黃岡師范學(xué)院2018年度-2018年度第二學(xué)年分子實驗的考試問題詳解

1、2011 2012學(xué)年分子生物學(xué)實驗期末考試試卷答案一簡答題1. 瓊脂糖凝膠電泳別離DNA勺原理是什么？DNA分子帶負(fù)電荷，在電場中受到電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)向正極移動過程中， 因DNA分子的大小與構(gòu)象差異而呈現(xiàn)遷移位置上的差異，對于線形DNA分子，其電場中的遷移率與其分子量的對數(shù)值成反比，電泳時加溴化乙錠，其與DNA吉合形成一種熒光絡(luò)合物，在254365nn紫外照射下可產(chǎn)生桔紅色的熒光，可用于檢 測DNA此法可觀察到凝膠中2ng左右的DNA。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，當(dāng)其加熱到沸點后再冷卻凝固就形成良好的 電泳介質(zhì)，其孔徑?jīng)Q定于其濃度。電泳介質(zhì)中的孔徑對電泳遷移中的帶電分子產(chǎn) 生一種阻力，阻

2、力的大小取決于帶電分子的大小與其物理性狀。因此，瓊脂糖可制成不同孔徑的凝膠，別離 DNA勺X圍廣，約200bp50kbb在一定電場強度下，假如無任何介質(zhì)阻礙遷移，如此大DNA分子比小DNA分子跑得快。但在實際電泳中，由于使用了瓊脂糖分子篩介質(zhì)，對大分子DNA產(chǎn)生了較強的阻力，因此大分子DNA盡管有較高的帶電量，仍難以快速前進(jìn)；小 分子DNA由于能夠穿越介質(zhì)網(wǎng)孔，其帶電量盡管相對較小，但仍能快速遷移到正 極。因此，不同的DNA分子在瓊脂糖凝膠中產(chǎn)生了不同的遷移距離，這種遷移距離的差異使得不同大小DNA尋以別離。2. 瓊脂糖凝膠電泳中DNA是靠什么發(fā)出熒光的？為什么？EB即溴化乙錠。因為溴化乙錠含

3、有一個可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個三環(huán)平面基團(tuán)。它與DNA勺結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。在高離子強度的飽和 溶液中，大約每2.5個堿基插入一個溴化乙錠分子。當(dāng)染料分子插入后，其平面 基團(tuán)與螺旋的軸線垂直并通過 X德華力與上下堿基相互作用。這個基團(tuán)的固定位 置與其與堿基的密切接近，導(dǎo)致與DNA吉合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離 溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的 染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見光 譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。由于溴化乙錠-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒有 結(jié)合DNA勺染料高出20-3

4、0倍，所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴化乙錠0.5ug/ml 時，可以檢測到少至10ng的DNA條帶。3. 制備基因組DNA寸用到的以下試劑CTAB巰基乙醇、氯仿、無水乙醇、70% 乙醇分別起什么作用？CTAB溶解膜蛋白，破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀；巰基乙醇：抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,防止褐變,能保護(hù)DNA另外巰基 乙醇能消除CTAB在震蕩過程中產(chǎn)生的大量氣泡；氯仿：去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等，純化 DNA無水乙醇：沉淀DNA70%乙醇：漂洗并沉淀DNA4. 什么是感受態(tài)細(xì)菌？感受態(tài)細(xì)菌的主要作用？感受態(tài)細(xì)菌：細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱感受態(tài)細(xì)菌。主要作用：感受態(tài)的細(xì)菌適于攝取和容納外

5、來 DNA。再者，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn) 入感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)展表達(dá)，不僅可以檢驗重組載體是否構(gòu)建成功，最主要的是感受 態(tài)細(xì)菌作為重組載體的宿主可以進(jìn)展后續(xù)實驗，如蛋白質(zhì)表達(dá)純化等工作。5. 簡單表示質(zhì)粒DNA提取過程中參加各種試劑后分別會產(chǎn)生什么現(xiàn)象，簡要解 釋為什么？溶液I :現(xiàn)象不明顯。菌體重懸于溶液中。溶液U:管底出現(xiàn)沉淀物質(zhì)。溶液II使菌體裂解、蛋白質(zhì)變性，管底就會出現(xiàn) 一些細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)沉淀物。溶液III :沉淀增加。乙酸鉀能使 SDS產(chǎn)生不溶水的沉淀并將蛋白質(zhì)和染色體沉淀下來。氯仿：異戊醇24:1 :現(xiàn)象待考溶解蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)無水乙醇作用：沉淀DNA70%乙醇作用：漂洗并沉淀 DNAT

6、E緩沖液作用：溶解質(zhì)粒 DNA注意：實驗現(xiàn)象自己對照實驗報告寫6藍(lán)白斑篩選的原理藍(lán)白斑篩選要篩選的是白班，因為白斑代表目的基因轉(zhuǎn)入了大腸桿菌中， 藍(lán)斑表 示沒有轉(zhuǎn)入。具體原理見下：藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法，是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如a -互補、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的許多載體都 帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有B -半乳糖苷酶基因lacZ的調(diào)控 序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點MCS，它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到B-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼B -半乳糖苷酶C端局部序列的宿主細(xì) 胞。因此，宿主和

7、質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成 具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實現(xiàn)了互補，稱為a-互補。由a-互補而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍(lán)色菌 落，因而易于識別。然而，當(dāng)外源 DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，幾乎不可防 止地導(dǎo)致無a-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。 這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。量程的調(diào)節(jié)在調(diào)節(jié)量程時，如果要從大體積調(diào)為小體積，如此按照正常的調(diào)節(jié)方法，逆時針旋轉(zhuǎn)旋鈕即可；但如果要從小體積調(diào)為大體積時， 如此可

8、先順時針旋轉(zhuǎn)刻度旋鈕至超過量程的刻度，再回調(diào)至設(shè)定體積，這樣可以 保證量取的最高準(zhǔn)確度。在該過程中，千萬不要將按鈕旋出量程，否如此會卡住內(nèi)部機械裝置而損壞了移液槍。槍頭吸液嘴的裝配在將槍頭pipette tips 套上移液槍時，很多人會使勁地在槍頭盒子上敲幾下，這時錯誤的做法，因為這樣會導(dǎo)致移液槍的內(nèi)部配件 如彈 簧因敲擊產(chǎn)生的瞬時撞擊力而變得松散，甚至?xí)?dǎo)致刻度調(diào)節(jié)旋鈕卡住。正確 的方法是將移液槍器垂直插入槍頭中，稍微用力左右微微轉(zhuǎn)動即可使其嚴(yán)密 結(jié)合。如果是多道如8道或12道移液槍，如此可以將移液槍的第一道對準(zhǔn) 第一個槍頭，然后傾斜地插入，往前后方向搖動即可卡緊。槍頭卡緊的標(biāo)志是略 為超過

9、0型環(huán)，并可以看到連接局部形成清晰的密封圈。移液的方法移液之前，要保證移液器、槍頭和液體處于一樣溫度。吸取液體時，移液器保持豎直狀態(tài)，將槍頭插入液面下 2-3毫米。在吸液之前，可以先 吸放幾次液體以潤濕吸液嘴尤其是要吸取粘稠或密度與水不同的液體時。這 時可以米取兩種移液方法。一是前進(jìn)移液法。用大拇指將按鈕按下至第一停點，然后慢慢松開按鈕回原點。接著將按鈕按至第一停點排出液體，稍停 片刻繼續(xù)按按鈕至第二停點吹出剩余的液體。 最后松開按鈕。二是反向移液法。此法一般用于轉(zhuǎn)移高粘液體、生物活性液體、易起泡液體或極微量的 液體，其原理就是先吸入多于設(shè)置量程的液體， 轉(zhuǎn)移液體的時候不用吹出剩余的 液體。先

10、按下按鈕至第二停點，慢慢松開按鈕至原點。接著將按鈕按至第一停點 排出設(shè)置好量程的液體，繼續(xù)保持按住按鈕位于第一停點千萬別再往下按， 取下有殘留液體的槍頭，棄之。移液器的正確放置使用完畢，可以將其豎直掛在移液槍架上，但要小心別掉下來。當(dāng)移液器槍頭里有液體 時，切勿將移液器水平放置或倒置，以免液體倒流腐蝕活塞彈簧。維護(hù)保養(yǎng)時的須知事項如不使用，要把移液槍的量程調(diào)至最大值的刻度，使彈簧處于松弛狀態(tài)以保護(hù)彈簧。最好定期清洗移液槍，可以用肥皂水或60 %的異丙醇，再用蒸餾水清洗，自然晾干。高溫消毒之前，要確保移液器能適應(yīng)高溫。校準(zhǔn)是可以在20-25度環(huán)境中，通過重復(fù)幾次秤量蒸餾水的方法來進(jìn)展。使用時要檢

11、查是否有漏液現(xiàn)象。方法時吸取液體后懸空垂直放置幾秒中，看看液面是否下降。如果漏液，原因大 致有一下幾方面：1、槍頭是否匹配；2、彈簧活塞是否正常；3、如果是易揮發(fā)的液體許多有機溶劑都如此，如此可能是飽和蒸汽壓的問題。可以先吸放幾次液體，然后再移液。論述題1.答：1如果該目的基因為基因，且序列，如此通過數(shù)據(jù)庫查到基因序列，根 據(jù)序列設(shè)計引物，PCR獲得全長，凝膠回收后，與載體連接、轉(zhuǎn)化、挑單克隆培 養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA測序驗證。2如果該目的基因為新材料中的基因，且序列未知，如此可通過數(shù)據(jù)庫進(jìn) 展同源基因序列搜索，比對分析，根據(jù)同源性高的局部設(shè)計引物，PCR獲得片段, 測序得到局部序列，根據(jù)的局部序列設(shè)計GSF引物，利用RACE分別獲得5'與3' 端序列，測序拼接成全長序列，再根據(jù) 1步的步驟獲得該目的基因。關(guān)鍵技術(shù)：引物設(shè)計，利用堿基互補原理，注意引物 Tm值、GC含量、發(fā) 夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體、錯配等。連接、轉(zhuǎn)化，利用 Taq酶反響加A的特性，與 T載體可以互補，連接。轉(zhuǎn)化，如此是利用a互補顯色反響原理，對陽性克隆進(jìn) 展篩選。注意連接時目的片段與載體的摩爾比為 5: 1-10 : 1, 一般16度過夜連 接,轉(zhuǎn)化時注意感受態(tài)