分子標(biāo)記在番茄抗性育種研究進(jìn)展

1、分子標(biāo)記在番茄抗性育種中研究進(jìn)展摘要：本文綜述了近年來 RFLP RAPD SSA AFLP CAP序口 SNP分子 標(biāo)記技術(shù)在番茄抗性育種上的應(yīng)用， 分析了目前的研究進(jìn)展，對(duì)今后 研究的重點(diǎn)進(jìn)行了討論。關(guān)鍵詞：分子標(biāo)記；番茄；抗性；進(jìn)展。Molecular marker in tomato resistance breeding researchprogress inAbstract: This paper reviewed recent RFLP RAPD SSA AFLP CAPS and SNP in the application of tomato resistance breed

2、ing, analysis of the current research progress, the focus of the future research are discussed.Key words: Molecular markers; tomato; resistance; progress.番茄既是蔬菜也是水果，其中含有豐富的維生素C 寸心血管有良好 的保護(hù)作用；番茄紅素具有良好的抗氧化作用，能清除體內(nèi)廢物，增加 免疫力。它也是營養(yǎng)師大力提倡的減肥食品。它早已成為人們?nèi)粘Ｉ钪械牟豢扇鄙俚氖澄?。隨著遺傳學(xué)的發(fā)展，遺傳標(biāo)記的種類和數(shù)量也在不斷增加。形態(tài)標(biāo) 記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記

3、都是以基因表達(dá)的結(jié)果（表現(xiàn)型）為基礎(chǔ)，是對(duì)基因的間接反映；而DN齡子標(biāo)記則是DN水平遺傳變異的直接反 映。與表型標(biāo)記相比，DN盼子標(biāo)記具有能對(duì)各發(fā)育時(shí)期的個(gè)體、 組織、 器官甚至細(xì)胞作檢測(cè)，既不受環(huán)境的影響，也不受基因表達(dá)與否的限 制；數(shù)量豐富；遺傳穩(wěn)定；對(duì)生物體的影響表現(xiàn)“中性”以及操作簡便 等特點(diǎn)。分子標(biāo)記的所有這些特性，奠定了它具有廣泛應(yīng)用性的基礎(chǔ)。 本文在介紹一些常用的DN圖子標(biāo)記技術(shù)基礎(chǔ)上，綜述分子標(biāo)記應(yīng)用 于番茄遺傳育種研究的新進(jìn)展，并就我國今后番茄分子育種主要研究 方向進(jìn)行討論。1 .分子標(biāo)記的介紹分子標(biāo)記的概念：廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。狹義分子標(biāo)

4、記是指能反映生物個(gè)體或種群間基因組中 某種差異的特異性DNAt段。在番茄遺傳育種研究工作中使用的DN份子標(biāo)記主要涉及基于 Southern雜交的限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（RFLP基于PC肢術(shù)的 DNAr增方法的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DN標(biāo)記（RAPD）,簡單重復(fù)序列標(biāo)記 （SSR）、以及基于PC而酶切相結(jié)合的擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記 （AFLP）、切割擴(kuò)增的多態(tài)性序列標(biāo)記（CAPS和單核甘酸多態(tài)性（SNP） 等。2 .分子標(biāo)記基本原理RFLP限制性片段長度多態(tài)性，restriction fragment length polymorphism,簡稱RFLP）g本原理是：植物基因組DNA5限制性內(nèi)切 酶酶

5、切后，通過電泳將大小不同的酶切片段按照各自的長度分離，通過Southern吸印與標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)酶切片段的多態(tài) 性，此方法穩(wěn)定可靠。RAPD隨機(jī)擴(kuò)增的 DN能態(tài)，性，random amplified polymorphic DNA, 簡稱RAPDM以基因組總DNM模板，利用隨機(jī)引物對(duì)模板進(jìn)行PCIT 增得到多態(tài)性DN附段，然后通過電泳檢測(cè)片段的多態(tài)性，以此來診斷 生物體內(nèi)在基因排布與外在性狀表現(xiàn)規(guī)律的技術(shù)。它基于PCR無需預(yù)先知道DN序列信息。簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats,簡稱SSR僅叫微衛(wèi)DNA（ microsatellite DNA）。所謂微衛(wèi)

6、星是由2 6bp的重復(fù)單位串聯(lián) 而成,一個(gè)微衛(wèi)星長度一般小于100bp,不同品種或個(gè)體核心序列的重 復(fù)次數(shù)不同，但重復(fù)序列兩端序列多是保守的單拷貝序列，通過PCr 增其間的核心微衛(wèi)星DN序列，利用電泳分析不同基因型個(gè)體在每個(gè) SSR&點(diǎn)上的多態(tài)性。AFLP（擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，amplified fragments length polymorphism,簡稱AFLP）原理是把限制性酶切片段通過PCRi應(yīng)進(jìn)行 擴(kuò)增,再把擴(kuò)增好的酶切片段通過聚丙烯酰胺凝膠等高分辨率的分析 膠電泳，最后檢出片段的多態(tài)性。切割擴(kuò)增的多態(tài)性序列標(biāo)記（cleaved amplified polymorphic

7、sequence,簡稱CAPS技術(shù)利用PC時(shí)RFL標(biāo)記進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，CAP/術(shù) 與AFL彼術(shù)相反，它是在先獲得某個(gè)位點(diǎn)特異擴(kuò)增產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，再 將該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，電泳檢測(cè)酶切片段的多態(tài)性。單核甘酸多態(tài)性（SNP肢術(shù)檢測(cè)的是單核甘酸的差異。主要是指由 基因組核甘酸水平上的變異引起的 DN解列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn) 換、顛倒、插入和缺失等。SNFft基因組內(nèi)可以人為地劃分為2種形式：基因編碼區(qū)的功能性突變，主要分布于基因編碼區(qū)(coding region), 故又稱為CSNP遍布于基因組的大量單堿基變異。與以前的一些遺傳 學(xué)標(biāo)記相比較，SNPM有位點(diǎn)豐富、檢驗(yàn)成本低、檢出率高等優(yōu)點(diǎn)。同 一位點(diǎn)的

8、不同等位基因之間常常只有一個(gè)或幾個(gè)核甘酸的差異，因此在分子水平上對(duì)單個(gè)核甘酸的差異進(jìn)行檢測(cè)是很有意義的。3 .番茄分子標(biāo)記在抗性育種中研究進(jìn)展番茄分子標(biāo)記在番茄抗性育種，耐冷性育種，耐鹽性育種，抗病蟲 害育種，抗病性育種(主要包括晚疫病，煙草花葉病毒，青枯病，斑 萎病)等方面的應(yīng)用十分廣泛，研究也日趨深入。3.1 在番茄耐冷性育種中的研究番茄是喜溫植物，溫度低于10c時(shí)生長發(fā)育就受到阻礙，8c時(shí)生 長量增加遲緩，5c時(shí)生長完全停止，有些品種還會(huì)表現(xiàn)出明顯的冷 害癥狀。黃錫志等人利用RFL盼子標(biāo)記構(gòu)建了番茄的基因連鎖圖，把 2個(gè)抗 冷性基因和3個(gè)番茄種子發(fā)芽期抗冷性相關(guān)的基因在基因連鎖圖上進(jìn) 行

9、了明確的定位1。趙福寬等人以番茄耐冷性基因系為試材， 從耐冷及冷敏感植株中提 取DN購建耐冷DN觸及冷敏感DNAfe,采用RAP分子標(biāo)記技術(shù)，從280 個(gè)隨機(jī)引物中篩選出一個(gè)在兩池間具有多態(tài)性的引物 OPF14用輪回 親本及回交后代的單株DNAJ行驗(yàn)證，證明了該引物擴(kuò)增出的特異性 片段是一個(gè)與番茄耐冷性相連鎖的RAP標(biāo)記。從瓊脂糖凝膠回收 OPF1獷增出的多態(tài)|i條帶與載體pGEMR_T_Ea連接，并轉(zhuǎn)入大腸桿 菌DH5，對(duì)克隆片段測(cè)序表明實(shí)際大小為792bp,這為轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定 的SCA標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。研究從DN份子水平上了解耐冷性狀的差異， 篩選與番茄耐冷性相關(guān)的RAPDb子標(biāo)記，為番茄耐冷育

10、種提高選擇效 率奠定基礎(chǔ)2。3.2 在番茄耐鹽性育種中的研究中國的北方地區(qū)土壤都是鹽堿地，對(duì)番茄的生長和產(chǎn)量有著很大程 度的影響，研究人員對(duì)番茄進(jìn)行耐鹽性試驗(yàn)，以期加速作物耐鹽育種 進(jìn)程，提高番茄的產(chǎn)量。Saranga等人通過分子標(biāo)記方法得出來自耐鹽的 L.pennelliiLA716 F2群體的總產(chǎn)量和總干物質(zhì)含量在鹽脅迫下的遺傳力為 0.30.4 ,試驗(yàn)結(jié)果表明可以通過后代選擇獲得耐鹽新材料。大大的 提高了選出耐鹽品種的育種速度。Monforte等人通過分子標(biāo)記技術(shù)在L.esculentum E9和L.cheesmanii L2的F2群體中鑒定出了一個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)，這個(gè)數(shù)量 性狀位點(diǎn)在鹽的

11、脅迫下能夠?qū)Ψ训脑缡煨云鹬饕绊懽饔?，解釋表型變異?5.6%,這個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)在非脅迫下的效應(yīng)明顯減小，說 明該數(shù)量性狀位點(diǎn)在鹽脅迫下控制早熟性，也發(fā)現(xiàn)其它微效數(shù)量性狀 位點(diǎn)和上位互作效應(yīng)存在4。3 . 3在番茄抗病性育種中的研究3.1.1. 抗白粉病育種中的研究Huan舞人將易感品種Mongker和抗病品種L.hirsutum G1.1560雜交后的得到的F代、F3弋材料進(jìn)行PAPDb析，把Ol-1基因定位在RFLP 標(biāo)記TG15手口 TG16數(shù)間。試驗(yàn)還找到了與抗番茄白粉病基因緊密連鎖 的5個(gè)均為共顯性RAP標(biāo)記，并轉(zhuǎn)化為SCAR01SCAR10SCAE16SCAR11 和SCAR16

12、SCA標(biāo)記，這有利于該基因的克隆以及番茄抗白粉病分子 標(biāo)記輔助選擇系統(tǒng)的建立，這個(gè)結(jié)果使得需要5至9次回交的傳統(tǒng)育種 方式完成的工作，只需2歆即可完成，大大縮短了育種時(shí)間 。衛(wèi)麗等人對(duì)由顯性核基因（RL-4）控制的番茄野生種L.peruvianum 抗白粉病抗性進(jìn)行了分子標(biāo)記研究。通過采用F2代群分法，在F2代抗、 感池間隨機(jī)篩選了 256對(duì)引物，找到了與番茄抗白粉病基因 RL-4連鎖 的6個(gè)AFL而記，遺傳距離分別為4.3 , 5.5, 5.5, 5.6, 6.6和 11.9cM6。3.1.2. 抗葉霉病育種中的研究Thoma等禾J用 AFL彼術(shù)在 L.esculentum（Cf-9）和 L

13、.pennellii 的F2世代中篩選出了近42 000個(gè)AFL睦位，試9獲得了 3個(gè)與Cf-9共分 離的AFL而記（M1、M2 M3）,集中于Cf-9基因兩側(cè)。對(duì)含有Cf-9基 因克隆的質(zhì)粒再用AFL而記進(jìn)行分析，得知M仰M盼別位于Cf-9基因 的兩側(cè)，相距間隔為15.5cM。Jones等人通過這3個(gè)標(biāo)記為起點(diǎn)，通過 轉(zhuǎn)座子示蹤子技術(shù)將Cf-9基因克隆口。于拴倉等人以9個(gè)含不同葉霉病抗病基因的番茄品種為試材，通過 接種鑒定表明，Cf-5、Cf-9、Cf-11和Cf-19基因?qū)χ袊壳暗?個(gè)葉 霉菌優(yōu)勢(shì)生理小種均具有較強(qiáng)的抗性。根據(jù)Cf-9基因設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增Cf-9基因的片段，含Cf-9、Cf

14、-11和Cf-19基因的3種番茄均獲得了 2.7kb的擴(kuò)增片段。但用限制性內(nèi)切酶 Taq I對(duì)PC產(chǎn)物酶切可以將3種材料明顯區(qū)分開來，Cf-9的2個(gè)差異酶切片段為1170和460bp;Cf-11的2個(gè)差異酶切片段為1100和410bp; Cf-19的2個(gè)差異酶切片段 為1210和300bp,從而建立了 3個(gè)基因的分子標(biāo)記。在F2分離群體中驗(yàn) 證表明，3個(gè)基因的分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與抗性接種鑒定結(jié)果是一致的， 用這些標(biāo)記可以進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇8。3.1.3. 抗晚疫病育種中的研究番茄的抗晚疫病是番茄生長過程中容易感染的一種病，由兩類不同 的基因控制：一種受單顯性Ph因控制；另受多基因控制，與多種因

15、素 有關(guān)，屬數(shù)量性狀。已在野生番茄中發(fā)現(xiàn) 2個(gè)PhS因（Ph1和Ph2）。Chunwongs繇人利J用感病品種CLN657（susceptible）和抗病品種 L3708（resistant） 雜交的F編體對(duì)基因Ph-3進(jìn)行標(biāo)記，找到1個(gè)RFLP 標(biāo)記TG591（LOD=18,41和2個(gè)AFLP該基因與Ph口Ph-2為非等位基因 9 OMoreau人利用Hawaii7996和WVa70雜交的F2代群體，把基因定位 在標(biāo)記CP10等口TG2338.4cM的范圍內(nèi)（第10條染色體白長臂上），并 利用BS解體找到了與Ph-2連鎖的AFLPg記。從而構(gòu)建了 Ph-2區(qū)域的 高密度圖譜，為該基因的圖譜克

16、隆奠定了基礎(chǔ)10。3.1.4. 抗煙草花葉病毒病育種中的研究番茄煙草花葉病毒病是番茄發(fā)生普遍的，危害嚴(yán)重的病害，在番茄中目前已鑒定出了 3個(gè)顯性抗病基因Tm-1、Tm-/口Tm-22（或Tm-2a）。Pillen等人利用2112個(gè)回交群體，對(duì)Tm-2sE域高分辨率遺傳圖譜 進(jìn)行了構(gòu)建，在周圍約4.3cM的范圍內(nèi)定位了 13個(gè)RFL標(biāo)記和RAPDR 記，其中10個(gè)標(biāo)記集中在0.2cM的窄小范圍內(nèi)，而離Tm-2撮近的兩側(cè) 標(biāo)記僅相距0.05cM。有一個(gè)RFL標(biāo)記(R12)與Tm-2超共分離現(xiàn)象。利 用Tm-斜側(cè)遺傳距離為1cMRFL標(biāo)記，只用兩代就可以獲得導(dǎo)入片 段僅為2cMi勺含Tm-2s因的植

17、株，而用常規(guī)方法至少需要100代才能得 到同樣的結(jié)果11。Da痔人利用兩個(gè)近等基因系Tom-1與DTom/R找到了兩個(gè)共顯性 的RAP標(biāo)記，長度分別為450b曲500bp,并將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR 標(biāo)記，來鑒定分離群體的雜和性和純和性，這為育種工作提供了一種方便、快速的方法。200弭田苗英等人運(yùn)用RAP鼓術(shù)和BSAI,找到 了一個(gè)與Tm-2s因連鎖的分子標(biāo)記OPD201700(7.067cM)2。3.1.5. 抗青枯病育種中的研究番茄青枯病(Ralstonia solnacearum)是一種發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重的 土傳性病害，其病原細(xì)菌可在土壤中存活多年，是熱帶、亞熱帶地區(qū) 番茄生產(chǎn)上的重要病

18、害。迄今為止尚未找到防止此病的有效藥物，因此進(jìn)行抗病育種是防治該病的最有效手段。Thoquet等人利用Hawaii7996和WVa70俁交的350琳F3群體和已有 的RFL標(biāo)記，利用不同的數(shù)量性狀位點(diǎn)模型，發(fā)現(xiàn)了 2個(gè)QR住要分布 在第6條染色體上，為番茄抗青枯病育種提供了方向13。壽森炎等人用番茄高抗青枯病品種" T51A'與高感青枯病品種 “T9230'配制雜交組合，接種鑒定其正反交 F1代及F2代分離群體的青枯病發(fā)生情況。結(jié)果表明，T51A寸青枯病的抗性屬于細(xì)胞質(zhì)遺傳， 受1對(duì)雜合基因加性控制。用64個(gè)EcoRI/Msel弓I物組合對(duì)“T51A'、“T9

19、230' 2個(gè)親本及其F2代抗病和感病基因池進(jìn)行AFL盼析，共擴(kuò)增 出約4 200條可分辨的帶，其中2條為穩(wěn)定的差異。用“T51A'和"T9230' 雜交產(chǎn)生的F2代分離群體對(duì)2個(gè)特異條帶與目的基因的遺傳連鎖性進(jìn) 行分析，發(fā)現(xiàn)特異條帶AAG/CAT暫定名為RRS-342勺抗青枯病基因緊 密連鎖，二者之間的遺傳距離為6.7cM。將AAG/CA片段回收、克隆和 測(cè)序，成功地將其轉(zhuǎn)化為SCA標(biāo)記，可以更加方便地用于對(duì)番茄青枯 病基因的標(biāo)記輔助選擇14。3.1.6. 萎病育種中的研究番茄斑萎病(Tomatospotted wilt virus)是一種嚴(yán)重的番茄病害之

20、一，通常引起番茄的莖和葉片的發(fā)育不良、壞死，造成植株死亡。而 由野生番茄轉(zhuǎn)移到栽培番茄中的Sw-5s因?qū)Ψ寻呶【哂忻黠@的 抗性。Chagu彝人通過用BSA!和RAP技術(shù)篩選與Sw-5連鎖標(biāo)記，找到了 9 個(gè)與Sw-5連鎖的標(biāo)記，其中標(biāo)記R儕DR紛別位與Sw-5兩側(cè)10.5cM的 范圍內(nèi)，與Sw-5的距離均為1.1cM,并認(rèn)為這2個(gè)標(biāo)記都是因種間雜交 隨同Sw-5進(jìn)入L.esculentum的。他們還把其中的R鼓造成穩(wěn)定的SCAR 標(biāo)記15。3.1.7. 茄抗蟲害育種中的研究根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)是番茄重要病害之一，隨著保護(hù)地蔬 菜面積的增加，特別是日光溫室的大面積推廣，

21、導(dǎo)致根結(jié)線蟲危害日 趨嚴(yán)重，目前生產(chǎn)上防治根結(jié)線蟲的方法雖然很多，但防治效果不理想，不能從根本上解決問題，而培育抗病品種，是經(jīng)濟(jì)有效的辦法。Klein-Lankhorst 等人利用83M713手口83M7138a等基因系（只在Mi和Asp-1位點(diǎn)有差異的群體），找至U了 2個(gè)RFL標(biāo)記（GP7訴口H6A202和3個(gè)RAP標(biāo)記。均與番茄根結(jié)線蟲基因緊密連鎖， 并且利用GP7標(biāo)記能 鑒定具有抗根結(jié)線蟲性狀的番茄植株的雜合性和純合性，從而為育種 工作提供了方便16。王孝宣等人將Multiplex-PCR和CAPS勺優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來建立了Multiplex-CAPS技術(shù)。這種技術(shù)能同時(shí)檢測(cè)2個(gè)、3個(gè)或多個(gè)

22、CAP標(biāo)記 的多態(tài)性，其效果等同于每個(gè)CAP標(biāo)記的多態(tài)性的疊加，重復(fù)性好， 分析效率高，降低成本數(shù)倍17。李紅雙等人研究應(yīng)用RAP技術(shù)，篩選到一個(gè)與番茄抗根結(jié)線蟲病基 因連鎖的RAP際記，并將該標(biāo)記成功地轉(zhuǎn)化成了 SCA標(biāo)記，為應(yīng)用分 子標(biāo)記輔助育種及為進(jìn)一步克隆該抗病基因打下基礎(chǔ)18。4 .分子標(biāo)記在番茄抗性育種中的應(yīng)用分子標(biāo)記是隨著生物技術(shù)迅速發(fā)展的日趨完善，建立在分子水平上的，不受環(huán)境因素影響的技術(shù)。分子標(biāo)記技術(shù)現(xiàn)今已經(jīng)廣泛用于各種 試驗(yàn)研究中。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在番茄抗病蟲育種中得到了越來越廣泛的作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前，已找到了與20余個(gè)抗病蟲基因連鎖的分子標(biāo)記。分子標(biāo)記技術(shù)還被用于番茄

23、抗病基因的分離。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已分離 的番茄抗病基因已達(dá)9個(gè)，其中包括抗細(xì)菌性斑點(diǎn)病的Pto基因和Prf 基因，抗枯萎病的I22基因和I22C基因，抗葉霉病的Cf22基因、Cf24 基因、Cf24A基因、Cf25基因和Cf29基因，這些研究對(duì)于探討抗病基因的作用機(jī)理和提高番茄的抗病性具有十分重要的意義。5,存在的問題與前景以上是近年來人們?cè)诜逊肿臃矫娴难芯浚@些可以讓研究人員對(duì) 番茄分子標(biāo)記方面的進(jìn)展有了 一定程度上的了解， 研究人員對(duì)番茄抗 蟲性和抗病性方面的研究比較多，成果也很普遍，但是在耐寒性，耐 鹽堿，耐熱方面的研究還是比較少，這就要求科研人員的試驗(yàn)不但要 把重點(diǎn)集中到抗病蟲害方面，

24、還要集中到耐寒抗耐鹽堿方面。當(dāng)然， 分子標(biāo)記技術(shù)必須依附于常規(guī)育種，因此，將分子標(biāo)記選擇應(yīng)用于常 規(guī)育種計(jì)劃，對(duì)番茄的生產(chǎn)，具有長遠(yuǎn)的意義。參考文獻(xiàn):1黃錫志,壽森炎,廖乾生.轉(zhuǎn)基因番茄研究進(jìn)展.北方園藝，2011 , 3:29-31.2趙福寬,楊瑞，林成，等.番茄耐冷性RAP分子標(biāo)記的篩選及牛I異片段的克隆.中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版,2004,13(1):70-74.3 Saranga Y.Cahaner A.,Zamir D. et al. Breeding tomatoes for salt tolerance:inheritance of salt tolerance and re

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