紫萼蘚科植物DNA提取及遺傳多樣性的分析

1、收稿日期:2005-08-02基金項目:黑龍江省骨干教師項目資助。作者簡介:張晗(1979- , 女, 植物遺傳學(xué)碩士研究生, 從事種質(zhì)檢測研究工作。山東農(nóng)業(yè)科學(xué)Shandong Agricult ural Sciences 2006年第1期紫萼蘚科植物DNA 提取及遺傳多樣性的分析張晗1,2, 高永超3, 沙偉2, 李汝玉1, 戴雙1(11山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 山東濟南250100;21齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院生物系, 黑龍江齊齊哈爾161006;31山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心, 山東濟南250014摘要:采用隨機擴增多態(tài)性DNA (RA PD 方法對兩種紫萼蘚科植物

2、的6個居群的多樣性分析。用11個隨機引物擴增出清晰譜帶52條。:然聚為兩大支, 一支為東亞砂蘚, 另一支為毛尖紫萼蘚。尖紫萼蘚的遺傳變異情況。關(guān)鍵詞:DNA提取; 紫萼蘚科;RA PD ; 中圖分類號:Q78;Q94935:1001-4942(2006 01-0007-03Study and genetic diversity in grimmiaceaeZHAN G Han 1,2, Gao Y ong 2chao 3,SHA Wei 2,L I Ru 2yu 1, DA I Shuang 1(11Crop Research I nstitute , S handong A cadem y

3、of A g ricultural S ciences , J inan 250100, China;21De partment of B iology , College of L i f e Science and Engineering , Qiqi har Universit y , Qiqi har 161006;31B iotechnology Research Center of S handong A cadem y of Sciences , J inan 250014Abstract The genetic diversity of sixty individuals of

4、 six pop ulations of Gri m mi aceae were ana 2lyzed by rando m amplified polymorp hic DNA (RA PD markers 152loci were amplified by using 11random p rimers 1The result s showed t hat six nat ural pop ulations of Gri m mi aceae were clustered into two off shoot s R acomit ri um canescens and Gri m mi

5、a pili f era ,after t he genetic variability analysis and cluster analysis.K ey w ords Ext raction DNA ; Gri m mi aceae ;RA PD ; Genetic diversity 紫萼蘚科(Gri m mi aceae 紫萼蘚屬(Gri m 2mi a 和砂蘚屬(R acomit ri um 的毛尖紫萼蘚(Gri m mi a pili f era 和東亞砂蘚(R acomit ri um canescens 為典型的小型旱生蘚類, 植物體粗壯, 密集或松散叢生, 主要生長在裸露的

6、巖石表面或巖石表面的薄土或砂土上。上無樹木遮蔽, 下無濕潤的土壤, 而且, 單層細胞的葉片沒有特殊的抗旱、抗寒及抗紫外線的結(jié)構(gòu), 其生存機理是否與其特殊的遺傳物質(zhì)有關(guān)還有待進一步研究。以往國內(nèi)對苔蘚植物的研究大都集中在分布、形態(tài)、細胞等方面13, 分子生物學(xué)方面的研究較少, 對紫萼蘚科植物的研究更少, 到目前為止對紫萼蘚科植物分子方面的研究未見報道。本試驗采用隨機擴增多態(tài)性DNA (RA PD 方法對上述兩種紫萼蘚科植物的6個居群的60個個體進行遺傳多樣性研究, 以初步了解兩種蘚類植物的DNA 提取條件和居群的遺傳多樣性。1材料與方法111試驗材料采自五大連池(位于黑龍江省的北部地區(qū), 地處中

7、高緯度。地理坐標(biāo)為東經(jīng)1260612626, 北緯48364850 的石龍山、黑龍山和火燒山的火山巖上, 樣品距離1015m , 采集后室溫培養(yǎng), 其上覆蓋一層塑料膜, 以保持水分。112試驗方法 711211DNA 的提純普通的C TAB 4法提取毛尖紫萼蘚和東亞砂蘚的DNA 較容易降解, 針對這兩種蘚類都屬于小型旱生蘚類及其特殊的生活環(huán)境2, 主要從以下幾個方面找出最佳試驗條件: ED TA 濃度分別采用60mmol/L (E 1 、50 mmol/L (E 2 、40mmol/L (E 3 、30mmol/L (E 4 、20mmol/L (E 5 進行試驗; -巰基乙醇的濃度為0(1

8、、015%(2 、1%(3 、115%(4 、2%(5 ; 將核糖核酸酶配制成10、20、30、40、50g/ml 5種濃度; 對不同生活狀態(tài)材料的DNA 進行提取。用紫外分光光度計檢測DNA 模板的濃度, 用018%的瓊脂糖凝膠電泳、EB 染色、紫外燈下觀察照相, 結(jié)果DNA 帶清晰、無拖尾現(xiàn)象, 表明DNA 質(zhì)量較好。11212引物篩選100隨機引物(10bp 、25l選。11條引物, 全兩種紫萼蘚科植物的總DNA 樣品的擴增, 即:SBSA -04、SBSA -11、SB 2 SA -12、SBSB -01、SBSB -12、SBSB -18、SBSC -01、SBSC -02、SBSC

9、 -04、SBSC -11和SBSC -14(其序列如表1 。表1篩選出的各個引物及其序列引物序列引物序列SBSA -04AA TCGGGCT G SBSC -01TCGGCGA TA G SBSA -11CAA TCGCCGT SBSC -02GT GA GGCGTC SBSA -12TCGGCGA TA G SBSC -04CCGCA TCTAC SBSB -01GT T TCGCTCC SBSC -11AAA GCT GCGG SBSB -12TCGGCGA TA G SBSC -14T GCGT GCT T G SBSB -18CCACA GCA GT11213PCR 擴增及產(chǎn)物檢測用

10、篩選好的11條隨機引物(10bp 對全部的樣品DNA 進行PCR 擴增, 根據(jù)所需稀釋基因組DNA 的濃度, 反應(yīng)總體積為25l , 其中dN TP 為75mol/L , 引物為0175mol/L , 基因組DNA 為30ng , T aq 酶115 U , 其他成分為無菌雙蒸餾水。擴增的程序為: 944min 1個循環(huán); 941min ,35115min , 722min ,40個循環(huán); 7210min 1個循環(huán); 4保存。擴增產(chǎn)物檢測:擴增結(jié)束后, 在反應(yīng)混合物中加入5l/ml 上樣緩沖液(上樣液含0125%溴酚藍和40%(W/V 蔗糖水溶液 , 混勻。取15l 點入含0125g/ml 溴

11、化乙錠的115%瓊脂糖凝膠中, 用1TB E 電泳緩沖液在3V/cm (84V 的電場下電泳2h 左右, 然后在紫外凝膠成像系統(tǒng) 下觀察照相和分析。11214數(shù)據(jù)處理為了保證良好的可重復(fù)性, 選取清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性好的譜帶用于最終的數(shù)據(jù)分析。根據(jù)Tadara D G L2000標(biāo)準(zhǔn)分子量, 依據(jù)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn), 有帶記為“1”, 無帶記為“0”, 缺失數(shù)記為“1”, 形成0/1矩陣圖, 根據(jù)軟件的需要輸入計算機。用POP GEN E 1100版軟件計算東亞砂蘚和毛尖紫萼蘚居群分支情況, 按照U P GMA 法進行聚類分析。2結(jié)果與分析211的最佳條件, L , 015%-巰基乙醇濃度50mg/ml

12、 , 新鮮材料。在此, 重新對上述樣品進行電泳, 結(jié)果顯示, DNA 的質(zhì)量和純度較高, 譜帶清楚且均勻。經(jīng)紫外分光儀檢測,A 260/A 280比值在11751185之間(圖1 。圖1提取基因組DNA 的紫外吸收光譜212擴增結(jié)果及分析用篩選好的11條引物對紫萼蘚科植物的6個自然居群的樣品進行RA PD 擴增。每個引物的擴增片段在39條之間, 利用11個隨機引物共獲得52條譜帶, 即共檢測到52個位點, 平均每個引物檢測到4173個位點。213兩種紫萼蘚科植物遺傳多樣性分析由表2可以看出, 各居群間的遺傳多樣性差別比較大。其中, 火燒山東亞砂蘚的居群(H S 具有最多的多態(tài)位點數(shù)(41 以及

13、最高的多態(tài)位點數(shù)比率(78185% 、Nei s 基因多樣性(012654 、Shannon s 指數(shù)(014021 , 遺傳多樣性最高; 石龍東亞砂蘚居群(S S 的各指標(biāo)均最低, 遺傳多樣性最低; 火燒山毛尖紫萼蘚居群(H Z 的遺傳多態(tài)性也較低, 石龍毛尖紫萼蘚居群(S Z 、黑龍山東亞砂蘚居群(HS 和黑龍山毛尖紫萼蘚居群(HZ 的各指標(biāo)居中, 遺傳多樣性逐漸減小。由表3的從屬間分析可知, 毛尖紫萼蘚和東 8亞砂蘚之間存在明顯的遺傳差異, 且毛尖紫萼蘚的遺傳多樣性較豐富, 東亞砂蘚的遺傳多樣性相對貧乏。表2紫萼蘚科植物6個自然群體的遺傳變異居群 個體數(shù)總位點數(shù)多態(tài)位點數(shù)多態(tài)位點比率(%

14、Nei s 基因多樣性Shannon s 指數(shù)HS 10523669123012433013657 S 011925012723 HZ 10523567131012282013472 S 011839012651 S S 10523057169012149013190 S 01204901293 S Z 10523771115012475013730 S 011889012672 H S 10524178185012654014021 S 011809012496 H Z 1052315916201206101 S 0101居群平均1052356713101S 001注:S, ; HZ 指黑龍

15、山毛尖紫萼蘚;S S ; S Z 指石龍毛尖紫萼蘚; H S 指火燒山東亞砂蘚; H Z表3東亞砂蘚和毛尖紫萼蘚的遺傳變異居群 個體數(shù)總位點數(shù)多態(tài)位點數(shù)多態(tài)位點百分比率Nei s 基因多樣性Shannon s 指數(shù)東亞砂蘚3052458615012510013902 S 011686012275毛尖紫萼蘚30525198108012833014406 S 0149001878214居群間聚類分析聚類結(jié)果顯示, 紫萼蘚科兩種植物的6個自然居群顯然聚為兩大支。一支為東亞砂蘚, 黑龍山東亞砂蘚居群與火燒山東亞砂蘚居群先聚類, 然后再與石龍東亞砂蘚聚類; 另一支為毛尖紫萼蘚, 黑龍山毛尖紫萼蘚居群先與

16、石龍山毛尖紫萼蘚居群聚類。表明距離較近的居群遺傳上很明顯地優(yōu)先聚類。3結(jié)論與討論311兩種紫萼蘚科植物的遺傳多樣性苔蘚植物是植物界的一個重要門類, 屬孢子植物, 為高等植物的一個重要分支。一般結(jié)構(gòu)較簡單, 以矮小的身軀和廣泛的適應(yīng)性為特征。它以獨特的生活方式代表著植物界從水生向陸生的過渡類型。苔蘚植物具有豐富的遺傳多樣性5, 其生物多樣性較人們普遍的概念和印象要豐富和復(fù)雜得多。尤其在我國, 氣候類型多樣, 地貌類型豐富, 苔蘚植物資源幅員遼闊, 是世界上苔蘚植物 種類最豐富的國家之一。試驗結(jié)果表明, 火燒山東亞砂蘚的居群在6個居群中具有最高的遺傳多樣性, 石龍東亞砂蘚的居群具有最低的遺傳多樣性

17、, 火燒山毛尖紫萼蘚的居群的遺傳多樣性較低, 石龍毛尖紫萼蘚居群、黑龍山東亞砂蘚居群及黑龍山毛尖紫萼蘚居群的遺傳多樣性逐漸減小, 遺傳差異的大小可能與各自的生長環(huán)境、所處的地理位置及自身的生理機制有關(guān)。312RA PD 試驗注意事項在試驗及數(shù)據(jù)處:(1 DNA 的純度6,7arg y rop hy ll a , 模板中; 而DNA 模板中殘、SDS 、CTAB 、異丙醇等往往影響擴增結(jié)果, 這主要是因為這些未被除盡的小分子有機物, 直接影響了T aq 聚合酶的活性。因此, 提取DNA 時, 要把小分子有機物的含量降到最低, 從而減小對PCR 擴增的影響。(2 條件的一致性:試驗藥品、流程要相同

18、; 電壓恒定、電流時間一致、瓊脂糖的濃度一致、讀帶的標(biāo)準(zhǔn)始終一致, 最大限度減少人為誤差。(3 嚴(yán)防污染:由于采用較低的退火溫度及短的隨機引物,RA PD 對污染非常敏感。共生物、寄生物以及標(biāo)本保存過程中出現(xiàn)難以預(yù)料的變化, 都可能影響RA PD 結(jié)果。提取模板DNA 之前, 要用雙蒸無菌水清洗標(biāo)本; 加樣過程中注意防止污染; 試驗中應(yīng)設(shè)空白對照, 以排除系統(tǒng)誤差。(4 勤換電泳緩沖液:多次使用的電泳緩沖液內(nèi)存在雜質(zhì), 易產(chǎn)生拖尾或者譜帶模糊不清的現(xiàn)象, 影響電泳效果。參考文獻:1中國科學(xué)院昆明植物研究所編著1云南植物志M 1昆明:云南科學(xué)出版社,2002,18:330234312J Fridovich 1The biology of oxygen radical J 1Science , 1975,201:875288013Pallitt K E , Y oung A J ,Alscher R G 1Anti