MDA 多重置換擴(kuò)增技術(shù)

1、多重置換擴(kuò)增（多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)對(duì)單）技術(shù)對(duì)單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)研究進(jìn)展細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)研究進(jìn)展北大腫瘤醫(yī)院病因?qū)W教研室（山東省千佛山醫(yī)院）田源基因測(cè)序技術(shù)基因測(cè)序技術(shù) 目前應(yīng)用的快速序列測(cè)定技術(shù)可以總的概括為兩種：合成法和降解法?；赟anger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化學(xué)降解法這兩種基本思想。 傳統(tǒng)用于DNA測(cè)序的方法有毛細(xì)管微陣列電泳測(cè)序和焦磷酸測(cè)序等，這些方法往往技術(shù)要求高、成本貴，而且容易出錯(cuò)。 截至2007年，第二代基因測(cè)序方法已經(jīng)普遍推廣應(yīng)用，極大地降低了測(cè)序的成本和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了高通量測(cè)序。 2008年又提出了更快更好的第三

2、代測(cè)序方法-單分子測(cè)序（SMS）基因測(cè)序技術(shù)基因測(cè)序技術(shù) 基因測(cè)序需要一定量的DNA模板，所以測(cè)序前需對(duì)微生物進(jìn)行分離和培養(yǎng)，但是環(huán)境中大多數(shù)的微生物是不可培養(yǎng)或?qū)ε囵B(yǎng)條件要求很高的，這無(wú)疑給測(cè)序增添了難度。 單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)：?jiǎn)渭?xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)：通過一種叫做全基因組擴(kuò)增技術(shù)，不需要進(jìn)行微生物培養(yǎng)，可以直接擴(kuò)增放大單個(gè)細(xì)菌中的DNA獲得作為模板所需的微克DNA 。單細(xì)胞全基因組測(cè)序單細(xì)胞全基因組測(cè)序 單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)：?jiǎn)渭?xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)：是在單細(xì)胞水平對(duì)全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)。 其原理是將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)行擴(kuò)增，獲得高覆蓋率的完整的基

3、因組之后通過外顯子捕獲進(jìn)而高通量測(cè)序用于揭示細(xì)胞群體差異和細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系。全基因組擴(kuò)增技術(shù) 全基因組擴(kuò)增技術(shù)主要分為兩種類型： 一是基于熱循環(huán)以PCR為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技術(shù)，如簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR)、連接反應(yīng)介導(dǎo)的PCR (LM-PCR)、擴(kuò)增前引物延伸反應(yīng) (PEP)等； 一是基于等溫反應(yīng)不以PCR為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技術(shù)，如多重置換擴(kuò)增 (MDA) 和基于引物酶的全基因組擴(kuò)增 (pWGA)。 通過MDA擴(kuò)增DNA多重置換擴(kuò)增多重置換擴(kuò)增(Multiple dilacement amplification，MDA)是1998年由耶魯大學(xué)Lizardi博士首次提出。這種恒溫?cái)U(kuò)增的方法依賴于

4、鏈置換擴(kuò)增鏈置換擴(kuò)增原理，利用噬菌體29DNA聚合酶，高度擴(kuò)增DNA。該酶對(duì)于模板有很強(qiáng)的模板結(jié)合能力，能連續(xù)擴(kuò)增100Kb 的DNA模板而不從模板上解離。同時(shí)這種酶具有3 -5外切酶活性，錯(cuò)誤率僅為5 x 10-6，大約比Taq DNA聚合酶低100倍，因此可以保證擴(kuò)增的高保真性。29DNA聚合酶強(qiáng)大的向前延伸活性和高保真度，使得通過MDA可從極少量的DNA樣本獲取大量高質(zhì)量的DNA，是到目前為止對(duì)整個(gè)基因組覆蓋最廣、各位點(diǎn)擴(kuò)增偏倚最小的WGA方法。目前單細(xì)胞微生物可以通過對(duì)多重置換擴(kuò)增反應(yīng)多重置換擴(kuò)增反應(yīng)（ MDA）得到的擴(kuò)增DNA進(jìn)行測(cè)序。在細(xì)菌中幾個(gè)飛克 (10-15g)的DNA能擴(kuò)增

5、得到微克(10-6g)的高分子量DNA，擴(kuò)增得到的DNA 適合DNA文庫(kù)的構(gòu)建和Sanger測(cè)序。MDA生成的DNA也可直接作為模板供焦磷酸測(cè)序。單個(gè)細(xì)胞間基因序列的聯(lián)系也是一個(gè)功能強(qiáng)大的工具，它可用于對(duì)從環(huán)境DNA的提取物（宏基因組序列）得到的多重有機(jī)體通過鳥槍法測(cè)序來(lái)指導(dǎo)構(gòu)建基因芯片。多重置換擴(kuò)增（多重置換擴(kuò)增（MDA）的示意圖）的示意圖： 首先隨機(jī)六堿基引物在多個(gè)位點(diǎn)與模板DNA退火，接下來(lái)Phi 29 DNA 聚合酶在DNA的多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)起始復(fù)制，它沿著DNA模板合成DNA,同時(shí)取代模板的互補(bǔ)鏈。被置換的互補(bǔ)鏈又成為新的模板來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增，因此最終我們可以獲得大量高分子量的DNA.模板引物

6、引物多重置換擴(kuò)增多重置換擴(kuò)增 (MDA)MDA是目前公認(rèn)的最好的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)，它能對(duì)全基因組進(jìn)行高保真的均勻擴(kuò)增，擴(kuò)增出10100kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因組序列。但是MDA也有一些缺點(diǎn)，特別是顯著的非特異擴(kuò)增，往往空白對(duì)照樣品也總是“無(wú)中生有”地產(chǎn)生大量的DNA，另外就是仍然存在序列偏差。盡管各種改進(jìn)的策略正在逐步減少這些缺陷，高覆蓋率、高保真性及高特異性的擴(kuò)增仍然是亟待解決的問題。另外，對(duì)測(cè)序得到 的大量數(shù)據(jù)結(jié)果的專業(yè)分析也是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。 單細(xì)胞全基因組測(cè)序正在從基礎(chǔ)研究走向臨床應(yīng)用。多重置換擴(kuò)增技術(shù)（MDA）多重置換擴(kuò)增（多重置換擴(kuò)增（multiple dis

7、placement amplification，MDA）的）的技術(shù)：技術(shù)： 不需要進(jìn)行微生物培養(yǎng)，可以直接擴(kuò)增放大單個(gè)細(xì)菌中的DNA獲得作為模板所需的微克DNA 。整個(gè)實(shí)驗(yàn)包括： 環(huán)境樣品的準(zhǔn)備、單細(xì)胞分離、MDA擴(kuò)增DNA、DNA測(cè)序等。 環(huán)境樣品的處理環(huán)境樣品的處理 富集環(huán)境樣品中的微生物片段以利于分離單個(gè)細(xì)胞。分離單細(xì)胞前土壤先經(jīng)過密度梯度離心預(yù)處理。如果是水樣本，假如對(duì)生物體濃度有要求則要考慮附帶過濾。 離心、液體加壓沖擊法、過濾和靜電沉積法 。 液壓沖擊型空氣收集器可使細(xì)胞懸浮在用于分離單細(xì)胞的溶液中，可高效地捕獲液體基質(zhì)中1-10m的微粒。 分離單細(xì)胞根據(jù)所需要的生產(chǎn)量、環(huán)境以及靶

8、生物體等情況，可以通過采用稀釋法、熒光活性細(xì)胞篩選（FACS）、顯微操作和微流體分離到單個(gè)細(xì)胞用于MDA，采用FACS可以在一分鐘內(nèi)分離到上千個(gè)細(xì)胞。 單細(xì)胞分離結(jié)合熒光原位雜交（FISH）可以富集特異的菌屬，機(jī)械的顯微操作（基于體外受精的裝備）結(jié)合現(xiàn)代研究顯微鏡方法可以高效地分離到單細(xì)胞，如跟FISH結(jié)合從環(huán)境樣本中篩選出特異的種類用于MDA擴(kuò)增單細(xì)胞DNA實(shí)驗(yàn)。 流式細(xì)胞儀的測(cè)量對(duì)象流式細(xì)胞儀的測(cè)量對(duì)象大小 懸浮在溶液中的相互離散顆粒。 大小范圍：0.2uM-300uM。對(duì)象類型 細(xì)胞類型： （1） 高等真核細(xì)胞； （2）酵母； （3）細(xì)菌； （4）多細(xì)胞的聚集體，如胰島等。 非生命顆粒：

9、 細(xì)胞核、染色體、和其它細(xì)胞器以及乳化微球等。全基因組擴(kuò)增(WGA)是一組對(duì)全部基因組序列進(jìn)行非選擇性擴(kuò)增的技術(shù)，其目的是在沒有序列傾向性的前提下大幅度增加DNA 的總量。該技術(shù)通過對(duì)微量組織樣本，甚至單個(gè)細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA擴(kuò)增，再將其擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行后續(xù)分析，進(jìn)而完成多位點(diǎn)、多基因以及全基因組DNA 組成的研究。WGA技術(shù)發(fā)展至今主要IRS-PCR(interspersed repeat sequence PCR )、LA-PCR(1inker adaptor PCR)、Alu PCR、T-PCR (tagged random primer PCRT-PCR)、擴(kuò)增前引物延伸(pr

10、imer extension preamplification，PEP)和簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR (degenerate oligonucleotide primer-PCR，DOP-PCR)。但是，由于發(fā)生非特異性擴(kuò)增，位點(diǎn)覆蓋不完全，DNA 產(chǎn)物片段小于1 kb等缺點(diǎn)，限制了這些方法的應(yīng)用。初始模板量分別為：0.1ng,1ng,10ng,100ng，產(chǎn)量均為40g左右。 MDA 反應(yīng)的產(chǎn)量受起始DNA濃度的影響較小，Dean等通過對(duì)不同量的模板DNA進(jìn)行MDA反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)終產(chǎn)量較一致。這對(duì)于大范圍的遺傳學(xué)應(yīng)用十分有利，因?yàn)椴恍枰獪y(cè)量或平衡DNA濃度而直接進(jìn)行擴(kuò)增，而能產(chǎn)生同樣量的DNA。MD

11、A的應(yīng)用 SNPs和STRs基因型檢測(cè) 基因拷貝數(shù)改變的檢測(cè) DNA測(cè)序總的來(lái)說，MDA 由于其基因型的可靠性、高敏感性、高基因組覆蓋率以及較低的擴(kuò)增偏向性等優(yōu)點(diǎn)，使得該方法成為目前最有優(yōu)勢(shì)的WGA方法。MDA 已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于包括定量PCR、SNP基因型分析、Southern印跡分析、染色體圖譜中。基于基于MDA的單細(xì)胞測(cè)序的單細(xì)胞測(cè)序主要研發(fā)人：深圳華大基因研究院技術(shù)看點(diǎn)：將多重置換擴(kuò)增(MDA)和測(cè)序技術(shù)相結(jié)合。技術(shù)簡(jiǎn)介：本技術(shù)基于多重置換擴(kuò)增(MDA)，并對(duì)該方法的擴(kuò)增均一性、靈敏度、特異性等方面進(jìn)行了全面評(píng)估。這種將多重置換擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的單細(xì)胞測(cè)序方法不僅具有更高的分辨率和基

12、因組覆蓋度，而且具有更好的敏感性和特異性。該方法從單核苷酸水平上為各種復(fù)雜疾病和生物學(xué)過程的研究開辟了新思路。技術(shù)論文：Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Negative Myeloproliferative NeoplasmSingle-Cell Exome Sequencing Reveals Single-Nucleotide Mutation Characteristics of a Kidney TumorMDA的應(yīng)用MDA的應(yīng)用2012年，華大基因首次利用以MDA為基礎(chǔ)的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)原

13、發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia, ET)病人的單個(gè)骨髓細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序并分析，篩查出在ET發(fā)病和進(jìn)展中的驅(qū)動(dòng)基因, 從而證實(shí)ET為單克隆來(lái)源的疾病1。同時(shí)，也將該方法與經(jīng)典方法進(jìn)行比較，從而建立了具有高敏感性、高特異性、假陽(yáng)性率低等特點(diǎn)的單細(xì)胞測(cè)序方法，為分析疾病的遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)特征及克 隆進(jìn)化過程提供了新的思路。同樣的方法也用于分析單個(gè)腎癌細(xì)胞的單核苷酸突變特征，從而在更高的分辨能力上為評(píng)價(jià)基因改變的復(fù)雜性提供了更為優(yōu)化的方法1Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Neg

14、ative Myeloproliferative Neoplasm近來(lái)對(duì)MDA 方法的改進(jìn)：減少M(fèi)DA的反應(yīng)體積：通過減少污染的擴(kuò)增DNA和非特異性的合成，如引物二聚體，本質(zhì)上就是通過消除不必要的反應(yīng)體積增強(qiáng)特異性的擴(kuò)增。通過使用60 nl微流控反應(yīng)可提高擴(kuò)增的特異性。在MDA中，分支的DNA 中間體的形成可導(dǎo)致在一些對(duì)初始模板DNA鏈的延長(zhǎng)，然后被置換并對(duì)一個(gè)不同的模板延長(zhǎng)，其結(jié)果是形成嵌合體。完整的MDA反應(yīng)物和S1核酸酶處理后可以消除DNA的單鏈形式，這可使使嵌合體達(dá)到80的減少。對(duì)嵌合體形成酶路徑的了解目前正被用來(lái)減少嵌合體的發(fā)生。微流控芯片微流控芯片微流控芯片采用類似半導(dǎo)體的微機(jī)電加

15、工技術(shù)在芯片上構(gòu)建微流路系統(tǒng),將實(shí)驗(yàn)與分析過程轉(zhuǎn)載到由彼此聯(lián)系的路徑和液相小室組成的芯片結(jié)構(gòu)上。加載生物樣品和反應(yīng)液后,采用微機(jī)械泵、電水力泵和電滲流等方法驅(qū)動(dòng)芯片中緩沖液的流動(dòng),形成微流路,于芯片上進(jìn)行一種或連續(xù)多種的反應(yīng)。激光誘導(dǎo)熒光、電化學(xué)和化學(xué)等多種檢測(cè)系統(tǒng)以及與質(zhì)譜等分析手段結(jié)合的很多檢測(cè)手段已經(jīng)被用在微流控芯片中,對(duì)樣品進(jìn)行快速、準(zhǔn)確和高通量分析。微流控芯片的最大特點(diǎn)是在一個(gè)芯片上可以形成多功能集成體系和數(shù)目眾多的復(fù)合體系的微全分析系統(tǒng)。微型反應(yīng)器是芯片實(shí)驗(yàn)室中常用的用于生物化學(xué)反應(yīng)的結(jié)構(gòu),如毛細(xì)管電泳、聚合酶鏈反應(yīng)、酶反應(yīng)和DNA 雜交反應(yīng)的微型反應(yīng)器等。近日， Nature出版

16、集團(tuán)旗下刊物Scientific Reports刊發(fā)南方科技大學(xué)副教授賀建奎賀建奎課題組最新研究成果單細(xì)胞基因組擴(kuò)增法的定量評(píng)估及其在檢測(cè)單個(gè)海馬神經(jīng)元基因拷貝數(shù)變異的應(yīng)用，從多個(gè)角度評(píng)估了三種最常用的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增方法。經(jīng)過細(xì)致比較發(fā)現(xiàn)，MALBAC和GenomePlex WGA4的方法在拷貝數(shù)變異檢測(cè)方面明顯優(yōu)于MDA方法。 (Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles,多重退火和多重退火和成環(huán)循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)成環(huán)循環(huán)擴(kuò)增技術(shù))MALBAC:哈佛大學(xué)終身教授、美國(guó)科學(xué)院院士謝曉亮（Sunney Xie）教授研發(fā)。技術(shù)論文

17、：PMID: 23258894 Amplification of Break-pointsPacBio RS測(cè)序系統(tǒng)是基于單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（SMRT）和納米微孔應(yīng)用的第三代測(cè)序平臺(tái)。SMRT技術(shù)以單分子為單位，實(shí)時(shí)地傳導(dǎo)、記錄并分析帶熒光標(biāo)記的測(cè)序反應(yīng)；納米微孔技術(shù)保證了單一熒光信號(hào)強(qiáng)大的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確率。許多實(shí)體瘤和惡性血液病患者的癌癥基因組中都存在著腫瘤抑制基因缺失和其他染色體重組現(xiàn)象，而重組的斷點(diǎn)在個(gè)體間存在著很大差異，例如常見的CDKN2A基因缺失。結(jié)構(gòu)變異中斷裂位點(diǎn)的特征可以作為一種有用的腫瘤生物標(biāo)記物1。1.Amplification and thrifty single-molecule sequencing of recurrent somatic structural variations Amplification of Break-points文章中提出了一種專門針對(duì)異質(zhì)性腫瘤和生殖細(xì)胞樣本中SV斷點(diǎn)的方法，稱為AmBre（Amplification of Break-points）。AmBre方法是通過PCR擴(kuò)增SV（structure variation）斷裂