血小板功能檢測

1、血小板聚集實驗血小板活化PAC I, CD62P一、血小板功能檢測項目出血時間、粘附性、聚集性、釋放產(chǎn)物、花生四烯酸代謝產(chǎn)物、胞漿游離鈣水平測定、凝血活性、膜糖蛋白檢測、基因多態(tài)性和突變。常用的檢測功能的方法為：血小板聚集性測定(比濁法、阻抗法、循環(huán)血小板聚集體、自發(fā)性血小板聚集) ，近年來，流式細胞儀、 PFA-100 分析及激光衍射法檢測微小聚集體也逐漸地進入臨床或臨床前階段。比濁法測定血小板聚集是應(yīng)用較廣泛的指標(biāo)，可以用于遺傳性血小板疾病診斷指標(biāo)，也可以作為血栓性疾病中評估其病理反應(yīng)，指導(dǎo)抗栓藥物的應(yīng)用以及作為抗血小板藥物監(jiān)測之用。在比濁法的應(yīng)用中，有幾項關(guān)鍵問題應(yīng)予以注意： (1) 血

2、液采集與分離。 (2) 誘導(dǎo)劑應(yīng)用 : 種類、濃度。 (3) 正常值的選定。流式細胞儀可以檢測血小板功能、代謝、塵化及受體表達，而微小聚集體的形成作為血栓形成的早期敏感指標(biāo)采用激光衍射法的測定也正在評估中，反映體內(nèi)全血狀態(tài)下的血小板阻抗法以及血小板內(nèi)鈣離子水平的檢測在臨床研究中顯示其意義。二、血小板功能檢測的臨床應(yīng)用1 、出血性疾?。悍诌z傳性和獲得性二類，采用常規(guī)的血小板聚集試驗對遺傳性血小板疾病即可作出初步診斷。2 、血栓性疾?。捍蠖鄶?shù)血栓性疾病均可以檢測到血小板反應(yīng)性增高， ( 這對疾病的病理過程，指導(dǎo)疾病治精選文檔，供參考！療均有一定；意義，許多指標(biāo)在疾病中的意義也作比較研究，一些分子標(biāo)

3、志物在反映血小板活化方面有較高的靈敏度 ) 。 P 選擇素是反映血小板活化的較敏感指標(biāo)，而血小板聚集性測定較為簡便。最近的一些研究也表明血小板活化指標(biāo)不儀在反映血小板活化方面有意義，而且對某些疾病具有預(yù)示意義。譬如，膠原誘導(dǎo)血小板聚集在妊娠 25 周升高， 則預(yù)示先兆子癇， 具有較高的靈敏性和精確性， 也有采用血小板數(shù)、 MPV和聚集三項來綜合預(yù)示先兆子癇。 采用MPV、 血小板數(shù)和P 選擇素， 發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定心絞痛和心肌梗死有差別。這表明血小板檢測在臨床上足十分有用的。 在血小板參與功能血栓形成的機制中， 除了上述獲得性原因外，近年來的研究也證明存在遺傳因素。粘性血小板綜合征為常染色體顯性遺傳，

4、表現(xiàn)為對 ADP 和/ 或腎上腺素的血小板聚集反應(yīng)增強，本征分為三型： I 型對 ADP 和腎上腺素聚集反應(yīng)均增強， II 型對腎上腺素聚集反應(yīng)增強， III 型對 ADP 聚集反應(yīng)增強。在原因不明的動脈血栓形成中，本征的發(fā)病率占 21% 。血小板膜糖蛋白基因多態(tài)性與動脈血栓形成的危險之間的關(guān)系正在研究中。GPIIIa的PLA1(Leu33)-PL2(Pro33) ， GPba 上的三個多態(tài)性(39bp* 重復(fù)變異數(shù)、 Thrl45Met 、 -5T/C) ，膠原受體 GPIa807C/T 、Lys505Glu 的基因多態(tài)性與缺血性心臟病、腦血管病和介入療法的關(guān)系研究，多數(shù)是在基因型與疾病關(guān)系

5、之間進行，雖然獲得的結(jié)果尚屬初步，但譬如動脈粥樣硬化，心腦及周圍血管血栓病，糖尿病等疾病使人們對遺傳因素與血栓形成關(guān)系有了新的認識。3 藥物監(jiān)測中的應(yīng)用：抗血小板藥物監(jiān)測通常采川比濁法血小板聚集性測定即可，當(dāng)然，采用 PFA-100 時，其靈敏性更高，服用 ASA 時其血小板誘導(dǎo)劑叫可選用 AA+ADP 或膠原， 服用抵克力得和玻立維時可選用 ADP， 在 GPIIb/IIIa 拮抗劑活療葉， 用全血血小板聚集和流式細胞儀測得的結(jié)果 致， 較比濁法靈敏， 肝素治療引起血小板減少/血栓形成綜合癥也叮采用聚集法測定。血小板功能檢測主要有以下指標(biāo)：1,p 選擇素測定：用 ELISA 法，一般實驗室應(yīng)

6、該都能開展，醫(yī)院檢驗科肯定能開展，關(guān)鍵是你要買到試劑盒，有酶標(biāo)儀。這個指標(biāo)主要評價血小板活化程度?？尚行暂^大。2,血栓烷B2:也是可以用ELISA檢測，又t度和P選擇素差不多，主要反映血栓前狀態(tài)。3 , PF3:好象沒有自動化儀器可以檢測，所需要的試劑也很簡單，白陶土和氯化鈣就行了。但是首主觀影響很大。4 ，血小板聚集實驗：該實驗需要的試劑也很簡單，主要就是要有酶標(biāo)儀。5 ，血小板黏附實驗：手主觀影響大，幾乎已經(jīng)被淘汰了。綜上所述，有酶標(biāo)儀，應(yīng)該都還好做，只是操作方面你最好向做過這些實驗的人請教一下。有的醫(yī)院檢驗科開展以上檢查，可以咨詢技術(shù)方面的問題?！菊?血小板在執(zhí)行生理性止血的同時，也

7、在病理性血栓形成過程中起重要作用。血小板功能檢測對于臨床相關(guān)疾病的診斷和抗血小板藥物的篩選及相關(guān)研究有著重要的意義。 目前， 血小板功能檢測的實驗與方法日益增多， 但所有這些檢測方法均有不足之處， 因而有必要研究和發(fā)展一種操作簡便、檢測靈敏度高的方法。 本文對近年來血小板功能檢測方法諸如血小板的一般功能檢測、 血小板黏附功能測定、 血小板聚集功能測定、 血小板釋放功能測定、 血小板凝血活性檢測和流式細胞術(shù)在血小板功能檢測中的應(yīng)用等研究進展進行了綜述，并對研究前景作了簡單的展望。精選文檔，供參考！【關(guān)鍵詞】血小板功能檢測Research Advance in Platelet Function

8、AssaysReviewAbstract Platelets play a key role in the pathogenesis of atherothrombosis, and also perform the physiological hemostasis.The platelet function assays have values in the investigating patients with suspected platelet disorders and in studying the effects of anti platelet drugs.There are

9、increasing assays for investigating platelet function,including assessment of platelet adhesion,activation and aggregation,etc.However,all of these assays have certain limited sensitivity.It is necessary to develop a simple, sensitive assay that measures the activated platelet. This article reviewed

10、 advances of researches on platelet function assays, including assay for general function of platelet, assay of platelet adhesion function, plantelet activation assay, platelet aggregation assay, platelet coagulation assay and application of flow cytometry in assessment of platelet functions, etc. a

11、nd looked forward to research prospect in this field.Key wordsplatelet； platelet function; platelet function assayJ Exp Hematol 2007; 15(5):1130-1134血小板在生理性止血、維持血管壁完整性以及某些病理過程，如血栓形成、動脈粥樣硬化、不穩(wěn)定性心絞痛、腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥反應(yīng)等過程中起著重要作用：1,2。因此，血小板功能檢測對早期發(fā)現(xiàn)是否有血栓形成的危險以及血小板相關(guān)疾病的診斷和治療有著重要的意義。本文就血小板功能檢測方法的研究進展作如下綜述。血小板功能檢測可

12、分為血小板一般功能測定，血小板黏附、聚集及釋放功能的測定和流式細胞術(shù) (FCM)分析等。血小板一般功能測定這種測定包括出血時間的測定：3、血塊收縮試驗、活化凝血時間測定、快速血小板功能分析法 (RPFA) 4等，是目前臨床評價血小板功能的輔助手段。精選文檔，供參考！血小板粘附功能測定1941年Wright 5建立了轉(zhuǎn)動玻瓶法測定抗凝全血中的血小板在玻璃瓶表面的黏附特性。1960年，Hellem 6建立了玻璃珠柱法測定枸檬酸抗凝全血或富血小板血漿的血小板粘附性。血液通過 玻璃珠柱后，由于血小板粘附在玻珠或塑料管， 以及形成的血小板聚集體被滯留在玻璃珠柱內(nèi)。因此，過柱后血液中的血小板數(shù)降低，故又稱

13、滯留試驗。1963年Salzman 7對Hellem法加以改進，血液抽出后為經(jīng)抗凝直接通過玻璃珠柱進行測定，本法有助于粘附性減低的出血患者的診斷，但對粘附性增高的血栓性疾病敏感性降低。血小板聚集功能的測定血小板聚集是血小板的一個重要生理特性，是其參與止血和血栓形成過程的重要因素之一。血小 板聚集功能的測定對于臨床上診斷血栓前狀態(tài)和血栓性疾病具有重要意義。長期以來血小板聚集活性的檢測一直是血小板體外功能評價的金標(biāo)準(zhǔn)8。目前已有多種方法對血小板聚集活性進行定量或定性的測定。肉眼或鏡下檢查法主要觀察聚集顆粒出現(xiàn)的時間及其大小，以判斷血小板的聚集活性，但是只能粗略地評價血小板 的聚集活性。將全血以恒定

14、的速度通過微孔金屬網(wǎng)，若血小板聚集成團，則阻止血流通過，測定過濾前后的壓 力差來表示血小板聚集活性。PRP比濁法最初由Bron 9提出，在特定的攪拌條件下，在富含血小板血漿（PRP）中加入誘導(dǎo)劑，血小板激活后GP nb ma復(fù)合物暴露出纖維蛋白原的受體并與其結(jié)合而導(dǎo)致血小板聚集，血漿濁度降低， 透光率增加，光電池迅速將光濁度的信號轉(zhuǎn)換為電訊號，在記錄儀上記錄下電訊號的變化。精選文檔，供參考！PRP 比濁法是目前應(yīng)用最廣泛的一種測定法，臨床上對于血小板無力癥、原發(fā)性血小板增多癥及血栓前狀態(tài)和血栓性疾病的診斷具有重要意義。 這種方法也存在不足之處： 需要去除紅細胞， 可導(dǎo)致CO2 的揮發(fā)和 pH

15、增高， 不能完全反映體內(nèi)血細胞之間的相互作用； 測定時間過長可導(dǎo)致血小板活性降低； 對血小板聚集物的形成不敏感， 只能檢測大的血小板聚集物； 離心過程也會導(dǎo)致血小板的激活和紅細胞碎片中血小板的丟失； 血小板數(shù)目的調(diào)整難以標(biāo)準(zhǔn)化； 重現(xiàn)性差 10 ； 而且高脂血癥的 PRP會影響吸光度，減少PRP與PPP之間的差異。因此，體外血小板聚集實驗不能準(zhǔn)確反應(yīng)體內(nèi)血小板的聚集功能和血小板活化水平的變化 11 。全血電阻抗法1980年Cardina和Flower 12以電阻抗原理設(shè)計了一種測定全血中血小板聚集的方法，即在測定管中加入 2 個電極，加入誘導(dǎo)劑膠原或ADP ，血小板發(fā)生聚集而堆積在電極上，阻抗

16、就相應(yīng)增加，在記錄儀上記錄這種阻抗， 以觀察體外血小板的聚集活性。 這種方法的優(yōu)點是直接使用全血， 無需富血小板血漿的制備， 操作更簡便快捷； 無需經(jīng)過離心， 是新型血小板功能試驗和血小板拮抗劑評價的良好供選方案13 ；對于脂血標(biāo)本的測定，可以克服比濁法因渾濁而影響結(jié)果。這種方法的不足之處， 與比濁法相比較對小聚集物的形成不敏感， 且每次測定后需要清洗電極， 連接電極的電線需要小心放置，不能彎曲，使其很難滿足臨床工作的需要。全血血小板計數(shù)法用來測定血小板聚集時減少血小板數(shù)目。將枸櫞酸鈉抗凝的全血放到含有旋轉(zhuǎn)離心磁棒的聚苯乙烯試管中，并在37下孵育，用甲醛固定單個血小板，以測定起始血小板數(shù)。加入

17、誘聚劑誘導(dǎo)血小板聚集，并測定聚集后血小板數(shù)量，聚集前后進行比較，得出血小板減少的百分率。該法對很小的血小板聚集物敏感，并不需要對抗凝全血的稀釋，耗血量少，所需時間短，可用于評價血小板功能異常的病人。精選文檔，供參考！血小板功能分析儀（PFA 100）PFA 100系統(tǒng)最早在1995年由Kundu等14提出，對抗凝全血的血小板功能進行定量檢測。PFA 100模仿體內(nèi)血管損傷時的止血環(huán)境，此系統(tǒng)由微處理器控制，使用一次性反應(yīng)杯，內(nèi)有一層 生物膜，表面附有膠原，并含有 ADP或腎上腺素。當(dāng)用枸檬酸鈉抗凝的全血從膜的小孔中抽吸出來 時，血小板粘附于膠原并被 ADP或腎上腺素進一步活化，形成血小板栓子，

18、將小孔阻塞，儀器自動 記錄小孔完全阻塞的時間，所需的時間稱為 "封閉時間"。膠原和ADP用來區(qū)分先天和后天性血小板 功能障礙，膠原和腎上腺素都適合檢測阿斯匹林誘導(dǎo)的正常人血小板異常：15o PFA 100操作簡單,結(jié)果準(zhǔn)確，臨床上用于VWD和血小板異常的篩選，以及抗血小板藥物治療的監(jiān)測和外科手術(shù)過程中 初級止血的評價。然而 PFA 100對于纖維蛋白原缺陷疾病的診斷的靈敏度低：16。體外血小板聚集計測定法在高剪切力條件下測定血小板的黏附和聚集。該方法簡單快捷，僅需要 0.2ml血液17。臨床用 來抗血小板藥物的治療、血栓前狀態(tài)及血小板功能亢進等疾?。?8和心胸外科出血的監(jiān)測

19、：19。剪切誘導(dǎo)血小板聚集測定法該方法采用旋轉(zhuǎn)式鐵板流體測定儀，將 PRP注入平板的內(nèi)筒內(nèi)，氨窺激光透過其中，通過圓錐的 旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生剪切力，從而引起血小板聚集，血小板聚集引起PRP透光度的變化，由電腦進行分析處理，最后繪制成聚集曲線：20。剪切誘導(dǎo)的血小板聚集對于血栓性血小板疾病，如腦血栓、動脈粥樣硬 化的防治具有重要意義。但是溫度和血小板數(shù)目對該法的測定結(jié)果都有較大的影響。散射性粒子檢測法該方法最先由Ozaki 21提出，儀器采用He Ne半導(dǎo)激光器（波長為675 nm）通過聚光鏡折 射成直彳全約為40 am的激光束，照射到裝有富血小板血漿（PRP）比色杯。該方法能通過血小板聚集 顆粒的大小及

20、其生成數(shù)量兩個指標(biāo)來評價血小板的聚集功能，血小板聚集顆粒的大小及數(shù)量與散射強精選文檔，供參考！度相一致，與比濁法相比，靈敏度有了很大提高。微量板滴定法即應(yīng)用全自動定量繪圖酶標(biāo)儀根據(jù)比色法測定血小板聚集率。與比濁法相比較，微量板滴定法更 靈敏、有效且重現(xiàn)性好，可用于檢測已知血小板功能拮抗劑，如呻喙美辛、阿斯匹林等，且可以檢測 未知血小板調(diào)節(jié)因子：8 o該方法的最大優(yōu)點是可以一次測定多個樣品，尤適用于臨床和科研中對批量血小板聚集率的測定。但是要求血小板計數(shù)在一定范圍內(nèi)的結(jié)果才比較準(zhǔn)確。血小板釋放功能的測定血小板胞漿內(nèi)含有a顆粒、致密顆粒及溶酶體顆粒，當(dāng)加入誘聚劑后會引起這些顆粒內(nèi)容物的釋 放，即血

21、小板的釋放。a顆粒的釋放主要通過 0血小板球蛋白（0 TG）和血小板4因子（PF4）來 測定。用商品化的放射性免疫法和 ELISA法試劑盒對其進行定量測定已被推廣使用，其結(jié)果對樣品 的處理過程高度敏感，但是結(jié)果易受機體代朗f功能和血小板破壞的影響。研究發(fā)現(xiàn) P選擇素即血小 板a顆粒膜蛋白 140 （GMP 140）,表達在靜息血小板膜上。當(dāng)血小板活化后，P選擇素在血小板膜表面表達，并同時釋放a顆粒的內(nèi)容物，P選擇素可作為血小板活化的分子標(biāo)志物：22。在血栓性血小板減少性紫瘢（TTP）、子癇等血栓性疾病及糖尿病病人的P選擇素增加：23, 24。因此，木測P選擇素陽性血小板數(shù)量是活化血小板最為客觀

22、、直接、特異的檢測方法。致密顆粒的釋 放可以通過5羥色胺（5 HT）或腺昔酸的測定加以判斷。5 HT測定應(yīng)用熒光光度法測定，與同 樣處理的標(biāo)準(zhǔn)物比較，求得血小板或血漿中5 HT含量，用于篩選血小板貯存池缺陷導(dǎo)致膠原誘導(dǎo)的血小板致密顆粒釋放障礙、先天性或后天性TXA2合成障礙、ADP受體缺陷等疾病。應(yīng)用熒光聚集儀可同時測定血小板聚集和 ATP的釋放反應(yīng)。血小板其他功能檢測血小板其他功能的檢測包括血小板凝血活性檢測、血小板鈣流檢測以及血小板膜糖蛋白的檢測等。精選文檔，供參考！血小板第3因子利用試驗用于檢測血小板凝血活性，使用正常人和病人富含血小板血漿（PRP）和乏血小板血漿（PPP）相互交叉配合，

23、以白陶土作活化劑促使 PF3形成來測定血漿凝固時間，通過比較各組時 差，從而得出PF3是否有缺陷，臨床上用于診斷先天性 PF3缺乏癥、血小板無力癥、骨髓增生異常綜 合征等。大部分血小板內(nèi)游離的 Ca2+貯存在致密管道系統(tǒng)內(nèi)，血小板活化后，Ca2+從致密管道系統(tǒng)釋放至胞質(zhì)內(nèi)，細胞質(zhì)內(nèi) Ca2+水平增加。利用熒光探針標(biāo)記血小板內(nèi)鈣離子，在誘導(dǎo)劑作用下，血小板 的鈣離子通道打開，使用共聚焦顯微鏡觀察血小板熒光的強弱變化并經(jīng)計算機控制系統(tǒng)及圖像分析系 統(tǒng)觀察血小板濃度和鈣流的變化。測定胞內(nèi)Ca2+的方法可用于臨床診斷與 Ca2+代謝有關(guān)的血小板疾 病。血小板膜含有多種糖蛋白，通過 SDS聚丙烯酰胺凝膠

24、電泳（PAGE）可以將血小板溶液中的糖 蛋白按分子量大小進行分離。血小板膜GPIb和GPIIb HIa復(fù)合物的測定用于巨大血小板綜合癥和血 小板無力癥的診斷。流式細胞術(shù)在血小板功能檢測中應(yīng)用隨著流式細胞術(shù)的成熟以及各種熒光標(biāo)記的單克隆抗體的研制成功并可以直接標(biāo)記熒光素分子， 為血小板活化機制研究開辟了新的局面。傳統(tǒng)的流式細胞術(shù)即使用洗滌的血小板或 PRP檢測血小板膜糖蛋白的表達。樣本在離心、洗滌等操作過程中極易活 化，導(dǎo)致血小板體外激活，影響臨床診斷價值。全血法流式細胞術(shù)主要是對血小板特異性膜糖蛋白和活化標(biāo)志物進行免疫熒光標(biāo)記，用流式細胞儀測定熒光強度和特異性熒光抗體結(jié)合陽性的血小板百分率，來

25、測定血循環(huán)中血小板的活化狀態(tài)以及血小板對激活劑的精選文檔，供參考！應(yīng)答反應(yīng)。與常規(guī)血小板功能測定法相比，全血法流式細胞術(shù)有許多優(yōu)點：直接應(yīng)用全血，反映了血小板生理狀態(tài)下的功能， 同時簡化了標(biāo)本的處理， 最大限度的減少了人為活化血小板； 避免了因離心導(dǎo)致的血小板體外激活， 并防止血小板亞群的丟失；標(biāo)本用量少， 尤其適用于兒童和血小板減少癥的患者；亦能檢測出少到1%的活化的血小板亞群，能分析單個或亞群血小板膜活化標(biāo)志物的測定。此外，血小板活化時其細胞內(nèi)的鈣離子濃度發(fā)生很大變化 25 ，借助于鈣離子敏感熒光探針的幫助，用FCM測定鈣離子濃度，可以作為活化血小板監(jiān)測的非免疫性指標(biāo)。然而，Ca2+流變化極為迅速，使得 FCM 定量測定較為困難。但