氨基酸的薄層層析實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、_生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名：XXX學(xué)號(hào)：XXXXXX專業(yè)年級(jí)：臨床八年制_組別：第二實(shí)驗(yàn)室_實(shí)驗(yàn)名稱(Title of氨基酸的薄層層析Experimetn)實(shí)驗(yàn)日期實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)(Date ofXX(Lab No.)第二實(shí)驗(yàn)室Experiment)合作者XXX指導(dǎo)老師XXXX(Partner)(Instructor)總分教師簽名批改日期(Total Score)(Signature)(Date)_一、實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)1.0 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆毡訉游龇ǖ囊话阍?。掌握氨基酸薄層層析法的基本操作技術(shù)。掌握如何根據(jù)移動(dòng)速率（Rf 值）來鑒定被分離的物質(zhì)（即氨基酸混合液）。1.1 實(shí)驗(yàn)原理1.1.1 薄層層析原理：（是色譜

2、分析技術(shù)的一種）一般是將固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為固定相。當(dāng)液相（展開溶劑）在固定相上流動(dòng)時(shí)，由于吸附劑對(duì)不同氨基酸的吸附力不一樣，不同氨基酸在展開溶劑中的溶解度不一樣，點(diǎn)在薄板上的混合氨基酸樣品隨著展開劑的移動(dòng)速率也不同，因而可以彼此分開。（即通過吸附 - 解吸 -再吸附 - 再解吸的反復(fù)進(jìn)行，而將樣品各組分分離開來）1.1.2. 氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加熱時(shí)被還原，此產(chǎn)物與氨基酸加熱分解產(chǎn)生的氨結(jié)合，以及另一分子水合茚三酮縮合生成藍(lán)紫色化合物 而使氨基酸斑點(diǎn)顯色。1.1.3 基于相對(duì)遷移率Rf 值判定混合氨基酸組分層析中，物質(zhì)沿溶劑運(yùn)動(dòng)方向遷移的距離

3、與溶液前沿的距離之比為Rf 值。即：原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離Rf =原點(diǎn)到斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)前沿的距離由于物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故移動(dòng)速率（Rf 值）也是恒定的，因此可以根據(jù) Rf 值來鑒定被分離的物質(zhì)。1.2 實(shí)驗(yàn)材料1.2.1 實(shí)驗(yàn)樣品_ 0.01mol / L 丙氨酸：稱取丙氨酸 8.9mg 溶于 90% 異丙醇溶液至 10ml 。 0.01mol / L 精氨酸：稱取精氨酸 17.4mg 溶于 90% 異丙醇溶液至 10ml 。 0.01mol / L 甘氨酸：稱取甘氨酸 7.5mg 溶于 90% 異丙醇溶液至 10ml 。混合氨基酸溶液：將 0.01mol / L 丙氨酸、精氨酸

4、、甘氨酸按等體積制成混合溶液。（上述溶液已由老師提前制備完成）1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑吸附劑 ：硅膠 G(C.P.)。粘合劑： 0.5% 羥甲基纖維素鈉（CMCNa ）：取羥甲基纖維素鈉5g 溶于1000ml蒸餾水中，煮沸，靜置冷卻，棄沉淀，去上清備用。展開溶劑：按 80:10:10 （V/V/V ）混合正丁醇、冰醋酸及蒸餾水，臨用前配制。 0.1% 茚三酮溶液：取茚三酮（ A.R.） 0.1g 溶于無水丙酮（ A.R.）至 100ml 。展層 - 顯色劑：按照 10:1 比例（ V/V ）混合展開劑和 0.1% 茚三酮溶液。1.2.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器和器材層析板（ 6cm15cm ）；小燒杯；量筒

5、(10mL) ；小尺子；毛細(xì)玻璃管；層析缸；烤箱；天平；藥匙。1.3 實(shí)驗(yàn)步驟1.3.1 實(shí)驗(yàn)流程制版點(diǎn)樣層析顯色處理與結(jié)果分析1.3.2 實(shí)驗(yàn)操作步驟_步驟操作調(diào)漿：利用普通天平，粗稱取 3g 硅膠，加入 0.5% 羥甲基纖維素鈉 8ml ，調(diào)成均勻的糊狀涂布：取潔凈的干燥玻璃板 均勻涂層（1）制版0.5h ，自然晾干干燥：將玻璃板水平放置，室溫下放置活化： 70o C 烘干 30 分鐘。切斷電源，待玻璃板面溫度下降至不燙手時(shí)取出。標(biāo)記：用鉛筆距底邊2cm 水平線上均勻確定4 個(gè)點(diǎn)。每個(gè)樣品間相距1cm 。（ 2）點(diǎn)樣點(diǎn)樣：用毛細(xì)管分別吸取氨基酸溶液，輕輕接觸薄層表面點(diǎn)樣。加樣后原點(diǎn)擴(kuò)散直徑

6、不超過 2mm 。自然晾干后，必要時(shí)可再重復(fù)點(diǎn)一次。將薄層板點(diǎn)樣端浸入展層-顯色劑，展層 - 顯色劑液面應(yīng)低于點(diǎn)樣線。蓋好層析缸蓋，上行展層。當(dāng)展層劑前沿離薄（3）層析2 板頂端 2cm 時(shí)，停止展層，（該實(shí)驗(yàn)中超過板長(zhǎng)度的 即可）取出薄板，用鉛筆描出溶劑前沿界線。（ 4）顯色放置在烤箱中用 85 下烘干，即可顯出各層斑點(diǎn)。利用小尺子，測(cè)量各氨基酸色斑中心至樣品原點(diǎn)中心距離（5）數(shù)據(jù)處理和溶液前緣至樣品原點(diǎn)中心的距離。計(jì)算RF 值，從而判斷混合液的成分組成。1.3.3 注意事項(xiàng)吸附劑：實(shí)際實(shí)驗(yàn)要求不高，學(xué)生不用考慮。點(diǎn)樣：點(diǎn)樣的次數(shù)依照樣品的溶液的濃度而定，樣品量太少，有的成分不易_顯示；樣品

7、量太多，易造成斑點(diǎn)過大，互相交叉或拖尾。故：點(diǎn)樣后的斑點(diǎn)直徑一般為0.2cm 。避免污染：切勿用手直接接觸薄層板面，必要時(shí)戴上手套。二、實(shí)驗(yàn)記錄2.1 實(shí)驗(yàn)條件2.1.1 制版過程：材料： 3g 的硅膠和 0.5% 羥甲基纖維素鈉 8ml （實(shí)驗(yàn)室提供試劑，利用普通天平稱取硅膠、利用10mL 量筒量取 CMCNa ）并利用小燒杯混合攪拌均勻。實(shí)驗(yàn)時(shí)間 ：約 20min實(shí)驗(yàn)技巧 ：將糊狀物倒至潔凈玻璃板正中間，形成連續(xù)的一條線，并馬上開始左右來回晃蕩，使糊狀混合物向著玻璃板的兩邊蔓延。在邊緣的地方利用晃蕩和藥匙凃均勻后，再晃蕩幾次，使得全部糊狀物在玻璃板上均勻的形成涂層。實(shí)驗(yàn)失誤： 在實(shí)驗(yàn)中，第

8、一次由于糊狀物攪拌時(shí)間過久，變濃厚而不易使涂層變均勻，故導(dǎo)致制作的結(jié)果較差。2.1.2 后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程 ：材料： 上一次同學(xué)制作的層析板（根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)可知該板的質(zhì)量不高）、 4 瓶已經(jīng)配制好的溶液（丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、前3 種的任一比例混合物）、已經(jīng)含有展層 - 顯色劑的層析缸及烤箱等。實(shí)驗(yàn)時(shí)間： 1h 左右實(shí)驗(yàn)技巧： 在點(diǎn)樣過程中，必須垂直點(diǎn)樣，使樣液能充分被吸收。各實(shí)驗(yàn)過程按照要求即可，注意劃線以處理后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)失誤：無_2.2 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象2.2.1 制版過程： 在自然晾干后，可見圖一所示的層析板。2.2.2 后續(xù)過程：在點(diǎn)樣后，溶液干燥后不能再明顯分析斑點(diǎn)的外圍。在層析約 30min

9、后溶劑前沿到達(dá)層析板的2/3 處左右，可以取出并烘干。溶劑前沿并不是一條直線，故可認(rèn)為該層析板制作質(zhì)量不太高。在利用烤箱烘干后，層析板上出現(xiàn)5 個(gè)藍(lán)紫色斑點(diǎn)，相互分析。結(jié)果可見圖二。圖一 層析板圖二 實(shí)驗(yàn)后的結(jié)果2.3 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)即為各氨基酸色斑中心至樣品原點(diǎn)中心距離和溶液前緣至樣品原點(diǎn)中心的距_離記錄，如下表：表一原始數(shù)據(jù)記錄表各斑點(diǎn)樣品原點(diǎn)中心距離前緣至原點(diǎn)中心距離丙氨酸3.60cm6.50cm精氨酸2.10cm6.40cm甘氨酸3.05cm6.40cm混合點(diǎn) 12.01cm6.40cm混合點(diǎn) 23.50cm6.40cm說明：由于溶劑前沿并不是一條直線，故我們選取了各斑點(diǎn)垂直的實(shí)

10、驗(yàn)數(shù)據(jù)，以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率，減少實(shí)驗(yàn)誤差。_6.50cm6.40cm3.60cm3.50cm3.05cm2.10cm2.01cm三、結(jié)果與討論_3.1 結(jié)果處理利用原始數(shù)據(jù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理中的計(jì)算方式計(jì)算Rf 值：原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離Rf =可得表二如下：原點(diǎn)到斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)前沿的距離各斑點(diǎn)Rf 值氨基酸名稱丙氨酸0.554精氨酸0.328甘氨酸0.476混合點(diǎn) 10.314精氨酸混合點(diǎn) 20.547丙氨酸根據(jù) Rf 值，我們可以測(cè)定并粗略地得到結(jié)果：在一定的系統(tǒng)誤差和實(shí)驗(yàn)誤差的允許條件下，混合的氨基酸溶液中，存在有精氨酸和丙氨酸兩種氨基酸。3.2 討論3.2.1 結(jié)果上的誤差原因在實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中，

11、我們可以發(fā)現(xiàn)混合點(diǎn)1（精氨酸） Rf0.3140.328測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)值混合點(diǎn) 2 （丙氨酸） Rf0.5540.547測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)值。原因可能有：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，層析板的制作是基礎(chǔ)，硅膠分布的均勻與否直接影響了實(shí)際的實(shí)驗(yàn)。而從溶劑前沿的彎曲可以知道，實(shí)驗(yàn)所用的層析板質(zhì)量不是很好，一定程度上影響了實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)測(cè)定，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的誤差。 人為誤差的存在，在判定斑點(diǎn)前沿和測(cè)量距離時(shí)，存在一定的誤差，導(dǎo)致了結(jié)果上的不一致性，但這類影響較小。操作過程中存在一定的誤差，如層析時(shí)間不足等都有可能導(dǎo)致。_3.2.2 對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)與應(yīng)用價(jià)值學(xué)習(xí)制作層析板的技巧，多做多練，在練好基礎(chǔ)技能的前提下，可以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率和成

12、功率。提高并嚴(yán)格按照各項(xiàng)操作的標(biāo)準(zhǔn)做實(shí)驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行討論和分析3.3 結(jié)論薄層層析法操作簡(jiǎn)單，在實(shí)驗(yàn)的結(jié)果上也比較的精確， 能有效地分離出樣品各組分。運(yùn)用在本實(shí)驗(yàn)，效果也較好。最終可以得到結(jié)果：混合的氨基酸溶液中，存在有精氨酸和丙氨酸兩種氨基酸。3.4 思考題3.4.1 硅膠的吸附力與含水量的問題答：硅膠屬于極性吸附劑，根據(jù)活性級(jí)別越大，吸附能力越小的關(guān)系活性級(jí)別硅膠含水量（ %）吸附力05不15斷增強(qiáng)2538即硅膠的吸附能力與含水量呈負(fù)相關(guān)，含水量高，活度級(jí)數(shù)高，吸附力弱，反之亦然。3.4.2 吸附實(shí)驗(yàn)中吸附劑的選擇根據(jù)答：吸附劑的選擇一般需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)來確定。所選的吸附劑應(yīng)有以下幾個(gè)特點(diǎn)：最大的表面積和足夠的吸附能力對(duì)待不同的分離組分應(yīng)有不同的吸附能力_與溶劑和樣品成分不會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)顆粒均分，不會(huì)碎裂。一般的選