人巨噬細(xì)胞的獲取及功能測(cè)定

1、藍(lán)色海洋書(shū)的海洋人巨噬細(xì)胞的獲取及功能測(cè)定 巨噬細(xì)胞（macrophage）有多種功能，是重要的抗原遞呈細(xì)胞，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。巨噬細(xì)胞簡(jiǎn)單獲得，便于培養(yǎng)，并可舉行純化。巨噬細(xì)胞在條件相宜下可生活23周，多用做原代培養(yǎng)?？捎酶鳂愚k法來(lái)獵取人巨噬細(xì)胞，以皮皰法最為有用。 （一）皮皰法獵取人巨噬細(xì)胞【材料】斑蝥酊劑取藥用斑蝥以95制成10%酊劑，室溫下浸泡兩周后用法?！巨k法】1取lcm2大小的濾紙片2張，蘸滿斑蝥酊，置于一側(cè)前臂皮膚上，在濾紙片上壓一塊稍大的塑料片，上面再敷以清潔紗布，固定。2. 45小時(shí)后，取下塑料片和濾紙，可見(jiàn)局部皮膚發(fā)紅，表皮開(kāi)頭松動(dòng)，用一拱型塑料蓋將局部罩好，固定包扎以

2、防止開(kāi)頭形成的水皰破碎。3. 48小時(shí)后，局部皮膚即形成一個(gè)完整的水皰。將皮膚消毒后，用無(wú)菌注射器當(dāng)心抽取皮皰內(nèi)滲出液，盛于無(wú)菌試管中。4局部用消毒紗布敷蓋，2d后取下紗布。此法患者無(wú)痛苦及任何不良反應(yīng)。斑蝥配誘發(fā)的皮膚炎性滲出液有多有少，大多在12ml，最多的可達(dá)8ml?！窘Y(jié)果】皮皰液中含m數(shù)平均為3040%，最多可達(dá)80%。（二）巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)1吞噬功能的檢測(cè) 巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬功能，試驗(yàn)室常用比細(xì)菌大的細(xì)胞性抗原作為被吞噬顆粒，如雞紅細(xì)胞。【材料】(1)雞紅細(xì)胞（crbc)懸液：取雞血12ml，阿氏液抗凝（放4冰箱可保存24周）。實(shí)驗(yàn)前用洗3次，然后配成5% crbc懸液。(2)

3、giemsa染色液?！巨k法】(1）取皮皰滲出液0.5 ml加crbc懸液0.olm1crbc數(shù)為（56)x106；(2)混勻，置37水浴中30分鐘（每隔10分鐘輕輕搖動(dòng)一次）。1000r/min離心5分鐘，棄上清液，留少許液體將細(xì)胞充分混勻，涂片，固定，giemsa染色（或g-w混合染色）?！窘Y(jié)果】油鏡下觀看并計(jì)數(shù)100200個(gè)m(d；吞噬細(xì)胞：即100個(gè)m(d中吞噬有crbc的細(xì)胞數(shù)。吞噬指數(shù)：將100個(gè)m所吞噬crbc的總和除以100，所得每個(gè)m吞噬crbc的平均數(shù)，即吞噬指數(shù)?！咀⒅厥马?xiàng)】在計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)同時(shí)注重crbc被消化的程度，共分4級(jí)：級(jí)：未消化一胞質(zhì)淺紅或淺黃帶綠色，胞核淺紫紅色。級(jí)

4、：輕度消化一胞質(zhì)淺黃綠色：核固縮，染成紫藍(lán)色。級(jí)：重度消化一胞質(zhì)淡染，胞核呈淺灰黃色。級(jí)：徹低消化一m內(nèi)只見(jiàn)外形似crbc大小的空泡，邊緣整齊，胞核隱約可見(jiàn)。2巨噬細(xì)胞表面受體的檢測(cè) 成熟的巨噬細(xì)胞表面具有fc受體和c3b受體，這些受體能識(shí)別經(jīng)igg和c3b調(diào)理的顆粒，并快速與之結(jié)合，促使細(xì)胞對(duì)相應(yīng)顆粒的吞噬，為此檢測(cè)這些受體可間接推斷巨噬細(xì)胞的功能。常用抗羊紅細(xì)胞致敏的羊紅細(xì)胞懸液作指示物舉行ea花環(huán)實(shí)驗(yàn)?！静牧稀浚?)兔抗羊紅細(xì)胞抗體igg，其凝集實(shí)驗(yàn)效價(jià)應(yīng)大于1：160;(2）巴比妥緩沖液（bbs)，ph 7.47.8;(3) 2緩沖液和giemsa染液；(4)綿羊紅細(xì)胞（srbc）懸液

5、：抽取羊血經(jīng)脫纖維處理，以1:3比例保存于無(wú)菌的alsever液中，置4冰箱可保存1個(gè)月。臨用前，將srbc用bbs洗3次，第3次2000r/min離心5分鐘，棄上清液，再用bbs配成10%（v/v) srbc懸液。【辦法】(1) m的制備：將0.5ml的m懸液（如皮泡液）滴于整潔的載玻片上，于37濕盒中放置2小時(shí)。然后用pbs沖洗，除去非黏附細(xì)胞，則殘留的單層細(xì)胞大多數(shù)為m( 90%）。須防止玻片干燥而致細(xì)胞死亡。(2) ea懸液載制備：將兔抗srbc抗體igg用pbs作亞凝集水平稀釋?zhuān)ㄏ♂尡稊?shù)略低于抗體凝集效價(jià)）。取稀釋后的igg液1份與等體積10% srbc懸液于試管內(nèi)充分混勻，置37水

6、浴中30分鐘，中間搖動(dòng)1次，取出后用pbs洗2次，以除去游離的igg。最后，配成5%（v/v）致敏srbc懸液（ea)。(3)在單層m玻片上，加0.2m1 ea懸液，平置4冰箱2小時(shí)。(4）取出玻片，用pbs輕洗，去除多余的srbc，用2固定，giemsa染色?！窘Y(jié)果】在顯微鏡下觀看ea花環(huán)形成，并計(jì)數(shù)。普通黏附5個(gè)或5個(gè)以上srbc的m作為一個(gè)花環(huán)，隨機(jī)觀看200個(gè)m，計(jì)算花環(huán)形成細(xì)胞的百分率。3. m酸性磷酸酶測(cè)定 巨噬細(xì)胞富含溶酶體酶，如、非特異性酷酶、溶菌酶等，測(cè)定這些酶的活性也是衡量巨噬細(xì)胞功能的有用指標(biāo)之一。在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下，m內(nèi)的酸性磷酸酶能水解底物-甘油磷酸鈉形成磷酸鹽，后者

7、與硝酸鉛反應(yīng)產(chǎn)生磷酸鉛。磷酸鉛再與硫化銨反應(yīng)最后形成黑色硫化鉛，沉積在酸性磷酸酶所在處，顯示棕黑色顆粒?！静牧稀?1)底物反應(yīng)液：將3%-甘油磷酸鈉50ml,0.05mol/l醋酸緩沖液500m1，硝酸鉛0.6g混合即成。臨用前置37溫箱預(yù)溫至37后用法。(2) 2；(3) 1；(4) 30%,50%,70%,80%,95%,100；(5）二甲苯?！巨k法】（1）取新奇皮泡液0.51.oml,1000r/min離心10分鐘；(2)取沉淀細(xì)胞涂片，用吹風(fēng)機(jī)快速吹干；(3)涂片加冰冷的2固定30分鐘，用蒸餾水洗3次后，用0.05mol/l的緩沖液洗1次；(4）將涂片放入底物反應(yīng)液中，37溫育3090

8、分鐘；(5）涂片用蒸餾水洗3次后，用1處理1分鐘，以流水沖洗1分鐘；(6）依次用30%,50%,70%,80%,95% ,100脫水各5分鐘；(7）最后用二甲苯固定，透亮樹(shù)膠封片?！窘Y(jié)果】m胞質(zhì)內(nèi)酸性磷酸酶所在處呈棕黑色顆粒。酶活性的強(qiáng)弱可按照顆粒的數(shù)量和粗細(xì)的不同而分級(jí)推斷。顆粒數(shù)量少且細(xì)者為“+”，顆粒多而粗者為“3+”，介于兩者之間為“2+”?！咀⒅厥马?xiàng)】(1)酸性磷酸酶主要位于m胞質(zhì)的溶酶體內(nèi)。未經(jīng)固定的溶酶體堅(jiān)強(qiáng)，溫育時(shí)簡(jiǎn)單發(fā)生破碎，故須固定后再舉行反應(yīng)，效果較好，定位清楚；(2）酸性磷酸酶不穩(wěn)定，活性易喪失，所以固定液應(yīng)冷凍，固定時(shí)光宜短；(3）在定位反應(yīng)液內(nèi)的反應(yīng)時(shí)光，因試驗(yàn)條件和材料不同而異，需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)找出最相宜的反應(yīng)時(shí)光。4巨噬細(xì)胞促凝血活性測(cè)定激活巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生一種與膜結(jié)合的凝血活性因子，加速正常血漿的凝固，為此取已經(jīng)37預(yù)溫的