DNA重組的技術(shù)基本工具h(yuǎn)uang

1、選修三 現(xiàn)代生物科技專題專題一 基因工程專題二 細(xì)胞工程專題三 胚胎工程專題四 生物技術(shù)的安全性和倫理問題專題五 生態(tài)工程選修三 現(xiàn)代生物科技專題教學(xué)目標(biāo)： 簡述DNA重組技術(shù)所需要三種工具的作用； 認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新教學(xué)重點： DNA重組技術(shù)所需要三種工具的作用教學(xué)難點： 基因工程載體需要具備的條件課時安排：共3課時專題一什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重組技術(shù)。是指按照人們的愿望，在DNA分子水平上進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。一、基因工程的概念一、基因工程的概念

2、1 1、原理：、原理：2 2、操作水平：、操作水平：3 3、又稱：、又稱：4 4、優(yōu)點：、優(yōu)點：基因重組基因重組DNADNA分子水平分子水平DNADNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)重組技術(shù)或基因拼接技術(shù) 定向改造生物性狀定向改造生物性狀( (目的目的) ) 克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙 育種周期短育種周期短5 5、技術(shù)：、技術(shù)： DNADNA重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)1、艾艾弗里弗里證明證明DNA是遺傳物質(zhì)是遺傳物質(zhì)，DNA可從可從一種生物個體一種生物個體轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到另一種生物個體。到另一種生物個體。二、基因工程的誕生二、基因工程的誕生 P P2-32-3（一）基礎(chǔ)理

3、論：（一）基礎(chǔ)理論：2、沃森、克里克沃森、克里克建立了建立了DNA的的雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)模型模型3、梅、梅塞爾松、斯塔爾塞爾松、斯塔爾證明證明DNA的的半保留復(fù)制半保留復(fù)制4、克、克里克里克等等提出提出中中心心法則：法則：DNARNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制 5、1963年年尼倫伯格尼倫伯格和和馬太馬太破譯編碼氨基酸的破譯編碼氨基酸的遺傳密碼遺傳密碼，1966年年霍拉納霍拉納用實驗加以證明。用實驗加以證明。1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2)的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明4)DNA體外重組的實現(xiàn)5)重組DNA表達(dá)實驗的成功6)第一例轉(zhuǎn)基因動物問世7)PCR技術(shù)的發(fā)明（二）

4、技術(shù)發(fā)明：（二）技術(shù)發(fā)明：歡迎進(jìn)入朱建標(biāo)老師之生命課堂7紅色熒光蛋白紅色熒光蛋白紅色熒光蛋白基因紅色熒光蛋白基因基因表達(dá)基因表達(dá) 拼接拼接三、 DNA重組技術(shù)的基本工具限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”來源：主要從原核生物中分離純化出來。種類：已從近300種微生物中分離出4000種限制酶。作用：1.能識別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列2.使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。磷酸二酯鍵：磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵5 3 35限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”DNA末端：黏性末端和平末端限制酶的識別序列：大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，少數(shù)的識別序列由4、5或8個核苷酸組成回文序列回文序

5、列：回文序列：一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致順序完全一致 限制酶的識別序列：EcoRI限制酶的切割：中軸線中軸線在在G與與A之間切割之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoR)只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割：中軸線中軸線黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端在在G與與A之間切割之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoR)只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。C C C GC C C G G G G GG G G C C CG G G C C CSmaI限制酶的切割：只能

6、識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。中軸線中軸線你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？P4原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個磷酸二之間？可產(chǎn)生幾個黏性(平)末端？要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性(平)末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產(chǎn)生相同的黏性(平)

7、末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。作用（二 ）“分子縫合針”DNA連接酶把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來.作用原理形成磷酸二酯鍵GAATTCCTTAAGAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG思考？DNA連接酶連接兩個什么樣的末端，這樣的末端是經(jīng)幾種限制酶切開形成的？類型二 “分子縫合針”DNA連接酶類型來源功能相同點差別EcoliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)

8、可把黏性末端之間的可把黏性末端之間的縫隙縫隙“縫合縫合”起來起來，即恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間即恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的的磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵DNADNA連接酶與連接酶與DNADNA聚合酶是一回事嗎？聚合酶是一回事嗎？T T4 4 DNA DNA連接酶連接酶還可把還可把平末端之間的縫隙平末端之間的縫隙“縫合縫合”起來，但效率較低起來，但效率較低DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA連接酶連接酶區(qū)別區(qū)別相同點相同點?只能將只能將單個核苷單個核苷酸酸連接到已有的連接到已有的DNADNA片段上，片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵形成形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵在在兩個兩個DNADNA片段

9、片段之間之間形成磷酸二形成磷酸二酯鍵酯鍵DNA解旋酶作用呢？（三）（三）“分子運輸車分子運輸車”載體載體3 3、種類：、種類：1 1、需要具備的條件：、需要具備的條件：（1） 能夠在宿主能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定存在；細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定存在； （2） 有一個或多個限制酶切有一個或多個限制酶切點點，且每一種的切點最，且每一種的切點最好只有一個，以便與外援基因連接；好只有一個，以便與外援基因連接；（3） 有標(biāo)記基因有標(biāo)記基因，便于篩選；便于篩選；（4）對受體細(xì)胞要無害對受體細(xì)胞要無害。質(zhì)粒、質(zhì)粒、噬菌體衍生物、動植物病毒等噬菌體衍生物、動植物病毒等2、載體的作用、載體的作用將外源基因送入受體細(xì)胞。將

10、外源基因送入受體細(xì)胞。常用和最常用的載體分別常用和最常用的載體分別是？是？提示：提示：假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？作為載體沒有酶切位點將怎樣？作為載體沒有酶切位點將怎樣？目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何察覺？目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何察覺？如果載體對受體細(xì)胞有害將怎樣？如果載體對受體細(xì)胞有害將怎樣？一般來說天然載體往往不能滿足要求現(xiàn)在使用的幾一般來說天然載體往往不能滿足要求現(xiàn)在使用的幾乎經(jīng)過改造的。乎經(jīng)過改造的。 問題：問題：1 1、常見載體有哪些？、常見載體有哪些？ 2、載體如何與目的基因重組在一起？、載體如何與目的基因重組在一起

11、？ 3、載體應(yīng)滿足哪些條件？、載體應(yīng)滿足哪些條件？最常用的質(zhì)粒最常用的質(zhì)粒大腸桿菌的質(zhì)粒大腸桿菌的質(zhì)粒試分析其作為載體的優(yōu)點？試分析其作為載體的優(yōu)點？小結(jié)基因工程基因工程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有專一性具有專一性(識別序列識別序列)切開切開DNA分子的磷酸二酯鍵分子的磷酸二酯鍵DNA連連接酶接酶連接磷酸二酯鍵連接磷酸二酯鍵 種類種類E.coliDNA連接酶連接酶T4 DNADNA連接酶連接酶運載運載工工 具具具備的具備的條件條件能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在穩(wěn)定存在具一個或多個限制酶切位點具一個或多個限制酶切位點具標(biāo)記基因具標(biāo)

12、記基因?qū)λ拗骷?xì)胞對宿主細(xì)胞無害無害質(zhì)粒、質(zhì)粒、 噬菌體衍生物噬菌體衍生物 、動植物病毒、動植物病毒補充補充知識點：知識點：1.1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結(jié)合位點聚合酶結(jié)合位點啟動子啟動子終止子終止子啟動子：啟動子：位于基因首端一段能與位于基因首端一段能與RNARNA聚合酶結(jié)合并能起聚合酶結(jié)合并能起始始mRNAmRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：終止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADN

13、A片斷，它能片斷，它能阻礙阻礙RNARNA聚合酶的移動，并使其從聚合酶的移動，并使其從DNADNA模板鏈上脫離下來，模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。使轉(zhuǎn)錄終止。 P11P11RNARNA聚合酶聚合酶: :能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì)的一種蛋白質(zhì).(.(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落) )不能轉(zhuǎn)錄為信使不能轉(zhuǎn)錄為信使RNARNA，不能編不能編碼蛋白質(zhì)。碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNARNA，能編能編碼蛋白質(zhì)碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核有調(diào)控遺傳信息

14、表達(dá)的核 苷酸序列，在該序列中，苷酸序列，在該序列中， 最重要的是位于編碼區(qū)上最重要的是位于編碼區(qū)上 游的游的RNARNA聚合酶結(jié)合位點。聚合酶結(jié)合位點。非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點結(jié)合位點內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子含子啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內(nèi)含子：內(nèi)含子： 外顯子：外顯子： 補充補充知識點：知識點：2.2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核真核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的包括位于編碼區(qū)上游的RNARNA 聚合酶結(jié)合位點等。聚合酶結(jié)合位點等。非編碼序列：非編碼序列： 包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點不同點編碼區(qū)是編碼