臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)(共64頁).ppt

1、臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 江西省胸科醫(yī)院：熊國亮江西省胸科醫(yī)院：熊國亮一、概述一、概述 免疫學(xué)檢驗(yàn)是研究免疫學(xué)技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域應(yīng)用的一門學(xué)科。免疫檢驗(yàn)技術(shù)則重點(diǎn)闡述各類免疫學(xué)技術(shù)的基本原理、方法類型和臨床應(yīng)用。19世紀(jì)末相繼建立了凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等三大經(jīng)典血清學(xué)試驗(yàn)，用于檢測病原微生物的抗原或抗體對傳染病的診斷起到重要作用。 一、概述一、概述 隨著免疫學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，放射免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)、流式細(xì)胞免疫分析技術(shù)等免疫標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)，加快了免疫學(xué)檢驗(yàn)的自動化、標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，極大地提高了免疫學(xué)檢驗(yàn)的靈敏度，拓展

2、了免疫學(xué)檢測范圍，從檢測免疫相關(guān)物質(zhì)（抗原、抗體、補(bǔ)體、免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子等）到檢測體液中的微量物質(zhì)（激素、酶、血漿微量蛋白、血藥濃度、微量元素等）。一、概述一、概述 免疫檢驗(yàn)技術(shù)以其特有的特異性、敏感性和微量、快速、穩(wěn)定等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)。 二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的應(yīng)用檢驗(yàn)的應(yīng)用 1.傳染病的免疫學(xué)檢查 機(jī)體被細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體、螺旋體等微生物感染后，常可在血清中出現(xiàn)與病原體相對應(yīng)的特異性抗體，檢測這類抗體有助于明確疾病的診斷（血清學(xué)診斷）。此外，還可以用含有特異性抗體的診斷血清鑒定相應(yīng)的病原體及有關(guān)抗原，為確定傳染的病原提供依據(jù)。二

3、、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的應(yīng)用檢驗(yàn)的應(yīng)用 2.機(jī)體天然免疫的檢測 主要是對各種吞噬細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞的功能進(jìn)行檢測以及檢測在機(jī)體組織損傷、局部缺血、急性感染與炎癥反應(yīng)時升高的血漿蛋白，如C反應(yīng)性蛋白，血漿中CRP濃度在急性心肌梗死、創(chuàng)傷、感染、炎癥、外科手術(shù)、腫瘤浸潤時迅速顯著地增高，可達(dá)正常水平的2000倍。CRP是引發(fā)心臟病的最強(qiáng)烈的危險因素。二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的應(yīng)用檢驗(yàn)的應(yīng)用 3.免疫球蛋白、循環(huán)免疫復(fù)合物和補(bǔ)體的測定 包括測定五類免疫球蛋白的含量、血清總補(bǔ)體活性及補(bǔ)體成分的含量和在多種疾病

4、時血清中升高的循環(huán)免疫復(fù)合物。二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的應(yīng)用檢驗(yàn)的應(yīng)用 4. 細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)測定 檢測淋巴細(xì)胞亞群和淋巴細(xì)胞的功能以及白細(xì)胞介素2等多種細(xì)胞因子，用于判斷機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀況。二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的應(yīng)用檢驗(yàn)的應(yīng)用 5. 自身抗體測定 機(jī)體在發(fā)生自身免疫性疾病時，?？沙霈F(xiàn)各自身抗體，用免疫學(xué)方法檢測這些抗體，可為自身免疫性病的診斷、疾病狀態(tài)判斷和療效監(jiān)測提供依據(jù)。二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的應(yīng)用檢驗(yàn)的應(yīng)用 6. 腫瘤標(biāo)志物測定 免疫學(xué)方法定性或定量檢測在腫瘤發(fā)生和增殖過

5、程中由腫瘤細(xì)胞合成、釋放或機(jī)體對腫瘤反應(yīng)產(chǎn)生的一些生化物質(zhì)，對腫瘤的篩查、鑒別診斷、治療后病情監(jiān)測及預(yù)后判斷均有重要意義。 三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 原理 ：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是免疫酶技術(shù)固相酶免疫測定的一種技術(shù)，是將待測抗原或抗體先固定于固相載體表面，再用酶標(biāo)記的抗原或抗體與已被固定的相應(yīng)抗體或抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，加入酶底物及色原后呈色，呈色程度用吸光度（A）值表示，所測A值與待測抗體或抗原的水平呈相關(guān)關(guān)系。三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunoso

6、rbent assay,ELISA） 此法常用多孔聚苯乙烯反應(yīng)板作為固相載體，讀取結(jié)果需用酶標(biāo)儀。標(biāo)記抗原或抗體所用的酶常選擇辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）等，HRP常用的底物有鄰苯二胺（OPD）或四甲基聯(lián)苯胺（TMB），堿性磷酸酶一般采用對硝基苯磷酸酯（P-NPP）作為底物，產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有最高吸收峰。三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 根椐方法和步驟不同可分為以下幾種基本反應(yīng)模式。 1.間接法 是檢測樣本中特異性抗體最常用的方法。將已知特異性抗原包被于固相載體上

7、，加待檢樣本，若其中含特異性抗體則與固相抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物；洗棄未反應(yīng)的成分，加酶標(biāo)記抗抗體（一般為酶標(biāo)記抗人IgG或葡萄球菌A蛋白），使在固相載體上形成抗原待檢抗體標(biāo)記抗體（或SPA）復(fù)合物；洗棄未反應(yīng)的成分，加酶底物，終止反應(yīng)后，在一定波長下用酶標(biāo)儀測吸光度（A）值判定待測抗體的有無或含量。間接法的優(yōu)點(diǎn)是制備 一種酶標(biāo)記抗抗體（或SPA），只需更換不同的固相抗原，便可檢測多種抗體。如HCV-IgG抗體的檢測 三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 2.夾心法 夾心法有雙抗體夾心法（測抗原）和雙抗原

8、夾心法（測抗體），兩者試驗(yàn)步驟相同，但包被物、酶結(jié)合物和檢測對象不同。雙抗體夾心法用于檢測相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)抗原。先將已知特異性抗體包被于固相載體上，加待測樣本，若其中有相應(yīng)的抗原則與固相抗體特異性結(jié)合；洗板后加入酶標(biāo)記特異性抗體，使成包被抗體待測抗原酶標(biāo)抗體復(fù)合物；抗原或抗體含量與所測吸光度（A）值呈正相關(guān)。如乙型肝炎HBsAg的檢測、抗HBs的檢測、HBeAg的檢測。 三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 3.競爭法 用于檢測待檢樣本中未知抗原或抗體。以測定抗體的競爭法為例，將已知抗體吸附于固相載

9、體，洗滌除去未結(jié)合抗體，；加特異性抗原與包被抗體形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌除去游離抗原，加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體，標(biāo)本中的抗體與酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合固相復(fù)合物中的抗原。標(biāo)本中的抗體越多，其競爭力越強(qiáng)，與固相抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體越少，加酶底物顯色，有色產(chǎn)物的多少與酶標(biāo)抗體量成正比，與被測抗體量成反比。如乙型肝炎總抗HBc的檢測、抗HBe的檢測。三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 4.捕獲法 用于測定特異性IgM類抗體。被檢血清中針對某抗原的特異性IgM和IgG常同時存在，為避免IgG的干擾，一般采用捕獲法來測定IgM。

10、先將已知特異性抗體（如抗人鏈）包被于固相載體上，加待測人血清樣本，其中的IgM（IgM分子相對于固相抗鏈又是一種抗原）被固相抗鏈抗體特異性捕獲，形成IgM-抗IgM復(fù)合物。洗滌除去血清中的其他Ig和雜質(zhì)；加特異性抗原試劑，該抗原只與固相上的特異性IgM結(jié)合。 三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 洗滌除去未結(jié)合的特異性抗原；加入針對特異性抗原的酶標(biāo)抗體，此酶標(biāo)抗體只與固相上的特異性抗原結(jié)合。洗滌除去未結(jié)合酶標(biāo)抗體，加酶底物反應(yīng)，色的多少與標(biāo)本中特異性IgM的量成正比。如甲肝(抗HAV-IgM)檢測、抗HBc

11、-IgM的檢測。 三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 5. 生物素親合素ELISA（avidinbiotinperoxidase complex，ABC-ELISA）是將生物素（biotin）和親合素(avidin)或鏈霉親合素(streptavidin,SA)引入ELISA的方法。生物素是一種小分子物質(zhì)，經(jīng)活化后可高比度的偶聯(lián)抗體或抗原等大分子。親合素（或鏈霉親合素）與生物素的結(jié)合力極強(qiáng)，一分子親合素可與4個生物素分子結(jié)合。在反應(yīng)系統(tǒng)中引入生物素和酶標(biāo)記親合素，可將ELISA的反應(yīng)多級放大，顯著提高檢測

12、方法的敏感性。 四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控 （一）ELISA檢測室內(nèi)質(zhì)控 1現(xiàn)狀：ELISA法檢測的影響因素多，多為手工操作，很難標(biāo)準(zhǔn)化；未得到實(shí)驗(yàn)室的重視，質(zhì)控品來源有限或價格因素，操作人員意識不夠，有些基層單位不是每天做或者根本沒有做，有的不知從何做起。四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控 2質(zhì)控品的選擇：除了試劑盒附帶的陰陽性對照以外，實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)該選擇至少一個弱陽性質(zhì)控品，接近Cutoff值，S/CO值應(yīng)該為2-4之間（最好是購買商品）。 四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控 3臨界值與弱陽性質(zhì)控血清不同點(diǎn) （1）臨界值血清：實(shí)驗(yàn)結(jié)果處于（陰、陽性）分界點(diǎn)時的樣品中

13、分析物濃度值，低于此值，定性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為陰性，高于此值，定性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為陽性。對于定性實(shí)驗(yàn)來講，臨界值是唯一的醫(yī)學(xué)決定水平，當(dāng)樣品中被測物濃度處于臨界水平時，定性實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢查同一樣品，將產(chǎn)生50%的陽性結(jié)果和50%的陰性結(jié)果。當(dāng)樣品濃度在臨界值以上增加時，陽性結(jié)果比率增加；而當(dāng)樣品濃度在臨界值以下減低時，陰性結(jié)果比率增加。 四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控 （2）弱陽性質(zhì)控血清： A醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法的弱陽性定為S/CO=2-4； B 用陰性混合血清梯度稀釋陽性混合血清，用現(xiàn)用檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測所能測出陽性結(jié)果的最低濃度。 C 質(zhì)控品S/CO值-3S1的最低濃度水平 。四、臨床免

14、疫室內(nèi)質(zhì)控四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控 4測定頻度：每次檢測患者樣本時至少測定一次室內(nèi)質(zhì)控品；ELISA測定每塊板都要測定室內(nèi)質(zhì)控品。 5質(zhì)控圖繪制：定性測定可采用弱陽性質(zhì)控品的S/CO值作質(zhì)控圖。判定規(guī)則為12S（警告限），13S。 四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控（二）標(biāo)本量少的定量測定項(xiàng)目的質(zhì)控方法是“即刻法”質(zhì)控（Grubs異常值取舍法）（1）對于某些不是每天開展的項(xiàng)目、有效期限較短的試劑盒的項(xiàng)目，用上述方法計(jì)算獲得平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差有很大的難度。采用Crubbs氏法，只需連續(xù)測定3次，即可對第3次檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)和控制。具有計(jì)算方法如下：四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控 A. 計(jì)

15、算出測定結(jié)果（至少3次）的平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（S）。 B. 計(jì)算SI上限值和下限值: SI上限值=(X最大值-X)/S SI下限值=(X-X最小值)/S四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控C. 查表，將SI上限 SI下限與SI值表中的數(shù)值進(jìn)行比較 n n3s n2s n n3s n2s 31.15 1.15 122.55 2.29 41.49 1.46132.61 2.33 51.75 1.67142.66 2.3761.94 1.82152.70 2.4172.10 1.94 162.75 2.4482.22 2.03 172.792.4792.32 2.11182.82 2.50 1

16、02.41 2.18192.85 2.53 112.48 2.23202.88 2.56 四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控 當(dāng)SI上限 和 SI下限值n2s時，表示處于控制范圍之內(nèi)，可以繼續(xù)進(jìn)行測定，并重復(fù)以上計(jì)算；當(dāng)SI上限 和 SI下限有一值處于n2s 和n3s值之間時，說明該值在2s-3s四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控 范圍，處于“警告”狀態(tài)；當(dāng)SI上限 和 SI下限值有一值處于n3s時說明該值在3s范圍以外，屬“失控”。數(shù)字處于“警告”和“失控”狀態(tài)應(yīng)舍去，重新測定該項(xiàng)目質(zhì)控品和病人樣本。舍去的只是失控的這次數(shù)值，其它次測定值仍可繼續(xù)使用。 當(dāng)檢測的數(shù)字超過20次以后

17、，可轉(zhuǎn)入使用常規(guī)的質(zhì)控方法進(jìn)行質(zhì)控。四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控 （三）其它免疫檢測的質(zhì)控 1定量測定參照臨床化學(xué)的規(guī)則和失控判定（如化學(xué)發(fā)光儀檢測的腫瘤標(biāo)記物項(xiàng)目）。 2膠體金、膠體硒等試紙條快速檢測可不做室內(nèi)質(zhì)控品的測定。 3凝集試驗(yàn)：血凝及乳膠凝集試驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控品可采用試劑盒帶的陰陽對照。五、五、ELISAELISA檢測中的注意事項(xiàng)檢測中的注意事項(xiàng)p試劑因素試劑因素: :抗原抗體的純度, 抗體的親和力、標(biāo)記物的比活性或免疫活性等均對測定結(jié)果產(chǎn)生直接影響。試劑盒的穩(wěn)定有效期, 運(yùn)輸條件及儲存方式等也均會對結(jié)果產(chǎn)生一定程度影響。ELISA檢測的主要影響因素檢測的主要影響因素ELI

18、SA檢測的主要影響因素檢測的主要影響因素p標(biāo)本因素標(biāo)本因素: :內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)干擾。內(nèi)源性物質(zhì)常見的有: 類風(fēng)濕因子(RF)、嗜異性抗體( Id)、補(bǔ)體、人抗動物抗體(HAAA )、藥物及其致的代謝產(chǎn)物和交叉反應(yīng)物質(zhì)等等。RF、Id 和等的干擾機(jī)制相似, 均為固相抗體和標(biāo)記抗體之間的橋聯(lián)抗原,在夾心法中易產(chǎn)生假陽性。ELISA檢測的主要影響因素檢測的主要影響因素p對于含有內(nèi)源性干擾物的標(biāo)本可以作以下處理: (1) 去除分析用抗體Fc 片段, 用F (ab) 2 替代完整的IgG, 可以減少RF、Id 和HAAA 等對分析結(jié)果的影響; (2) 用63 , 10m in 或56 , 30m

19、 in 熱處理來減少RF 和補(bǔ)體等對結(jié)果的影響; (3) 用2巰基乙醇加入標(biāo)本稀釋液中, 可使RF 降解,用EDTA 稀釋標(biāo)本可緩解補(bǔ)體對結(jié)果的干擾;ELISA檢測的主要影響因素檢測的主要影響因素p設(shè)備設(shè)備：加樣系統(tǒng)、孵育設(shè)備、洗板機(jī)、酶標(biāo)儀p環(huán)境因素：環(huán)境因素：水質(zhì)p操作：操作：標(biāo)本處理、加樣、溫育、洗板、顯色、終止設(shè)備設(shè)備 衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)乙型肝炎表面抗原酶免疫檢衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)乙型肝炎表面抗原酶免疫檢驗(yàn)方法驗(yàn)方法 (WS / T 223 (WS / T 2232002)2002) 酶標(biāo)儀在450 nm 和492 nm 的波長不精密度應(yīng)在1 %，分別在449 nm -451 nm 和491 nm-

20、493 nm 之間，吸光度（A 值）要求可以測到小數(shù)點(diǎn)后兩位；設(shè)備設(shè)備 移液系統(tǒng)在100l和50 l 的移液不精密度應(yīng)1 % ，分別在99- 101l 和49.5l-50.5l 之間； 恒溫系統(tǒng)在37 、43 的溫度變異應(yīng)成士I 。 RF多為IgM型，也有IgG和IgA型。RF具有與變性IgG產(chǎn)生非特異性結(jié)合的特點(diǎn)，因此在ELISA檢測過程中可能與固相上包被的抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，并將這藕連起來產(chǎn)生假陽性結(jié)果。這種情況在利用捕獲法測定IgM型抗體的過程中尤其嚴(yán)重。因?yàn)椴东@法測定IgM型抗體試劑盒中固相上包被的抗體為抗人鏈。內(nèi)源性干擾內(nèi)源性干擾內(nèi)源性干擾內(nèi)源性干擾 補(bǔ)體: 補(bǔ)體經(jīng)典活化途徑從C1q

21、開始, 在固相抗體和酶標(biāo)抗體吸附及結(jié)合過程中, 抗體分子可能發(fā)生變構(gòu),從而使 Fc段 的補(bǔ)體C1q 分子結(jié)合點(diǎn)暴露出來, 則C1q 可將二者連結(jié)起來, 造成假陽性。內(nèi)源性干擾內(nèi)源性干擾 可采用RF吸附劑去除RF，63 10min或5630 min滅活補(bǔ)體 采用抗體的Fab段替代完整的IgG可有效避免RF干擾。 溶血：Hb含有的血紅素基團(tuán)具有類似過氧化物的活性，若標(biāo)本中Hb濃度過高則可能吸附于固相并于隨后加入的HRP底物反應(yīng)顯色。外源性干擾：外源性干擾：外源性干擾：外源性干擾： 細(xì)菌污染：細(xì)菌的一些內(nèi)源性酶本身會對用相應(yīng)酶作標(biāo)記測定方法產(chǎn)生干擾。 標(biāo)本貯存時間過長：標(biāo)本在2-8保存時間過長，Ig

22、G可聚合成多聚體，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底過深甚至假陽性。外源性干擾：外源性干擾： 標(biāo)本凝固不全：血液采集后如收集管中促凝劑和抗凝劑，血液一般在半小時后開始凝固。在臨床工作中可能因?yàn)橼s時間而在血液還未凝固之前就強(qiáng)行離心分離血清，此時分離的“血清”可能殘留有部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中形成纖維蛋白而沉積、吸附在酶標(biāo)板內(nèi)，而常規(guī)洗板難以完全去除。溶血和非溶血、脂濁與非脂濁兩組樣品A 值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AFP、RF、補(bǔ)體、自身抗體陽性樣品的吸光度值明顯高于對照組吸光度值, 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 這可能是AFP、RF、補(bǔ)體和某些自身抗體能夠與固相一抗, 標(biāo)記二抗Fc 結(jié)合或影響它們的結(jié)合

23、而造成假陽性三種不同的溫育方式均會導(dǎo)致邊緣效應(yīng), 中央孔和周圍孔的吸光度有顯著性差異但水浴法溫育比較穩(wěn)定, 邊緣效應(yīng)相對較小, 孵箱法較大, 微波法最為明顯。建議: 使用抗凝血標(biāo)本, 便于標(biāo)本的離心分離。不抗凝血液標(biāo)本過夜之后才檢測,讓血凝塊更好地收縮,讓標(biāo)本中的非特異性物質(zhì)被充分地包裹,降低非特異性反應(yīng)所致的假陽性率2 。標(biāo)本離心時,加大離心轉(zhuǎn)速,延長離心時間,使紅細(xì)胞和纖維蛋白充分沉降,使標(biāo)本的離心分離更加徹底3 標(biāo)本加樣時避免加入紅細(xì)胞和/ 或纖維蛋白,避免這兩種干擾物質(zhì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響12 份HBsAg 陽性血清標(biāo)本按常規(guī)檢測, 加顯色劑后, 不加終止劑,在酶標(biāo)儀上每5min 測一次4

24、10nm OD 值42 份HBsAg 陽性血清標(biāo)本做三排孔檢測,每排分別加酶標(biāo)記抗體40l 、50l 、60l ,其余按說明書操作并測定OD 值。加酶結(jié)合物前放置不同時間得到的抗加酶結(jié)合物前放置不同時間得到的抗HBcHBc結(jié)果結(jié)果：隨機(jī)檢測44 份抗HBc 陰性的血清樣品, 加樣后室溫25 分別放置0、5、10、15、20、30 min 后加入酶結(jié)合物,其后嚴(yán)格按說明書操作。結(jié)果0、5、10、15、20、30 min 陽性率分別為0、2. 3 %(1/ 44) 、11. 4 %(5/ 44) 、15. 9 %(7/ 44) 、20. 5 %(9/ 44) 、22. 7 %(10/ 44) ,與

25、加入酶結(jié)合物0 min 組陽性率相比較:5 min 組P 0. 05 ,10 min 組P 0. 05 ,其余各組P均 0. 01。不同人員稀釋樣品所得到的抗不同人員稀釋樣品所得到的抗HBcHBc結(jié)果結(jié)果將5 份抗HBc 臨界陰性的血清混合,選擇4 名檢驗(yàn)人員按照各自工作習(xí)慣對混合血清分別稀釋16 孔(稀釋比例為130) ,同時用振蕩器平行稀釋16 孔作為標(biāo)準(zhǔn)對照,將所有稀釋樣品隨機(jī)加入同一酶標(biāo)板中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:4 名檢驗(yàn)人員檢測結(jié)果(S/ CO 的.x s ,A 值)和標(biāo)準(zhǔn)對照結(jié)果分別為0. 85 0. 09、0. 96 0. 11、1. 170. 11、0. 97 0. 17、1. 31

26、 0. 11 ,兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義方法1：檢測樣本39 水浴,反應(yīng)孔底部不接觸水面;方法2：37 水浴,反應(yīng)孔底部2 /3浸入水中;方法3：反應(yīng)板置37干式孵育箱孵育方法2、3之間無顯著性差異;方法2、3與方法1間的差異有顯著性方法1液面上方的溫度是通過水溫進(jìn)行調(diào)節(jié)的,所以反應(yīng)板孵育時升溫比較緩慢,達(dá)到平衡溫度所需時間也較長。因此采用該方法對檢測的結(jié)果影響較大。方法3孵育時反應(yīng)孔的四周受熱均勻,因此反應(yīng)板達(dá)到平衡溫度的時間要短于方法1,且反應(yīng)體系中各種物質(zhì)的作用較為均勻,結(jié)果也比較穩(wěn)定。3種孵育方式均會產(chǎn)生不同程度的邊緣效應(yīng)。其中方法1對結(jié)果的影響最大三種不同的溫育方式均會導(dǎo)致邊緣效應(yīng)

27、, 中央孔和周圍孔的吸光度有顯著性差異但水浴法溫育比較穩(wěn)定, 邊緣效應(yīng)相對較小, 孵箱法較大, 微波法最為明顯。12 份HBsAg 陽性血清標(biāo)本按常規(guī)檢測, 加顯色劑后, 不加終止劑,在酶標(biāo)儀上每5min 測一次410nm OD 值42 份HBsAg 陽性血清標(biāo)本做三排孔檢測,每排分別加酶標(biāo)記抗體40l 、50l 、60l ,其余按說明書操作并測定OD 值。p加終止液后隨著時間的增加,A 值逐漸下降。而且濃度越高其A 值隨時間下降越快。但弱陽性的HBsAg 質(zhì)控物,其A 值并不隨時間增加而變化,在終止反應(yīng)后28 min 內(nèi)始終處于同一水平；pHBsAg、抗HBs、HBeAg 三項(xiàng)結(jié)果陰陽性判斷

28、似乎不受時間的影響,其原因有待進(jìn)一步研究。但對于競爭法而言,可能會產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果,因此建議在終止反應(yīng)后立即比色。p 同步稀釋測定法p PEG法:酶標(biāo)二抗試劑中加入4% PEG600p 振動態(tài)ELISA法:，該方法可將HOOK 效應(yīng)發(fā)生的臨界濃度減少兩個稀釋度p 盡量選擇測定范圍寬的試劑盒；p 每一批號試劑盒隨樣本做高濃度質(zhì)控(10000ng/ml)：注：計(jì)算公式：注：計(jì)算公式：根據(jù)正態(tài)分布根據(jù)正態(tài)分布u u檢驗(yàn)單側(cè)檢驗(yàn)單側(cè)99.5%99.5%的可信限，的可信限， u u值值=2.58=2.58 上海市臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理基本內(nèi)容和要上海市臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理基本內(nèi)容和要求（求（2009年）

29、年）: 復(fù)檢范圍的確定按下列公式計(jì)算：cutoff值0.8樣品測定值cutoff值3，不得小于此范圍。 以(CO -2 s ) 作為陽性低限判斷值, 其中s 值是以衛(wèi)生部臨檢中心臨界質(zhì)控血清(HBsAg 1 ng/ml , 抗HCV 2 NCU /ml 的RCV K 所測得的s 值。CO 至(CO 2 s ) 的范圍稱為灰區(qū)。理由為: 國產(chǎn)試劑盒的CO 一般是以陰性對照A 值加或乘一個常數(shù)得出, 陰性對照是小牛血清而非人血清, A 值不超過0105即按0105 計(jì)算, 亦即CO 為一不變的常數(shù),這樣就忽視了試劑批間差、板間差和操作誤差; 國產(chǎn)試劑的靈敏度普遍不高, 如HBsAg進(jìn)口試劑的靈敏度為0.1 0.2 1 ng/ml 而國產(chǎn)試劑為0.5 1 1 ng/ml , 一般認(rèn)為0.1 1 ng/ml 即有傳染性。六、酶標(biāo)儀的使用及維護(hù)六、酶標(biāo)儀的使用及維護(hù) 1酶標(biāo)儀的基本原理 酶標(biāo)儀實(shí)際上就是一臺變相的專用光電比色計(jì)或分光光度計(jì)。光源燈發(fā)出的光波經(jīng)過濾光片或單色器變成一束單色光，進(jìn)入塑料微孔板中的待測標(biāo)本，該單色光一部分被標(biāo)本吸收，另部分則透過標(biāo)本照射到光電檢測器上，光電檢測器將這一待測標(biāo)本不同而