ELISA試劑配制及實(shí)驗(yàn)流程—BDY

1、ELISA試劑配制及實(shí)驗(yàn)流程ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡(jiǎn)稱。以雙抗體夾心法舉例說(shuō)明。試劑配制：(1)包被緩沖液(PH9.6 +0.2 0.05M 碳酸鹽緩沖液)：Na2CO31.59gNaHCO3 2.93g加蒸餾水至1000ml。（用時(shí)稀釋成1x，加0.1%BSA）(2)洗滌緩沖液(PH7.4 0.15M PBST)： 0.05%Tween-20 0.5ml加在PBS緩沖液1000ml中。PBS緩沖液：KH2PO4 0.27gNa2HPO4·12H2O 3.58gNaCl 8gKCl 0.2g加蒸餾

2、水至1000ml。(3)封閉緩沖液：牛血清白蛋白(BSA) 2% 2g（或5%脫脂奶粉）加洗滌緩沖液100ml。(4)稀釋液：牛血清白蛋白 0.1 % 0.1g加PBS 緩沖液100ml。(5)底物緩沖液(PH5.0)： 0.2M Na2HPO4(無(wú)水28.4g/L，帶12結(jié)晶水71.7g/L) 取25.7ml 0.1M 檸檬酸(無(wú)水19.2g/L，帶1結(jié)晶水21.01g/L) 取24.3ml 加蒸餾水至100ml。 (或Na2HPO4·12H2O 1.84g 檸檬酸·H2O 0.51g 加蒸餾水至100ml)(6)TMB(四甲基聯(lián)苯胺)顯色液（顯藍(lán)色）：HRP- TMB(

3、2mg/ml水) 0.05ml 底物緩沖液 0.95ml 30% H2O2 0.001ml 總體積1ml。TMB, 1mg/ml-DMSO溶解(7) 或配OPD(鄰苯二胺)顯色液（顯黃棕色）（現(xiàn)配避光）： OPD（干粉） 0.004g 底物緩沖液 10ml 30% H2O2 0.015ml 總體積10ml。 (8)終止液(2MH2SO4)：在178.3ml水中，逐滴加入濃硫酸(18M，約98%)21.7ml，邊加邊搖。操作步驟：1.包被：用包被液將抗體（一抗）稀釋至蛋白質(zhì)含量為110g/ml。在每板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4過(guò)夜（或37溫育23小時(shí)）。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌液沖洗3次，中間

4、振蕩。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。2. 封閉：加0.3ml封閉液于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37溫育2小時(shí)。然后洗滌。3.加樣：加待檢樣品0.1ml于反應(yīng)孔中，置37溫育12小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔（不加樣品），陰性對(duì)照孔（野生型）及陽(yáng)性對(duì)照孔)。4. 加一抗：各反應(yīng)孔中加入新稀釋的抗體0.1ml。置37溫育12小時(shí)。然后洗滌。5.加酶標(biāo)二抗：各反應(yīng)孔中加入新稀釋的酶標(biāo)抗體0.1ml。37溫育45分鐘1小時(shí)，洗滌5次。6.加底物液顯色：各反應(yīng)孔中加入剛剛配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD顯色液），37暗處溫育520分鐘，或室溫暗處1040分鐘充分變色。7.終止反應(yīng)：各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.

5、05ml。（TMB底物藍(lán)色變黃色，OPD底物黃色變棕色）8.結(jié)果判定：白色背景上肉眼直接觀察結(jié)果，反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，可以依據(jù)所呈顏色的深淺，用“+”、“-”號(hào)表示。測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，TMB底物法使用450nm測(cè)各孔OD值，OPD底物法使用492nm檢測(cè)。通常大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性(以空白對(duì)照孔調(diào)零后計(jì)算)。間接法操作步驟：1.包被：用包被液將樣品稀釋（梯度稀釋，比例自己定）， 4過(guò)夜（或37溫育23小時(shí)）。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌液沖洗3次（5至7次），中間振蕩。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。2. 封閉：加0.3ml封閉液于上述已

6、包被之反應(yīng)孔中，置37溫育2小時(shí)。然后洗滌。 3. 加一抗：各反應(yīng)孔中加入新稀釋的抗體0.1ml。置37溫育12小時(shí)。然后洗滌。4.加酶標(biāo)二抗：各反應(yīng)孔中加入新稀釋的酶標(biāo)抗體0.1ml。37溫育45分鐘1小時(shí)，洗滌5次。5.加底物液顯色：各反應(yīng)孔中加入剛剛配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD顯色液），37暗處溫育520分鐘，或室溫暗處1040分鐘充分變色。6.終止反應(yīng)：各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。（TMB底物藍(lán)色變黃色，OPD底物黃色變棕色）7.結(jié)果判定：白色背景上肉眼直接觀察結(jié)果，反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，可以依據(jù)所呈顏色的深淺，用“+”、“-”號(hào)表示

7、。測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，TMB底物法使用450nm測(cè)各孔OD值，OPD底物法使用492nm檢測(cè)。通常大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性(以空白對(duì)照孔調(diào)零后計(jì)算)。-羅凱明師兄-包被緩沖液（NaHCO3-Na2CO3緩沖液） 量取0.2M NaHCO3 17mL，0.2M Na2CO3 8 mL溶于75mL雙蒸水中PBS(PH7.2) 稱取NaCl 8.0g, Na2HPO4 12H2O 2.9g，KCl 2.0g，KH2PO4 0.2g溶于1000 mL雙

8、蒸水中洗滌液（PBST PH7.2） 量取0.5mL Tween-20溶于1000 mL PBS中酶標(biāo)抗體稀釋液 量取4mL新生小牛血清CS溶于96mL PBST中底物液    稱取OPD 4mg溶于40 mL 3%H2O2的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中，臨用前配制磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液 量取24.3 mL 0.1M檸檬酸鈉，25.7 mL 0.2M Na2HPO4，加雙蒸水至100 mL明膠封閉液 稱取1g明膠溶于100

9、0;mL PBS(PH7.2)中小牛血清封閉液 量取10mL小牛血清溶于90mL PBS(PH7.2)中酶反應(yīng)終止液（2M H2SO4） 量取10mL濃H2SO4溶于80mL雙蒸水中ELISA步驟： -根哥給的方法-1）實(shí)驗(yàn)材料目的抗原BSA或其他對(duì)照抗原(15ug/ml)PBS96孔ELISA板；96孔ELISA封板膜；移液槍封閉液：5%脫脂牛奶(w/v)-PBS抗血清0.1% (v/v) Tween20-PBSHRP-兔抗鼠多克隆抗體TMB(A，TMB：稱取固體TMB 溶于DMSO 配成1mg/ml液體，避光保存，最好4度用前要檢查其狀態(tài)，若有凝固，可用手溫將

10、其融化；B，底物緩沖液為0.1M 醋酸鈉-醋酸緩沖液，pH6.0；使用時(shí)用底物緩沖液稀釋A液至100g/ml；50ml緩沖液加入10l 30% H2O2)。稀硫酸(1M)酶標(biāo)儀2）實(shí)驗(yàn)步驟(1). 用PBS緩沖液將抗原(目的抗原、BSA或其他對(duì)照抗原)稀釋至0.2-10g/ml。(2). 每孔加入100l抗原稀釋液，4包被過(guò)夜。(3).以用PBS洗3次(每次每孔200l，每次洗5min)。每孔加入200l封閉液，37封閉2h。(4). 棄封閉液，以0.1% Tween 20-PBS洗板3次后(每次每孔200l，每次洗5min)，然后用PBS洗3次(每次每孔200l，每次洗5min)。每孔加入100l已稀釋好的抗血清，37孵育2h。(5). 以0.1% Tween 20-PBS洗板3次后(每次每孔200l，每次洗5min)，然后用PBS洗3次(每次每孔200l，每次洗5min)。6. 棄洗滌液，每孔加入100l按說(shuō)明書比例稀釋的HRP-兔抗鼠多克隆抗體，37孵育h。7. 以0.1% Tween 20-PBS洗板3次后(每次每孔2