MSCs修飾受體胸腺對(duì)異種心臟移植免疫排斥反應(yīng)的綜述研究

1、MSCs修飾受體胸腺對(duì)異種心臟移植免疫排斥反應(yīng)的綜述研究    選用豚鼠到大鼠心臟異位移植模型作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。目前超急性排異反?yīng)（HAR）已能被中華眼鏡蛇毒因子（CVF）所克服，急性血管性排斥反應(yīng)（AVR）是目前異種移植所面臨的主要問(wèn)題。本研究通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞修飾胸腺來(lái)研究該方法對(duì)AVR的影響，以了解此方法對(duì)異種移植的影響。1?材料與方法1.1?主要試劑Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（SIGMA公司）；DMEM培養(yǎng)液，胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco公司）；中華眼鏡蛇毒因子（CVF）（昆明倍捷公司）；CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）。1.2?手術(shù)

2、材料二氧化碳培養(yǎng)箱（Heraeus.BB 5060）；8-0無(wú)創(chuàng)傷縫線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司）；手術(shù)顯微鏡（YZ 20T-型）；超速冷凍離心機(jī)（Juoan MR1812 Inc.France）。1.3?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物豚鼠選擇要求：雄性，健康，體重控制在400450 g；大鼠選擇要求：健康，SD雌性大鼠，體重控制在250300 g。1.4?實(shí)驗(yàn)方法1.4.1?全骨髓貼壁篩選法?MSCs分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增。取三色豚鼠四肢長(zhǎng)骨，抽取得到骨髓加入Ficoll分離液中進(jìn)行30 min離心作用；用DMEM液調(diào)整吸取到的單個(gè)核細(xì)胞層中單核細(xì)胞密度，按1×106/L的密度分裝接種于培養(yǎng)瓶中。在CO2

3、（體積分?jǐn)?shù)為5%）、含飽和濕度的37恒溫培養(yǎng)箱中對(duì)培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。當(dāng)這些傳代細(xì)胞完全融合時(shí)得到的即為BM-MSCs1-2，然后進(jìn)行胰酶消化，吹打，制成細(xì)胞懸液。1.4.2?胸腺修飾?大鼠取胸骨上部正中切口，暴露胸腺，胸腺內(nèi)注射0.1 mL MSCs（1×105個(gè)/0.1 mL/次）。用4號(hào)針頭緩慢注入，常規(guī)結(jié)扎穿刺點(diǎn)。注射結(jié)束后用生理鹽水反復(fù)沖洗胸腺周圍組織。1.4.3?實(shí)驗(yàn)分組?供體豚鼠和受體SD大鼠各20只隨機(jī)分成四組，每組5只，A組（對(duì)照組）；B組（胸腺修飾IT組）；C組（CVF組）；D組（IT加CVF組）。A組做豚鼠到大鼠異位異種腹腔心臟移

4、植，不對(duì)受體做特殊處理；B組供體豚鼠MSCs胸腺修飾受體大鼠第15天后，進(jìn)行豚鼠到受體大鼠異位異種腹腔心臟移植；C組術(shù)前24 h受體僅接受CVF預(yù)處理，然后行異種異位移植；D組（CVF+IT組）：受體接受供體MSCs胸腺注射及術(shù)前CVF預(yù)處理，再行異種異位移植。1.4.4?建立大鼠腹腔異位心臟移植模型（Ono's術(shù)式）?采用成熟的改良Ono's術(shù)式進(jìn)行手術(shù)，供心采取：豚鼠麻醉，固定，消毒，抗凝，暴露胸腔。保留升主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈，其余血管均予以結(jié)扎。經(jīng)主動(dòng)脈反復(fù)將供體心臟血液沖洗干凈（采用肝素生理鹽水），洗后放置冰生理鹽水中備用。大鼠麻醉，固定，消毒后進(jìn)行受體心臟移植，顯微鏡下進(jìn)行

5、手術(shù)，進(jìn)腹，將供體心臟的升主動(dòng)脈與受體大鼠腹主動(dòng)脈，供心肺動(dòng)脈與供體下腔靜脈行端側(cè)吻合，血管吻合采用二定點(diǎn)吻合法。1.5?檢測(cè)指標(biāo)和術(shù)后觀察1.5.1?移植術(shù)后供心存活時(shí)間的觀察?供體移植心臟開始復(fù)跳至心臟停跳的時(shí)間作為移植心臟存活的時(shí)間。術(shù)后通過(guò)觸摸大鼠腹部觀察移植心臟是否跳動(dòng)，視心臟跳動(dòng)情況，以每2小時(shí)、1小時(shí)、10分鐘為時(shí)間段，逐步縮短觀察間隔時(shí)間。1.5.2?供體心臟的病理觀察?供體豚鼠心臟停跳后立即從腹腔取出，10%甲醛溶液固定供體心臟心肌組織，石蠟包塊固定后的心肌組織，并做石蠟切片。光學(xué)顯微鏡下觀察染色常規(guī)伊紅-蘇木素（HE）后心肌結(jié)構(gòu)的病理變化。1.5.3?供受體淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)

6、（MLC）?分兩組進(jìn)行淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)：對(duì)照組：不做任何處理的大鼠淋巴細(xì)胞+豚鼠淋巴細(xì)胞；B胸腺修飾組：經(jīng)供體豚鼠MSCs胸腺注射后第15天大鼠的脾臟淋巴細(xì)胞+豚鼠淋巴細(xì)胞。首先將豚鼠、大鼠的脾臟制成淋巴細(xì)胞懸液，刺激細(xì)胞為供體豚鼠淋巴細(xì)胞，反應(yīng)細(xì)胞受體大鼠淋巴細(xì)胞，絲裂霉素處理供體淋巴細(xì)胞，供、受體淋巴細(xì)胞均制備成終濃度為1.0×106/mL的細(xì)胞懸液。在培養(yǎng)孔中注入均為100 L的供體刺激細(xì)胞和受體反應(yīng)細(xì)胞，在5% CO2，濕度100%、溫度37的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，加入CCK-8后繼續(xù)進(jìn)行4 h的培養(yǎng)后吸取上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）液，在酶標(biāo)儀上測(cè)吸光度（OD）值。根

7、據(jù)公式：刺激效應(yīng)=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/空白對(duì)照組OD值×100%，計(jì)算刺激效應(yīng)。1.6?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2?結(jié)果2.1?MSCs分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增（全骨髓貼壁篩選法）原代細(xì)胞培養(yǎng)約1416 d后，融合率可達(dá)80%90%，融合后細(xì)胞群呈旋渦狀，見(jiàn)圖1；2代細(xì)胞24 h內(nèi)培養(yǎng)即可呈現(xiàn)完全貼壁形態(tài)分布，見(jiàn)圖2；310代有45 d的細(xì)胞生長(zhǎng)周期，呈現(xiàn)的比較單一的細(xì)胞形態(tài)，大部分細(xì)胞呈梭形，少部分呈多角形，見(jiàn)圖3。2.2?4組大鼠移植心臟的存活時(shí)間移植

8、心臟復(fù)跳開始計(jì)時(shí)，到移植手術(shù)后通過(guò)腹部觸診心臟停止跳動(dòng)為止，此段時(shí)間為移植心臟存活時(shí)間的測(cè)定依據(jù)。4組大鼠移植心臟存活時(shí)間顯示，A組平均存活時(shí)間最低，B組平均存活時(shí)間也較短，但與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。C、D組平均存活時(shí)間明顯增加，與A、B組比較明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。D組平均存活時(shí)間最長(zhǎng)，與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。2.3?各組豚鼠心肌結(jié)構(gòu)顯微觀察結(jié)果正常心臟冠狀動(dòng)脈內(nèi)管壁光整，無(wú)中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞附壁、浸潤(rùn)現(xiàn)象，只有少量紅細(xì)胞附著于管壁上，無(wú)明顯血栓形成，高倍鏡下見(jiàn)小冠狀動(dòng)脈、靜脈壁內(nèi)膜光整無(wú)破壞。

9、見(jiàn)圖4。顯微鏡下觀察到A、B兩組供體心臟均有HAR現(xiàn)象發(fā)生，移植心臟內(nèi)可見(jiàn)緊密連粘的血栓與管壁，血管內(nèi)血栓廣泛形成，血管外有出血，管壁水腫導(dǎo)致觀察到少量的單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞附壁、浸潤(rùn)，管壁不光整。心肌細(xì)胞間血管見(jiàn)血栓形成，內(nèi)膜不完整，有破壞、突起、增厚，內(nèi)膜表面見(jiàn)膜樣隔離層，見(jiàn)圖5。C、D組供心發(fā)生AVR，而發(fā)生AVR的心臟，導(dǎo)致心肌缺血性梗死現(xiàn)象出現(xiàn)，觀察到心肌細(xì)胞內(nèi)有大量的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，還出現(xiàn)凝固性壞死，有血栓形成于微血管內(nèi)，血管外少量出血，見(jiàn)圖6。2.4?供受體脾淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MLC）效應(yīng)細(xì)胞為第15天經(jīng)胸腺修飾后的大鼠脾淋巴細(xì)胞，刺激細(xì)胞為豚鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)

10、絲裂霉素處理后的細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與刺激細(xì)胞和CCK-8行單向混合后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。空白組、對(duì)     照組與胸腺修飾組的MLR測(cè)定結(jié)果平均值見(jiàn)表2，分別為0.40±0.23、2.76±0.10、1.93±0.03，3組的MLR測(cè)定結(jié)果呈增殖反應(yīng)。胸腺修飾組、對(duì)照組的刺激效應(yīng)平均值分別為：381.20±12.01和590.20±15.38，可見(jiàn)胸腺修飾組的受體淋巴細(xì)胞刺激效應(yīng)平均值較對(duì)照組顯著減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。3?討論眾多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的大量系統(tǒng)研究證實(shí)，同種嚙齒目小動(dòng)物胸腺修飾

11、后可在心臟移植模型中成功誘導(dǎo)出“永久性、特異性”的獲得性免疫耐受3-5。其中沈振亞等6研究發(fā)現(xiàn)異種胸腺修飾后的受體，經(jīng)過(guò)輻射照射后，第7天能抑制IgG類天然抗體的生成。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證明豚鼠間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在大鼠胸腺中存活，且豚鼠MSCs在受體大鼠胸腺微環(huán)境的影響下，可以向環(huán)境中多種細(xì)胞分化。從免疫角度看，MSCs本身具有低免疫原性，機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)因?yàn)檫@樣獨(dú)特的免疫學(xué)特性會(huì)降至很低，從而可以更有效的逃避細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK）的殺傷作用7；在免疫系統(tǒng)中MSCs具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞功能的作用8-9，使所在機(jī)體的免疫反應(yīng)降低，表現(xiàn)出一定的免疫調(diào)節(jié)作用。骨髓MSCs本身具有生長(zhǎng)分

12、化可適應(yīng)性的變化并隨環(huán)境定向分的特性。Sallusto F等10研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，大鼠心肌被注入標(biāo)記后的MSCs細(xì)胞，移植細(xì)胞經(jīng)46周后完全分化出與正常心肌細(xì)胞及相似的結(jié)構(gòu)，表明間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)分化隨心肌組織微環(huán)境發(fā)生了適應(yīng)性的變化，隨環(huán)境定向分化。本研究中，研究異種移植排斥反應(yīng)最常見(jiàn)的動(dòng)物模型是豚鼠到大鼠的異種移植模型，探討異種間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)修飾胸腺后能否抑制誘生抗體的產(chǎn)生。選用該模型作為異種心臟移植的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，異種間的研究方向?yàn)楫惙N抗原修飾胸腺，由于骨髓中骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.001%0.01%是MSCs的10，MSCs本身具有生長(zhǎng)分化可適應(yīng)性的變化并隨環(huán)境定向分的功能，這是選擇

13、修飾胸腺的抗原細(xì)胞的基礎(chǔ)，MSCs在受體中更能長(zhǎng)時(shí)間的存在并發(fā)揮“馴化”受體T細(xì)胞的作用。其次是區(qū)別其他胸腺修飾實(shí)驗(yàn)，不對(duì)受體進(jìn)行輻射照射，相對(duì)而言受體具有溫和、低毒等優(yōu)點(diǎn)，適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)胸腺修飾的時(shí)間更好的進(jìn)行陰性選擇，這也受益于MSCs能夠在受體胸腺中長(zhǎng)時(shí)間的存活。筆者認(rèn)為，豚鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的低免疫原性使其能夠在大鼠異種環(huán)境體內(nèi)下存活進(jìn)而分化，是本心臟移植實(shí)驗(yàn)的良好的免疫基礎(chǔ)。根據(jù)其適應(yīng)性分化特性，MSCs向胸腺間質(zhì)細(xì)胞等具有抗原提呈功能的細(xì)胞分化，大鼠T細(xì)胞必須在大鼠本身胸腺內(nèi)成熟發(fā)育，根據(jù)胸腺的陰性選擇機(jī)制，T細(xì)胞受到豚鼠MSCs及其分化細(xì)胞的“馴化”作用，對(duì)豚鼠抗原的中樞性免疫產(chǎn)生耐受作

14、用。筆者認(rèn)為大鼠體內(nèi)豚鼠間充質(zhì)干細(xì)胞能夠生存并參與T細(xì)胞陰性選擇，主要是MSCs本身具有的相對(duì)低抗原性、MSCs有抑制T細(xì)胞反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用，而且胸腺是免疫系統(tǒng)的特區(qū)，有可能會(huì)因MSCs這兩種特性使免疫系統(tǒng)的攻擊減少或避免。本研究單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果可見(jiàn)，大鼠淋巴細(xì)胞經(jīng)供體干細(xì)胞胸腺修飾后，相對(duì)于供體豚鼠免疫反應(yīng)受到抑制，對(duì)豚鼠來(lái)源的抗原反應(yīng)性明顯降低。B組和D組胸腺修飾組中，供體豚鼠脾細(xì)胞被大鼠脾細(xì)胞刺激后的MLR值明顯降低，即針對(duì)豚鼠淋巴細(xì)胞的應(yīng)答受抑制；而未胸腺修飾組，大鼠脾細(xì)胞和供體豚鼠脾細(xì)胞刺激后淋巴細(xì)胞反應(yīng)呈增殖反應(yīng)，4組MLR值比較來(lái)看，A組和C組較B、C組明顯偏高，差異有

15、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。本研究還可以看到A組和B組供心存活時(shí)間兩者之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。因?yàn)閮山M均發(fā)生了超急性排斥反應(yīng)，從A組和B組的病理切片中可以明確判斷出。單純胸腺修飾組也發(fā)生了，而且程度并未減輕。而C組和D組均使用CVF克服HAR，兩者供心呈延遲性異種排斥反應(yīng)改變的病理特征，且比較典型。表明單純進(jìn)行胸腺修飾不能抑制異種移植過(guò)程中HAR的產(chǎn)生。本研究證明在克服超急性排異反應(yīng)后，胸腺修飾的有效性，但仍然發(fā)現(xiàn)胸腺修飾并不能使供心長(zhǎng)時(shí)間存活。從供心存活時(shí)間來(lái)看，A、B組的供心存活時(shí)間較克服了HAR的D組明顯縮短不少，A、B組的供心存活時(shí)間同樣較克服了HAR的

16、C組明顯縮短，但縮短時(shí)間要明顯少于與D組相比，更將充分證明了本研究采用MSCs胸腺修飾的有效性。研究中未能長(zhǎng)期存活的D組的供心，其原因主要可能為AVR中非T細(xì)胞依賴性的抗供體抗體的作用，AVR反應(yīng)中其他免疫細(xì)胞，如NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用等。免疫系統(tǒng)的研究復(fù)雜繁瑣，類似于網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，本研究通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞修飾胸腺來(lái)研究該方法對(duì)AVR的影響，以了解此方法對(duì)異種移植的影響。但要實(shí)現(xiàn)理論上本研究單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果可見(jiàn)，大鼠淋巴細(xì)胞經(jīng)供體干細(xì)胞胸腺修飾后，相對(duì)于供體豚鼠免疫反應(yīng)受到抑制，對(duì)豚鼠來(lái)源的抗原反應(yīng)性明顯降低。參考文獻(xiàn)1 Reisner Y，Gur H，Reich-Zeliger S，et al.Hematopoietic stem cell transplantation across major genetic barriers：tolerance induction by megadose CD34 cells and o