抗人乙酰膽堿受體單鏈抗體1956#在大腸桿菌中的可溶性表達

1、    抗人乙酰膽堿受體單鏈抗體1956#在大腸桿菌中的可溶性表達作者：宋琛, 徐江, 張芳琳, 白文濤, 李柱一* 作者單位：第四軍醫(yī)大學: 唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 陜西 西安 710038; 基礎部病原生物學教研室, 陜西 西安 710032【摘要】 目的: 重組表達抗人乙酰膽堿受體(AChR)單鏈抗體(scFv)1956#, 提高scFv1956#的可溶性表達量。方法: 用PCR擴增含抗人乙酰膽堿受體(AChR) scFv1956#的載體pHEN1中的scFv1956#結構基因, 并將其插入到原核表達載體pET44a(+)。用重新構建的載體轉化E.co

2、li BL21(DE3)pLysS, IPTG誘導表達。用SDSPAGE來比較更換載體及不同溫度和時間對可溶性表達量的影響, 并通過Western blot進行鑒定。結果: PCR產(chǎn)物大小為785 bp, 與預計相符; 所構建質粒經(jīng)測序證實scFv1956#核苷酸序列正確, 并正確插入載體pET44a(+)。誘導后得到的可溶性表達量優(yōu)于原載體pHEN1。結論: 載體pET44a(+)表達的端融蛋白NusA可以幫助scFv1956#的正確折疊, 從而獲得大量可溶性表達。低溫長時間誘導有助于提高可溶性表達的量?！娟P鍵詞】 重癥肌無力 乙酰膽堿受體 單鏈抗體 NusA重癥肌無力(myasthenia

3、 gravis, MG)是由乙酰膽堿受體抗體(AChR Ab)介導, 并有補體參與的自身免疫性疾病1。神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction, NMJ)處, 位于突觸后膜的乙酰膽堿受體(AchR)受到自身抗體AchR Ab攻擊: 一方面, 二價的乙酰膽堿受體(AChR)Ab與乙酰膽堿受體(AChR)的亞單位結合后與其交聯(lián), 拉近乙酰膽堿受體(AChR), 加速受體內(nèi)化、 降解2(抗原調變作用antigen modulation, AM); 另一方面, 乙酰膽堿受體(AChR) Ab的Fc段可以激活補體系統(tǒng), 使大量的補體沉積于NMJ處, 溶解、 破壞突觸后膜和AchR, 導

4、致突觸后膜萎縮3。在AChR Ab這兩方面的作用下, 乙酰膽堿受體(AChR)丟失, 乙酰膽堿(ACh)傳遞障礙, NMJ處化學電沖動解偶聯(lián), 從而引起NMJ傳遞障礙, 表現(xiàn)為肌無力?？挂阴Ｄ憠A受體(AChR)的單鏈抗體(scFv)是由抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)經(jīng)Linker(Gly4Ser)3連接而成, 在較好保留了親代單克隆抗體(mAb)親和活性的基礎上: 由于是單價抗體, 不會引起AChR分子交連后的抗原調變作用4; 由于缺乏Fc段, 也不會激活補體, 攻擊突觸后膜。同時, 通過占位效應, 它可以起到保護乙酰膽堿受體(AChR)免受MG患者血清中自身抗體攻擊的作用5?？挂?/p>

5、酰膽堿受體(AChR)的scFv1956#的親代mAb195對人乙酰膽堿受體(AChR)有高度親和力, 是理想的研究靶點6。本研究中擬采用原核表達載體pET44a(+)融合表達scFv1956#, 以期獲得大量可溶性蛋白, 為scFv1956#的進一步應用提供理論依據(jù)。1 材料和方法1.1 材料 含抗人乙酰膽堿受體scFv1956#的載體pHEN1由希臘巴斯德研究所Socrates J. Tzartos先生惠贈, pET44a(+)載體由第四軍醫(yī)大學免疫學教研室楊安鋼教授惠贈。菌株BL21(DE3)pLysS和HB2151分別由唐都醫(yī)院傳染科及基礎部病原生物學教研室惠贈。Pyrobest高保真

6、DNA聚合酶, 限制性內(nèi)切酶Sma I、 Xho I, T4 DNA連接酶, DL 2000 DNA Marker均購自TaKaRa公司, 質粒小提試劑盒、 DNA回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司。IPTG、 mercaptoethanol購自北京鼎國生物技術公司。HRP標記羊抗小鼠二抗購自cell signaling公司, 抗cMyc(9E10)購自santa cruz biotechnology 公司。引物合成及所構建載體的測序均由北京奧科生物技術公司完成。1.2 方法1.2.1 pHEN1scFv1956#的表達及分析 以原表達載體pHEN1scFv1956# 1 L轉

7、化100 L表達宿主HB2151感受態(tài)菌, 轉化產(chǎn)物涂布含100 mg/L Amp的2×YT瓊脂平板, 37孵育12 h。隨意挑取1個陽性轉化子接種于5 mL含100 mg/L Amp的2×YT培養(yǎng)基中, 37, 用260 r/min震搖12 h后 (A6001), 分別取100 L菌液轉接至2管5 mL含100 mg/L Amp的2×YT培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng)至A6000.6(約3 h), 加入1 mmol/L IPTG分別用兩組不同溫度和時間條件誘導(37誘導4 h, 25誘導20 h )。誘導前預留0.5 mL菌液, 誘導后取1 mL菌液, 13000 r/mi

8、n, 5 min集菌; 剩余3.5 mL菌液4, 13000 r/min, 5 min離心集菌, 取100 L上清轉移至一新離心管中, 加入100 L2×loading buffer; 取1 mL上清, 用三氯乙酸(TCA)沉淀7后加入200 L2×loading buffer(濃縮5倍); 菌體用滲透壓休克法8得到胞周質成分, 取1 mL胞周質成分TCA沉淀后加入200 L2×loading buffer。向誘導前、 后的菌體中加入200 L2×loading buffer和200 L去離子水。所制樣品煮沸變性5 min后SDSPAGE分析。1.2.2

9、 pET44a表達載體的構建 根據(jù)scFv1956#的結構基因, 設計引物44aup: 5TC CCC CGG GGC AGC CAG GTC CAA TTT GTA G3, 44adown: 5CCG CTC GAG TTA ATT CAG ATC CTC TTC T3(下劃線分別為Sma I和Xho I的酶切位點)。以含抗人乙酰膽堿受體(AChR) scFv1956# 的質粒pHEN1為模板, 用Pyrobest高保真DNA聚合酶擴增所需克隆片段。PCR反應條件: 第1個循環(huán), 94變性4 min, 52退火1 min, 72延伸1 min; 后28個循環(huán): 94變性30 s, 60.6退

10、火1 min, 72延伸1 min; 最后72延伸5 min, 4保存。乙醇沉淀法9回收PCR產(chǎn)物, 先后用Sma I(酶切溫度30)、 Xho I酶切PCR回收產(chǎn)物和pET44a(+)載體, 8 g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切后的PCR片段和pET44a(+)載體。T4 DNA連接酶16過夜(16 h)連接目的片段與載體, 取10 L連接產(chǎn)物轉化100 L感受態(tài)JM109, 涂布100 mg/L氨芐青霉素(Amp) 2×YT瓊脂平板。37孵育14 h后, 隨意挑取5個陽性轉化子, 接種至含100 mg/L Amp的2×YT培養(yǎng)基, 37, 260 r/min震搖12h后取

11、菌液1.5mL小量提取質粒后, SmaI、 XhoI雙酶切鑒定目的片段的存在。從5個酶切鑒定的陽性克隆中隨機挑選1個克隆(以pET44ascFv1956#命名), 送北京奧科生物技術公司測序。測序結果證明scFv1956#已經(jīng)正確插入到pET44a(+)載體, 無點突變和讀碼框移。1.2.3 pET44ascFv1956#的表達及分析 將構建好的表達載體pET44ascFv1956# 1 L轉化100 L原核表達宿主BL21(DE3)pLysS感受態(tài)菌, 轉化產(chǎn)物涂布于含100 mg/L氯霉素(Cam)、 100 mg/L Amp的2×YT瓊脂平板上, 37孵育10 h。隨意挑取2個

12、陽性轉化子接種于5 mL含100 mg/L Cam和100 mg/L Amp的2×YT培養(yǎng)基, 37、 260 r/min震搖5 h后 (A6000.6), 加入1 mmol/L IPTG分別用兩組不同溫度和時間條件誘導(37誘導4 h, 25誘導20 h)。誘導前預留0.5 mL菌液, 誘導后取1 mL菌液, 13000 r/min, 5 min集菌; 剩余3.5mL菌液4 13000r/min, 5min離心集菌, 菌體用200L含1 mmol/L EDTA、 20 mmol/L PBS(pH7)、 0.5 mol/L NaCl的裂菌液重懸后, 冰浴中超聲裂菌約20次, 每次5

13、s, 間隔20 s, 至菌液清亮不黏稠。于4 13000 r/min離心15 min, 取100 L上清轉移至離心管中, 加入100 L2×loading buffer, 向菌體及裂菌后沉淀中加150 L2×loading buffer和150 L去離子水, 煮沸變性5 min后SDSPAGE分析。1.2.4 表達產(chǎn)物的鑒定及比較 Western blot鑒定比較兩種不同載體、 菌株和不同誘導時間、 溫度條件下, scFv1956#可溶性表達產(chǎn)物量的變化。SDSPAGE結束后, 使用BIORAD公司的Transblot SD半干轉印槽, 將凝膠、 硝酸纖維膜夾放在兩層濾紙之

14、間(凝膠位于陰極一側), 15 V恒壓 40 min(pET44ascFv1956#由于帶端融蛋白NusA需延長至50 min), 將蛋白從凝膠電轉移至硝酸纖維膜上。電轉移結束后, 取出硝酸纖維膜, 用麗春紅染液染膜30 s, 去離子水漂洗, 條帶顯色時用2B鉛筆標記蛋白Marker的位置。封閉液(含50 g/L脫脂奶粉的TBST)室溫孵育3 h, 加入1500稀釋的抗cMyc (9E10) 4孵育過夜, TBST室溫洗膜4次(10 min/次)后加入以110000稀釋的HRP標記羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h, TBST室溫洗膜4次(10 min/次), 加入化學發(fā)光底物West Pico ch

15、emiluminescent(PIERCE)室溫放置5 min后暗室壓片。2 結果2.1 scFv1956# 融合蛋白表達載體的鑒定 根據(jù)所設計的引物進行PCR, 得到的片段大小為780 bp(圖1), 與預期一致。得到的亞克隆所提質粒pET44ascFv1956# 經(jīng)Sma I、 Xho I雙酶切鑒定(圖2)均為陽性。測序結果證實scFv1956# 已成功插入到pET44a(+)載體中, 且與希臘巴斯德研究所制備的抗乙酰膽堿受體(AChR)的scFv1956# 核酸序列完全一致, 并未出現(xiàn)點突變或讀碼框移(北京奧科生物技術有限責任公司)。圖1 PCR產(chǎn)物scFv1956#的瓊脂糖電泳鑒定(略

16、)1: PCR產(chǎn)物; 2: DNA marker.圖2 pET44ascFv1956#表達載體的酶切鑒定(略)1: Sma I、 Xho I雙酶切產(chǎn)物; 2: DNA marker.2.2 表達產(chǎn)物的SDSPAGE分析 根據(jù)Bioedit軟件的計算結果, pHEN1scFv1956#表達產(chǎn)物的相對分子質量(Mr)為28108, 而融合了NusA(N utilization substance protein A)蛋白的pET44ascFv1956#表達產(chǎn)物的Mr為87072。在1 mmol/L IPTG條件下, 無論是37誘導 4 h, 還是25誘導20 h, pHEN1scFv1956#的表

17、達產(chǎn)物SDSPAGE后CBBR250染色, 與誘導前相比并未發(fā)現(xiàn)明顯新生條帶(圖3)。而改用載體pET44a(+)后, 同樣用1 mmol/L IPTG, 37誘導4 h的產(chǎn)物與誘導前相比在Mr為90000附近出現(xiàn)新生條帶, 與目的蛋白大小相符, 多為不溶的包涵體, 有部分可溶性表達, 而在25誘導20 h后的產(chǎn)物, 明顯可見裂菌后上清中的可溶性產(chǎn)物量增多(圖4)。2.3 表達產(chǎn)物特異性鑒定 用菌株HB2151表達pHEN1scFv1956#, 電轉后的硝酸纖維膜作Western blot分析, 壓片可見菌體成分出現(xiàn)Mr大小約28000特異蛋白帶(誘導前菌體亦出現(xiàn)此條帶), 誘導后用TCA沉淀

18、法濃縮5倍的上清及細胞周質成分均無條帶出現(xiàn)(圖5)。而用菌株BL21(DE3)pLysS表達pET44ascFv1956#, Western blot結果顯示在Mr為90000附近, 誘導后菌體、 裂菌后的上清、 沉淀, 均出現(xiàn)特異蛋白帶, 且25誘導20 h組上清的可溶性表達量明顯優(yōu)于37誘導4 h組(圖6)。圖3 pHEN1scFv1956#轉化表達宿主HB2151 IPTG誘導前后的SDSPAGE分析(略)1: 蛋白marker; 2, 3: 質粒轉化大腸桿菌HB2151 IPTG誘導前上清和菌體成分; 4-7: 37誘導4 h后的上清、 TCA沉淀法濃縮后的上清及胞周質蛋白成分、 菌體

19、成分; 8, 9: 25誘導20 h后TCA沉淀法濃縮后的上清和胞周質蛋白成分.圖4 pET44ascFv1956#轉化表達宿主BL21(DE3)pLysS IPTG誘導前后的SDSPAGE分析(略)1: 蛋白marker; 2: 重組質粒轉化的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS IPTG誘導前菌體成分; 3-5: 37誘導4 h后的菌體蛋白、 可溶和不可溶的菌體蛋白成分; 6-8: 25誘導20 h后的菌體蛋白、 可溶和不可溶的菌體蛋白成分.圖5 HB2151表達pHEN1scFv1956#的Western blot檢測(略)1: 誘導前菌體成分; 2-4: 37誘導4 h后TCA沉淀法濃

20、縮后的上清及胞周質蛋白成分, 菌體蛋白成分; 5-7: 25誘導20 h后的TCA沉淀法濃縮后的上清及胞周質蛋白成分, 菌體蛋白成分.圖6 BL21(DE3)pLysS表達pET44ascFv1956#的Western blot檢測(略)1: IPTG誘導前菌體成分; 2, 3: 37誘導4 h后可溶和不可溶的菌體蛋白成分; 4, 5: 25誘導20 h后可溶和不可溶的菌體蛋白成分.3 討論重組的scFv可以保護AChR免受其親代mAb或MG患者血清中自身抗體的攻擊10, 因而成為MG治療最有潛力的靶點。而如何能在E.coli這一生物工廠中生產(chǎn)出大量具有生物和免疫活性的scFv仍是目前面臨的主

21、要問題。本研究比較兩種不同表達形式, 使用了表達載體pET44a(+)在E.coli中獲得融合蛋白scFv1956#較大量的可溶性表達, 對于其功能鑒定及其將來在分子水平治療MG具有重要意義。scFv的表達主要有3種形式: 直接在細胞質中表達, 其結果往往是表達產(chǎn)物在細胞質內(nèi)形成不溶性的包涵體(Inclusion body); 與其他菌體蛋白(如: NusA)融合, 表達可溶性的融合蛋白; 將scFv基因與引導分泌的信號肽基因(如: phoA)相連接, 使表達產(chǎn)物分泌至E.coli的細胞外周質(periplasm)或培養(yǎng)上清中。本研究選擇后兩種表達形式直接獲取可溶性目的蛋白, 并對兩種表達形式

22、進行比較。原有載體pHEN1在scFv1956#的結構基因后帶有M13噬菌體外殼蛋白基因(fd phage gene III), 二者的相接處設計了一個琥珀密碼子(TAG), 在含有琥珀突變的宿主菌中, TAG可翻譯為某種氨基酸而不起終止密碼子的作用, 表達出的scFv為融合了Gene III的融合蛋白, 能夠在輔助噬菌體輔助下組裝成噬菌體顆粒, 用于構建噬菌體呈現(xiàn)文庫; 在無琥珀突變的宿主菌中(如: HB2151)TAG成為終止密碼子, scFv1956#會隨其結構基因前所帶的分泌表達信號肽PelB分泌到E.coli細胞膜與細胞壁之間的胞周質或培養(yǎng)上清。然而轉化到表達宿主HB2151的pHE

23、N1scFv1956#并未得到預想結果: 從SDSPAGE上看, 無論37誘導4 h還是25誘導20 h, 上清、 胞周質乃至菌體中均未見目的蛋白大小處有濃集。利用融合在scFv1956#羧基端的CMYC標簽, 做Western blot檢測其表達量及其定位, 大多scFv是以包涵體的形式定位于菌體中; 用TCA沉淀的方法分別5倍濃縮位于上清和細胞周質的蛋白后做Western blot檢測, 均未見目標條帶。結果表明低溫, 長時間誘導并不能促進scFv1956#的分泌性表達, 排除了由于scFv1956#的過量表達, 或分泌系統(tǒng)超載所致的目的蛋白未分泌表達?？赡鼙磉_產(chǎn)物scFv1956#的轉運

24、及正常折疊還需要分子伴侶的參與及其他分子的輔助。Western blot的結果表明誘導前的菌體中也有目的蛋白的表達, 可能與lac操縱子阻遏蛋白的抑制不完全,有滲漏相關。改建的載體pET44ascFv1956#保留了融合在scFv1956#羧基端的CMYC標簽用于鑒定, 在其氨基端融合了NusA蛋白, 同時帶有2個His標簽便于用Ni2+螯合柱進行純化。NusA蛋白是從SwissProt蛋白庫的4000多種E.coli菌體蛋白中篩選出的蛋白, 可以提高與其融合蛋白的可溶性, 位于其后的凝血酶(Thrombin)識別位點可以便于下一步純化后將scFv1956#從NusA上切除。優(yōu)化誘導表達的條件

25、: 用1 mmol/L IPTG分別用37誘導4 h及25誘導20 h, SDSPAGE和Western blot結果表明, 低溫誘導能明顯提高可溶性融合蛋白的產(chǎn)量, 可能與低溫條件下蛋白合成速率降低, 有利于蛋白的正確折疊和二硫鍵的形成相關; 而延長誘導時間, 菌體量的增加使得目的蛋白獲得量增多。大量可溶性目的蛋白的獲得, 為下一步分離純化目標蛋白及其功能鑒定具有重要的意義。致謝: 感謝希臘巴斯德研究所的Socrates J. Tzartos先生, 第四軍醫(yī)大學基礎部免疫學教研室楊琨副教授對本研究的熱心支持和幫助?！緟⒖嘉墨I】1 Vincent A. Unravelling the path

26、ogenesis of myasthenia gravisJ. Nature Rev Immunol, 2002, 2(10): 797-804.2 De Baets M, Stassen MH. The role of antibodies in myasthenia gravisJ. J Neurol Sci, 2002, 202(1-2): 5-11.3 Tuzun E, Scott BG, Goluszko E, et al. Genetic evidence for involvement of classical complement pathway in induction of experimental autoimmune myashenia gravisJ. J Immunol, 2003, 171(7): 3847-3854.4 Fostieri E, Tzartos SJ. Isolation of potent human Fab fragments against a novel highly immunogenic region on human muscle acetylcholine receptor which protect the receptor from myasthenic autoantibodiesJ. Eur J Immuno