干旱鹽堿共脅迫下玉米miR398的表達(dá)

1、干旱鹽堿共脅迫下玉米 miR398的表達(dá)統(tǒng)計分析采用 Stata 統(tǒng)計分析軟件， 比較各試驗組與對照組 間的差異。2 結(jié)果與分析2.1 非生物脅迫處理的玉米和正常條件下玉米 玉米種子經(jīng)過催芽后盆栽于溫室中。 待苗生長至雌雄分化盛期（大喇叭口期，約 12 張真葉），觀察玉米生長情況，以保證 玉米生長良好且均一， 無明顯形態(tài)差異， 此時將玉米材料分為處 理組和對照組。 48 h 后，對照組玉米葉片舒展生長良好；處理 組玉米葉片卷蔫， 且有黃葉出現(xiàn)， 表現(xiàn)為典型的水分虧缺癥狀 （圖 1）。2.2 在干旱和鹽堿共脅迫條件下玉米 miR398 表達(dá)模式 熔解曲線可用來衡量引物質(zhì)量的好壞， 較好的引物具有

2、較高的擴增效率， 不會形成引物二聚體或產(chǎn)生錯配。 可從曲線形狀看 出miR398和內(nèi)參（18S rRNA） PCF擴增過程熔解曲線呈現(xiàn)“ S” 形（圖2），這表明PCRT增試驗進(jìn)行良好。為了進(jìn)一步探索miRNA在鹽脅迫條件下的表達(dá)變化情況，利 用qRT-PCR技術(shù)檢測玉米 miR398b在干旱鹽堿共脅迫條件下（0、24、48、72 h ）變化情況。圖 3結(jié)果顯示，24、48、72 h 的處理組miR398表達(dá)量與對照組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué) 意義（ P2.3 干旱鹽堿共脅迫下玉米脫落酸和脯氨酸含量的變化 在干旱鹽堿共脅迫處理后， 通過 ELISA 技術(shù)測定對照和處理 2組玉米幼苗樣品的細(xì)胞

3、內(nèi)源 ABA脯氨酸含量。圖4結(jié)果表明， 與對照組相比， 24、48、72 h 的處理組玉米脫落酸累積量與對 照組相比明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P3 討論植物中的小RNA在植物的生長發(fā)育、組織器官的形態(tài)建成、 逆境應(yīng)答和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。 通過對靶基 因預(yù)測和功能分析后發(fā)現(xiàn)，某些脅迫（旱、鹽堿、熱、冷、凍） 誘導(dǎo)的miRNA還直接參與植物逆境脅迫下的適應(yīng)性反應(yīng)。尤其是miRNA在植物非生物環(huán)境脅迫應(yīng)答中的調(diào)控作用日益受到重視 7。miRNA389可以同時受這4種非生物因素脅迫的調(diào)控。在轉(zhuǎn) 基因擬南芥中研究進(jìn)一步揭示 miRNA398在調(diào)控CSD2基因表達(dá)中 和氧化脅迫中的重

4、要作用。而干旱、嚴(yán)寒和鹽分則會影響植物 miR319c、miR393 miR395、miR397b和 miR402 的表達(dá)水平8。 實際上， Sunkar 等構(gòu)建了擬南芥幼苗經(jīng)脫水、高鹽、低溫和 ABA 脅迫處理后的小分子 RNA文庫并對文庫的測序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了 26個新的miRNAs它們來源于15個新的miRNA家族9。 但是，miRNA在植物抗逆反應(yīng)中作用的分子機制目前還不清楚， 有待進(jìn)一步研究。氧化應(yīng)激反應(yīng)是玉米在多種逆境脅迫環(huán)境下的生理反應(yīng)， 氧 化應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致玉米體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加。 植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性， 抗旱性強的品種往 往積累較多的脯氨

5、酸。 因此測定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的 生理指標(biāo)。同時，在玉米葉片中ABA誘導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2能通過促發(fā)促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK引起的級聯(lián)反應(yīng)來調(diào)節(jié)一些抗 氧化酶類基因的表達(dá)， 進(jìn)一步增強抗氧化酶類的活性， 最終啟動 氧化防御系統(tǒng) 10 。本試驗結(jié)果顯示， miR398 在干旱鹽堿脅迫 過程中參與靶基因ABA和脯氨酸的抗氧化防御機制的調(diào)控。因此我們認(rèn)為：miR398可以通過增加ABA的累積，進(jìn)而激活 ABA誘 導(dǎo)的抗氧化防御系統(tǒng)，且此過程還涉及到脯氨酸。試驗過程中玉米鹽堿處理濃度是獲得相關(guān)基因表達(dá)的重要 因素。目前，國內(nèi)外對玉米耐鹽堿性鑒定還沒有形成統(tǒng)一的、權(quán) 威的耐鹽堿鑒定濃度，大

6、部分研究者都是根據(jù)自身的鑒定方法、 處理溶液選取不同的鑒定濃度， 而且在操作過程中的誤差或人為 因素都有可能造成鑒定濃度的不同 11-13 。因此，本試驗中對 耐鹽堿性鑒定濃度的篩選是很必要的。 本研究最終確定的玉米苗 期鹽性處理濃度為 100 mmol/L ，確定的玉米苗期堿處理濃度為 35 mmol/L ;劉芳等研究表明，NaCI濃度為250 mmol/L 是玉米 苗期耐鹽性篩選的理想濃度 14 ；崔美燕的研究表明， Na2CO3 濃度為 25 mmol/L 可以作為玉米苗期耐堿性鑒定的理想濃度 15 。另外，玉米在苗期的耐鹽堿性很重要，因為植株苗期的生 長情況影響其最終的產(chǎn)量。 本試驗是

7、在選取玉米對鹽堿脅迫最敏 感的“3葉 1 心”期進(jìn)行鹽堿脅迫處理 3 d本試驗中使用的耐鹽堿性鑒定濃度與其他人的研究存在一 定的差異， 并使用較重的脅迫參數(shù)。 這樣更有利于獲得特異性相 關(guān)miRNA表達(dá)。此外，崔美燕等采用苗情評價的方法對玉米自交 系幼苗進(jìn)行耐鹽、堿性鑒定，根據(jù)鹽或堿脅迫處理 7 d 后苗情 觀察來評價玉米材料的耐鹽、 堿性性狀，非常直觀、簡單 15-16 。 為了檢測玉米對干旱鹽堿脅迫的早期反應(yīng)，在試驗中收集處理 3 d后的玉米混合組織作為抽提 RNA的材料。本研究建立了鹽、 堿和旱共脅迫下的玉米品系 YQ7-96 模型， 檢測miR398在不同處理時期的表達(dá)水平， 并驗證miR398表達(dá)與 多個玉米抗旱指標(biāo)（ABA和脯氨酸）的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，在玉 米幼