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1、藍(lán)色海洋書(shū)的海洋人巨噬細(xì)胞的獲取及功能測(cè)定 巨噬細(xì)胞(macrophage)有多種功能,是重要的抗原遞呈細(xì)胞,具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。巨噬細(xì)胞簡(jiǎn)單獲得,便于培養(yǎng),并可舉行純化。巨噬細(xì)胞在條件相宜下可生活23周,多用做原代培養(yǎng)??捎酶鳂愚k法來(lái)獵取人巨噬細(xì)胞,以皮皰法最為有用。 (一)皮皰法獵取人巨噬細(xì)胞【材料】斑蝥酊劑取藥用斑蝥以95制成10%酊劑,室溫下浸泡兩周后用法?!巨k法】1取lcm2大小的濾紙片2張,蘸滿斑蝥酊,置于一側(cè)前臂皮膚上,在濾紙片上壓一塊稍大的塑料片,上面再敷以清潔紗布,固定。2. 45小時(shí)后,取下塑料片和濾紙,可見(jiàn)局部皮膚發(fā)紅,表皮開(kāi)頭松動(dòng),用一拱型塑料蓋將局部罩好,固定包扎以
2、防止開(kāi)頭形成的水皰破碎。3. 48小時(shí)后,局部皮膚即形成一個(gè)完整的水皰。將皮膚消毒后,用無(wú)菌注射器當(dāng)心抽取皮皰內(nèi)滲出液,盛于無(wú)菌試管中。4局部用消毒紗布敷蓋,2d后取下紗布。此法患者無(wú)痛苦及任何不良反應(yīng)。斑蝥配誘發(fā)的皮膚炎性滲出液有多有少,大多在12ml,最多的可達(dá)8ml?!窘Y(jié)果】皮皰液中含m數(shù)平均為3040%,最多可達(dá)80%。(二)巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)1吞噬功能的檢測(cè) 巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬功能,試驗(yàn)室常用比細(xì)菌大的細(xì)胞性抗原作為被吞噬顆粒,如雞紅細(xì)胞。【材料】(1)雞紅細(xì)胞(crbc)懸液:取雞血12ml,阿氏液抗凝(放4冰箱可保存24周)。實(shí)驗(yàn)前用洗3次,然后配成5% crbc懸液。(2)
3、giemsa染色液?!巨k法】(1)取皮皰滲出液0.5 ml加crbc懸液0.olm1crbc數(shù)為(56)x106;(2)混勻,置37水浴中30分鐘(每隔10分鐘輕輕搖動(dòng)一次)。1000r/min離心5分鐘,棄上清液,留少許液體將細(xì)胞充分混勻,涂片,固定,giemsa染色(或g-w混合染色)?!窘Y(jié)果】油鏡下觀看并計(jì)數(shù)100200個(gè)m(d;吞噬細(xì)胞:即100個(gè)m(d中吞噬有crbc的細(xì)胞數(shù)。吞噬指數(shù):將100個(gè)m所吞噬crbc的總和除以100,所得每個(gè)m吞噬crbc的平均數(shù),即吞噬指數(shù)?!咀⒅厥马?xiàng)】在計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)同時(shí)注重crbc被消化的程度,共分4級(jí):級(jí):未消化一胞質(zhì)淺紅或淺黃帶綠色,胞核淺紫紅色。級(jí)
4、:輕度消化一胞質(zhì)淺黃綠色:核固縮,染成紫藍(lán)色。級(jí):重度消化一胞質(zhì)淡染,胞核呈淺灰黃色。級(jí):徹低消化一m內(nèi)只見(jiàn)外形似crbc大小的空泡,邊緣整齊,胞核隱約可見(jiàn)。2巨噬細(xì)胞表面受體的檢測(cè) 成熟的巨噬細(xì)胞表面具有fc受體和c3b受體,這些受體能識(shí)別經(jīng)igg和c3b調(diào)理的顆粒,并快速與之結(jié)合,促使細(xì)胞對(duì)相應(yīng)顆粒的吞噬,為此檢測(cè)這些受體可間接推斷巨噬細(xì)胞的功能。常用抗羊紅細(xì)胞致敏的羊紅細(xì)胞懸液作指示物舉行ea花環(huán)實(shí)驗(yàn)?!静牧稀浚?)兔抗羊紅細(xì)胞抗體igg,其凝集實(shí)驗(yàn)效價(jià)應(yīng)大于1:160;(2)巴比妥緩沖液(bbs),ph 7.47.8;(3) 2緩沖液和giemsa染液;(4)綿羊紅細(xì)胞(srbc)懸液
5、:抽取羊血經(jīng)脫纖維處理,以1:3比例保存于無(wú)菌的alsever液中,置4冰箱可保存1個(gè)月。臨用前,將srbc用bbs洗3次,第3次2000r/min離心5分鐘,棄上清液,再用bbs配成10%(v/v) srbc懸液。【辦法】(1) m的制備:將0.5ml的m懸液(如皮泡液)滴于整潔的載玻片上,于37濕盒中放置2小時(shí)。然后用pbs沖洗,除去非黏附細(xì)胞,則殘留的單層細(xì)胞大多數(shù)為m( 90%)。須防止玻片干燥而致細(xì)胞死亡。(2) ea懸液載制備:將兔抗srbc抗體igg用pbs作亞凝集水平稀釋?zhuān)ㄏ♂尡稊?shù)略低于抗體凝集效價(jià))。取稀釋后的igg液1份與等體積10% srbc懸液于試管內(nèi)充分混勻,置37水
6、浴中30分鐘,中間搖動(dòng)1次,取出后用pbs洗2次,以除去游離的igg。最后,配成5%(v/v)致敏srbc懸液(ea)。(3)在單層m玻片上,加0.2m1 ea懸液,平置4冰箱2小時(shí)。(4)取出玻片,用pbs輕洗,去除多余的srbc,用2固定,giemsa染色?!窘Y(jié)果】在顯微鏡下觀看ea花環(huán)形成,并計(jì)數(shù)。普通黏附5個(gè)或5個(gè)以上srbc的m作為一個(gè)花環(huán),隨機(jī)觀看200個(gè)m,計(jì)算花環(huán)形成細(xì)胞的百分率。3. m酸性磷酸酶測(cè)定 巨噬細(xì)胞富含溶酶體酶,如、非特異性酷酶、溶菌酶等,測(cè)定這些酶的活性也是衡量巨噬細(xì)胞功能的有用指標(biāo)之一。在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下,m內(nèi)的酸性磷酸酶能水解底物-甘油磷酸鈉形成磷酸鹽,后者
7、與硝酸鉛反應(yīng)產(chǎn)生磷酸鉛。磷酸鉛再與硫化銨反應(yīng)最后形成黑色硫化鉛,沉積在酸性磷酸酶所在處,顯示棕黑色顆粒?!静牧稀?1)底物反應(yīng)液:將3%-甘油磷酸鈉50ml,0.05mol/l醋酸緩沖液500m1,硝酸鉛0.6g混合即成。臨用前置37溫箱預(yù)溫至37后用法。(2) 2;(3) 1;(4) 30%,50%,70%,80%,95%,100;(5)二甲苯?!巨k法】(1)取新奇皮泡液0.51.oml,1000r/min離心10分鐘;(2)取沉淀細(xì)胞涂片,用吹風(fēng)機(jī)快速吹干;(3)涂片加冰冷的2固定30分鐘,用蒸餾水洗3次后,用0.05mol/l的緩沖液洗1次;(4)將涂片放入底物反應(yīng)液中,37溫育3090
8、分鐘;(5)涂片用蒸餾水洗3次后,用1處理1分鐘,以流水沖洗1分鐘;(6)依次用30%,50%,70%,80%,95% ,100脫水各5分鐘;(7)最后用二甲苯固定,透亮樹(shù)膠封片?!窘Y(jié)果】m胞質(zhì)內(nèi)酸性磷酸酶所在處呈棕黑色顆粒。酶活性的強(qiáng)弱可按照顆粒的數(shù)量和粗細(xì)的不同而分級(jí)推斷。顆粒數(shù)量少且細(xì)者為“+”,顆粒多而粗者為“3+”,介于兩者之間為“2+”?!咀⒅厥马?xiàng)】(1)酸性磷酸酶主要位于m胞質(zhì)的溶酶體內(nèi)。未經(jīng)固定的溶酶體堅(jiān)強(qiáng),溫育時(shí)簡(jiǎn)單發(fā)生破碎,故須固定后再舉行反應(yīng),效果較好,定位清楚;(2)酸性磷酸酶不穩(wěn)定,活性易喪失,所以固定液應(yīng)冷凍,固定時(shí)光宜短;(3)在定位反應(yīng)液內(nèi)的反應(yīng)時(shí)光,因試驗(yàn)條件和材料不同而異,需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)找出最相宜的反應(yīng)時(shí)光。4巨噬細(xì)胞促凝血活性測(cè)定激活巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生一種與膜結(jié)合的凝血活性因子,加速正常血漿的凝固,為此取已經(jīng)37預(yù)溫的
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