淋巴細胞在atv-ndv接種位點部位募集發(fā)揮著重要作用。這 一結(jié)論可以用白細胞募集的海綿基質(zhì)測定實驗所證實(33)。也可以從癌癥患者免疫接

21、種后 增強的遲發(fā)型超敏反應觀察到(34)。因為*干擾素和卩-干擾素在t細胞介導的抗腫瘤免疫應答方面的重要作用過去一直 被忽視,這里需要著重指出【型干擾素(ifns)在ctl應答和保護性抗腫瘤免疫方面具有 協(xié)同作用。一個最顯著的例證就是i型ifn受體基因敲除小鼠,由于受體的缺失導致cd8t 細胞(即細胞免疫中的殺傷性t細胞)降低10倍,這一結(jié)果以及前面所述的抗體阻斷實驗 都表明,t細胞活化的共刺激信號不僅通過象cd28這樣的粘附分子產(chǎn)生,也通過象ctl 上ifn-r這樣的細胞因子受體介導產(chǎn)生,這些信號在t細胞的功能活化和擴增等方面都具 有重要作用。ndv能誘導小鼠巨噬細胞產(chǎn)生*干擾素和卩-干擾素

22、,在體外的mltc-ctl 培養(yǎng)實驗和體內(nèi)的保護性抗腫瘤免疫檢驗中都證明了 ifna和ifn(3具有協(xié)同作用(36)0同 樣,病毒誘導的干擾素也增強t輔助細胞的旁觀者效應(35)或者增強對同族cd4t細胞 的輔助以及cd8t細胞應答。在過繼性抗腫瘤免疫治療屮,也可看到抗腫瘤免疫致敏t細 胞和ifna/卩的協(xié)同效應。(三)誘導t細胞共刺激活性ndv感染腫瘤細胞后誘導t細胞共刺激活性。ndv不僅可以誘導鼠cd4和cd8 t 淋巴細胞的應答,也可以誘導人cd4和cd8t淋巴細胞的應答。關(guān)于cd8t細胞的應答我 們在前血已經(jīng)提到過,ndv來源的hncdna轉(zhuǎn)染至i類mhc-肽抗原呈遞細胞中,可以刺 激

23、鼠抗原特異性ctl前體細胞的能力增強8倍;至于cd4t細胞的應答,我們也發(fā)現(xiàn),當 與亞適劑量的抗cd3刺激物混合后,ndv對誘導共刺激活性。對于人t細胞來說,一個有 趣的發(fā)現(xiàn)是,有些來自于病人的黑色素瘤特異性cd4t輔助細胞克隆,它們不能被自體黑色 素瘤刺激細胞刺激,只有以抗cd28抗體形式存在的共刺激信號存在時才被活化(37)。如 果沒有共刺激信號的存在,這些t細胞在與腫瘤細胞相互作用后,不僅不增殖,不產(chǎn)生il-2, 而且變成無反應狀態(tài)(無能),之后再遇共刺激信號也無應答。在德國癌癥研究中心設(shè)計的 新檢驗系統(tǒng)中可以看到,ndv感染自體黑色素瘤細胞的共刺激效應是:增殖后的t細胞應 答、il-2

24、的產(chǎn)生和阻止無反應狀態(tài)的誘導。在圖2所示的模型屮,集屮反映了病毒修飾的腫瘤細胞和應答t細胞間相互作用的 分子。這個模型表明了一種機制。即每個細胞引入103-104個功能hn分子后,瘤苗就能發(fā) 揮最大的生物學效應。副粘液病毒的hn分子在病毒的表面通過二硫鍵形成二聚體和四聚 體,每一個復合物代表了一個起吸附作用位點的分子叢和神經(jīng)氨酸酶活性。表達于腫瘤細胞 或抗原呈遞細胞表面的hn分子,要么以膜整合的形式,要么以非融合病毒子的形式起粘附 分子的作用,這是因為hn具有與神經(jīng)節(jié)昔酯上的唾液酸寡糖相結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,另外一個 結(jié)構(gòu)域所表達的神經(jīng)氨酸酶活性可以導致唾液酸酯解(受體破壞活性),這是病毒除吸附的 正

25、常機制,細胞表面負電荷的移去可以減少細胞間的電脈沖,增強細胞的相互作用(30)。最近有報道指出,共刺激信號使t細胞的活化域值大大降低(從每細胞8000個t細 胞激發(fā)受體降至1500個),使t細胞對抗原的刺激更敏感(38)??梢韵胂?,在t細胞受體 激發(fā)的連續(xù)動力學過程中,鄰近hn分子與細胞表面受體的結(jié)合和破壞功能,可以降低t 細胞的活化域值從而產(chǎn)生共刺激效應。參考文獻1. webb he, smith ce: viruses in the treatment of human cancer.lancet 1: 1206-1208, 1970.2. lindenmann j:viruses as

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