農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的概述

1、學(xué)年第學(xué)期2014級(jí)碩士生生物化學(xué)期末論文任課教師: 開課學(xué)院: 課程名稱: 學(xué) 院: 專 業(yè): 學(xué) 號(hào): 姓 名:2015年6月20日農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的概述摘要：自從1983年轉(zhuǎn)基因植物誕生以來，植物基因工程成為開展最快、應(yīng)用潛力最大的生物技術(shù)領(lǐng)域之一。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指把從動(dòng)物、植物或微生物中別離到的目的基因，通過各種方法轉(zhuǎn)移到植物的基因組中，使之穩(wěn)定遺傳并賦予植物新的農(nóng)藝性狀，如抗蟲、抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等。 1目前，應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因較多的方法有基因槍轟擊法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。由于基因槍轟擊的隨機(jī)性，容易出現(xiàn)突變、喪失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的穩(wěn)定表達(dá)的缺點(diǎn)，而農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

2、是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的拷貝數(shù)低、遺傳穩(wěn)定，是最常用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)20農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在一些單子葉植物尤其是水稻中也得到了廣泛應(yīng)用。本文對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法進(jìn)展綜述。關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效率1關(guān)于農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌5是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌， 它能在自然條件下趨化性的感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠嚶瘤或發(fā)狀根。與植物基因轉(zhuǎn)化有關(guān)的有根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌這兩種類型。1.1 根癌農(nóng)桿菌依據(jù)Ti質(zhì)粒誘導(dǎo)的植物細(xì)胞產(chǎn)生的冠嚶堿的種類不同， 根癌農(nóng)桿菌可分為4 種類型：章魚堿型Octopine、胭脂堿型

3、Nopaline、農(nóng)桿堿型Agropine和 琥珀堿型Succinamopine。原始的Ti質(zhì)粒根據(jù)其功能的不同可分為4個(gè)區(qū)：1.1.1 T-DNA區(qū)（TransfeL DNA region）:不同來源的菌株，T-DNA 的長(zhǎng)度在 1224 kb,它是在農(nóng)桿菌侵染細(xì)胞時(shí)，從 Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物基因組 中的一段DNA ,其攜帶的基因與月中瘤的形成有關(guān)，但與 T-DNA本身的轉(zhuǎn)移與 整合無關(guān).T-DNA上最重要的是T-DNA區(qū)兩端的邊界各為25 bp的重復(fù)序列.其 中14 bp是完全保守的，分10 bp（CAGGAATATAT）和4 bp（GTAA）不連續(xù)的2 組.左右2個(gè)邊界（LB和R

4、B）是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的，只要其存在，T-DNA 可以將攜帶的任何基因轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中，轉(zhuǎn)移的方向是從右向左， T-DNA的右邊界在T-DNA的整合中對(duì)于靶DNA位點(diǎn)的識(shí)別具有重要作用，因 此，尤以右邊界更為重要。1.1.2 毒性區(qū)（vir區(qū)）：位于T-DNA以外的1個(gè)30-40kb的區(qū)域，該區(qū)段編碼的基 因雖然并不整合進(jìn)植物基因組中，但對(duì)T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合非常重要。這些基因也稱為Ti質(zhì)粒編碼毒性基因（vir）。目前，對(duì)章魚堿型農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒pTi15955 和胭脂堿型農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒pTiC58的vir區(qū)進(jìn)展了全序列分析，在章魚堿型 Ti質(zhì) 粒的vir區(qū)發(fā)現(xiàn)了 8個(gè)操縱子，分

5、別為virA-vjrH ,共包括23個(gè)基因（virA, virB1-virB11, virC1 , virC2, virD1-virD4 , virE1 , virE2, virF, virG , virH）,而胭 脂堿型Ti質(zhì)粒的vir區(qū)不含vjrF和virH操縱子，它含有另一個(gè)基因tzs ,也有學(xué) 者認(rèn)為有大約35個(gè)vir基因成簇排布于vir區(qū)。1.1.3 接合轉(zhuǎn)移區(qū)（Con區(qū)）：該區(qū)段存在有與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因（tra）,調(diào) 控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌間轉(zhuǎn)移。1.1.4 復(fù)制起始區(qū)（ori區(qū)）：該區(qū)段調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制。在遺傳轉(zhuǎn)化過程中除了 Ti質(zhì)粒上的基因參與外，還有農(nóng)桿菌染色體基因

6、.染色 體基因包c(diǎn)hvA、chvB、att、pscA、chvD以及chvB.它們大多編碼一些膜相關(guān)蛋 白，負(fù)責(zé)細(xì)菌向植物受傷細(xì)胞趨化移動(dòng)和幫助細(xì)菌附著于植物受傷細(xì)胞上。1.2 發(fā)根農(nóng)桿菌發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogene令有Ri質(zhì)粒，能夠誘導(dǎo)被侵染的植物細(xì)胞產(chǎn)生毛發(fā)狀根。其侵染植物是將其Ri質(zhì)粒上的T-DNA插入到宿主植物基因組中， 這一點(diǎn)與Ti質(zhì)粒相類似。轉(zhuǎn)移機(jī)制也類似，所不同的是 vir區(qū)和T-DNA區(qū)所含 基因及其同源性不同。發(fā)根農(nóng)桿菌由于宿主植物損傷部位產(chǎn)生的酚類化合物而附 著在植物的細(xì)胞壁上，virA的產(chǎn)物是一種跨膜蛋白，進(jìn)一步激活 virG的產(chǎn)物。T-DNA

7、區(qū)的TL區(qū)具有較高的穩(wěn)定性，TR區(qū)具有與生長(zhǎng)素合成有關(guān)的基因tmsl 和tms2及農(nóng)桿堿或甘露堿合成基因。TR區(qū)可進(jìn)展改造，這樣Ri通過農(nóng)桿菌細(xì) 胞膜特定”孔道進(jìn)入宿主植物細(xì)胞核，進(jìn)而使 T-DNA整合到植物基因組中。 2轉(zhuǎn)化過程農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合是細(xì)菌和植物細(xì)胞相互作用發(fā)生生物學(xué) 效應(yīng)的過程，兼具原核生物中的細(xì)菌結(jié)合轉(zhuǎn)移及真核細(xì)胞加工修飾的特點(diǎn)。其轉(zhuǎn)化過程6-8如下：2.1 細(xì)菌在植物傷口處附著，使受傷的植物組織產(chǎn)生酚類化合物，誘 導(dǎo)Ti質(zhì)粒vir基因的表達(dá).在植物受到創(chuàng)傷后，創(chuàng)傷組織的細(xì)胞釋放出酚類化合物信號(hào)，如乙酰丁香酮As。當(dāng)農(nóng)桿菌承受到此類信號(hào)時(shí)，其vir區(qū)基因可被誘

8、導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。另一類誘導(dǎo) 化合物是組成植物細(xì)胞壁的一些特異單糖，As和單糖可協(xié)同誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上vir 區(qū)基因的表達(dá)。Vir區(qū)基因的活化首先是從virA基因開場(chǎng)的。VirA蛋白是一種結(jié) 合在膜上的化學(xué)受體蛋白，可直接對(duì)植物產(chǎn)生的酚類化合物感應(yīng)， 其感應(yīng)部位可 能位于胞質(zhì)區(qū)域。VirA蛋白的胞質(zhì)區(qū)域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后， 使VirG蛋白活化。VirG蛋白是DNA結(jié)合活化蛋白，可以以二體或多體形式結(jié) 合到vir啟動(dòng)子的特定區(qū)域，從而成為其它 vir基因轉(zhuǎn)錄的激活因子，翻開 VirB、 virC、virD、virE、virH 等幾個(gè)基因。virC、virD、virE 參與 T-DNA 復(fù)合體的

9、形 成和轉(zhuǎn)移.ChvE可結(jié)合一些單糖，也可直接與 VirA周質(zhì)區(qū)相互作用，以加強(qiáng) As對(duì)Vir基因的誘導(dǎo)。2.2 vir基因表達(dá)的產(chǎn)物作用于 T-DNA產(chǎn)生T-DNA鏈，進(jìn)而轉(zhuǎn)化形成 T-DNA復(fù)合體，隨后在植物及細(xì)菌蛋白的共同作用下被攝入細(xì)胞核。VirD基因編碼的兩個(gè)產(chǎn)物 VirDI和VirD2直接參與加工過程.VirDI蛋白是 一種拓?fù)洚悩?gòu)酶，可將超螺旋型DNA變成松弛型DNA . VirD2蛋白具有特異剪 切單鏈DNA的切酶活性，它可以識(shí)別T-DNA底鏈邊界重復(fù)序列上的特定位點(diǎn)， 并在底鏈24 bp重復(fù)序列和第四個(gè)堿基之間切割，將 T-DNA從Ti質(zhì)粒上剪切下 來，稱T-鏈。切開T-DN

10、A后，VirD2蛋白與T 一鏈的5'端共價(jià)結(jié)合，防止核 酸外切酶降解T 一鏈.新的T-DNA底鏈以此鏈為模板，從右端產(chǎn)生的 DNA缺 口處以5' -3'方向進(jìn)展合成。被取代的舊鏈游離出來，與許多 VirE2蛋白分子 結(jié)合組成T-DNA復(fù)合體。止匕外，VirD2作為一個(gè)導(dǎo)向蛋白，可以指導(dǎo)整個(gè)T-DNA 復(fù)合體從農(nóng)桿菌進(jìn)入到植物細(xì)胞核。2.3 T-DNA整合進(jìn)入植物基因組并表達(dá)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng).T-DNA整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，是轉(zhuǎn)化過程中最重要也最關(guān)鍵的步驟。 T-DNA在寄主細(xì)胞染色體上的整合是隨機(jī)的，但對(duì)轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域有所偏好。 T-DNA通過與事先斷裂的寄主DNA雙鏈(D

11、SB)發(fā)生重組來完成整合，進(jìn)而進(jìn)展表達(dá)。3轉(zhuǎn)化方法目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化單子葉植物最常用的方法是共培養(yǎng)法。 利用農(nóng)桿菌與植物離體組織共培養(yǎng)進(jìn)展轉(zhuǎn)化，一般需要經(jīng)過嚴(yán)格的組織培養(yǎng)過程以再生植株， 因而轉(zhuǎn) 化周期比擬長(zhǎng)。共培養(yǎng)前農(nóng)桿菌感染愈傷組織的方式有：將整塊愈傷組織浸泡 于菌液中靜置培養(yǎng)。將整塊愈傷組織浸泡于菌液中搖動(dòng)培養(yǎng)。將菌液加至愈傷組織上。通常使用的是第一種方式?，F(xiàn)將農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化常采用的方法9,簡(jiǎn)要介紹如下：3.1 葉盤法選取安康的無菌苗，用打孔器打出葉圓盤，將帶有新鮮傷口的葉圓盤與載有目的基因的農(nóng)桿菌液進(jìn)展短期共培養(yǎng)，農(nóng)桿菌通過傷口使攜帶外源目的基因的 Ti或 Ri質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)

12、胞，使外源目的基因整合到植物基因組中。 它是雙子葉植物較 為常用也較為簡(jiǎn)單有效的方法。3.2 真空滲入法該法轉(zhuǎn)化的強(qiáng)健植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。它 是一種簡(jiǎn)便、快速、可靠而且不需要經(jīng)過組織培養(yǎng)階段即可獲得大量轉(zhuǎn)化植株的 基因轉(zhuǎn)移方法，具有良好的研究與應(yīng)用前景。3.3 原生質(zhì)體法在原生質(zhì)培養(yǎng)的早期，將攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌與原生質(zhì)體共同培養(yǎng)， 農(nóng)桿 菌的Ti或Ri就會(huì)隨著外源信號(hào)分子的誘導(dǎo)而導(dǎo)入原生質(zhì)體的核，T-DNA就可能 整合在受體基因組上。止匕外，作為載體法，新的轉(zhuǎn)基因方法有：基

13、于 Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)建立的轉(zhuǎn)化 載體；利用噬菌體P1Cre-lox位點(diǎn)的特異性重組系統(tǒng)；利用酵母線粒體 I-Scel核酸切酶特異性誘導(dǎo)植物DNA雙鏈斷開引起的同源重組系統(tǒng)；利用雙鏈細(xì)菌人造 染色體載體系統(tǒng)等，能夠提高轉(zhuǎn)化率或轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)質(zhì)量。4研究現(xiàn)狀關(guān)于禾谷類單子葉植物農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，早期的研究多采用其幼胚來 評(píng)估不同條件下被農(nóng)桿菌侵染的可能性。結(jié)果顯示，T-DNA向禾本科植物中的轉(zhuǎn)化沒有明顯障礙，但人們對(duì)整合過程的了解十分有限，同時(shí)存在相當(dāng)大的爭(zhēng)議。 在此根底上，人們利用大量實(shí)驗(yàn)去測(cè)試不同谷類植物的不同外植體對(duì)農(nóng)桿菌侵染 的反響能力，以期獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植株。Grimsley等1

14、987首先將玉米條紋病毒(maize streak viruS) cDNA通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入玉米，轉(zhuǎn)入植株表現(xiàn)出 感染病癥；Gould等1991用根癌農(nóng)桿菌感染玉米芽尖，得到少量轉(zhuǎn)基因植株； Shen等1993觀察到農(nóng)桿菌介導(dǎo)的gus基因轉(zhuǎn)入玉米芽后B -葡糖甘酸酶的表達(dá)； Mooney等1991采用根癌農(nóng)桿菌感染小麥胚得到轉(zhuǎn)化細(xì)胞；Rainer等1990和Chan等1992通過根癌農(nóng)桿菌感染未成熟胚得到少量水稻轉(zhuǎn)基因植株。以 上研究工作得到的轉(zhuǎn)化頻率很低，且沒有足夠的分子和遺傳證據(jù)，這些研究成果 很少為大家承受并成認(rèn)，卻是鼓舞人心的，為單子葉植物尤其是禾谷類作物轉(zhuǎn)基 因研究的進(jìn)一步開展奠定了

15、根底。1993年-1994年取得了重大突破，Chan等1993 以水稻開花授粉后10-12天的幼胚為受體，經(jīng)農(nóng)桿菌感染后獲得了轉(zhuǎn)基因植株； Hiei等1997以水稻成熟胚愈傷組織和未成熟幼胚為受體，獲得了較多有嚴(yán)格 分子生物學(xué)證據(jù)的轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻的影響因素進(jìn)展了詳 細(xì)研究，建立了比擬成熟的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻的技術(shù)體系，為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化單子葉植物開辟了先河。從此，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化圍擴(kuò)展到了許多重要的單子葉 植物，包括香蕉、玉米、大麥、小麥、甘蔗、大蒜、洋蔥、高梁和黑麥Chenget al 1997Ishida et al 199610-135存在問題與展望5.1 植物受體因

16、子與農(nóng)桿菌間的作用機(jī)理目前對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的機(jī)理及分子調(diào)控已研究比擬深入，但對(duì)有關(guān)植物因子的作用機(jī)理還知之甚少。許多研究說明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化已具備了 與雙子葉植物相似的農(nóng)桿菌本身的必要條件，但單子葉植物的轉(zhuǎn)化相比擬而言困難得多，這可能不僅是農(nóng)桿菌一方的因素，單子葉植物的植物因子也可能起著關(guān) 鍵作用，也不排除農(nóng)桿菌和這些植物因子的相互作用1405.2 轉(zhuǎn)化率大多數(shù)單子葉植物的轉(zhuǎn)化受其基因型、外植體來源、組織培養(yǎng)難易程度等因素的影響，比擬難，以至在重要禾谷類作物中的應(yīng)用受到一定的限制，與雙子葉植物相比，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物還存在較大差距，其中煙草、葡萄等雙子葉植物的轉(zhuǎn)化效率高達(dá)60%

17、以上，而單子葉植物中轉(zhuǎn)化效率較高的禾本科植物還不到 30%解玉寶等2005;孟芮等2006）據(jù)統(tǒng)計(jì)，單子葉植物用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得成功 的遺傳轉(zhuǎn)化率玉米為5%-30%、水稻為29%、粕稻為22%,接近雙子葉植物（任永 霞等2005）150目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有原生質(zhì)體法、葉盤法和整 株感染法等。對(duì)于大多數(shù)單子葉植物的轉(zhuǎn)化，常受基因型、外植體來源、組織培 養(yǎng)難易程度等因素影響而很難成功，因此在許多重要禾谷類作物中的應(yīng)用受到限 制。5.3 Ti載體容量禾谷類作物的一些性狀，如抗病、抗蟲、抗逆、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等，或是數(shù)量性狀，或 是質(zhì)量性狀相關(guān)的基因成簇排布，定位在較大的DNA片段。這些性狀的改造

18、就 需要一個(gè)能將大片段DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)化體系。能攜帶大片段 DNA的雙元細(xì)菌人工染色體和具轉(zhuǎn)化功能人工染色體分別對(duì)煙草和擬南芥的成 功轉(zhuǎn)化Hamilton et al 1997 Liu et al 1999,無疑對(duì)實(shí)現(xiàn)禾谷類作物中導(dǎo)入大片 段DNA并進(jìn)展遺傳改進(jìn)具有重要意義衛(wèi)等 2000。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化也存在缺乏15-16。如農(nóng)桿菌感染過程會(huì)對(duì)植物材料造成損傷，T-DNA整合時(shí)其邊界可能會(huì)發(fā)生截?cái)郒amid et al 1996, T-DNA以串連形 式整合，基因依賴性較高Lee et al 1999,甲基化等原因造成基因表達(dá)失活Kumpalta et al 1997 1

19、99& Pawlowski et al 1998,轉(zhuǎn)移 T-DNA 區(qū)的兩個(gè)基因未 必共表達(dá)等Hamid et al 1996。另外，考慮到轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的平安性問題，培育具有平安選擇標(biāo)記或無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物也將成為植物基因工程研究的熱點(diǎn)之一。6完畢語隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅猛推廣，農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化在轉(zhuǎn)化機(jī)理、轉(zhuǎn)化圍、 轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)化策略等方面的進(jìn)一步深入研究，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已在植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng) 域中被廣泛應(yīng)用，成為獲得轉(zhuǎn)基因植物最常用的方法。參考文獻(xiàn)1翼，路曦結(jié)，韓文兵等.轉(zhuǎn)基因技術(shù)在我國(guó)的研究、應(yīng)用現(xiàn)狀及展望.農(nóng)學(xué)通 報(bào)A. 2003 ,9(6) :124-126.2耿立召，傳亮，付廣等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與基因槍轟擊法結(jié)合在植物遺傳轉(zhuǎn)化上 的應(yīng)用J.西北植物學(xué)報(bào)，2005, 25(1).3惠展.基因工程M.XX:華東理工大學(xué),2005,3654王關(guān)林，方宏筠.植物基因工程MI.:科學(xué)，2002: 452-453.5任永霞，季靜，王里，王萍.植物遺傳轉(zhuǎn)化方法概述J北方學(xué)院學(xué)報(bào).2005,21(6):38-42.6 Hellens R,Mullineaux P'KLEE H . A guide to Agrobacterium binary Ti vectors Trends in PlantScience 2000. 5: 446-4517 Gelvin SB.A