生物樣本的常用保存方式及效果梳理

1、生物樣本的常用保存方式及效果梳理生物樣本是醫(yī)學(xué)研究的重要資源，病理學(xué)組織和細(xì)胞樣本是臨床常見的生物樣本，主要來源于臨床手術(shù)、活檢、穿刺等操作，可通過制備切片、涂片以及提取生物大分子，用于病理診斷及醫(yī)學(xué)研究。樣本是醫(yī)學(xué)研究的基礎(chǔ)，其質(zhì)量在很大程度上決定著研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)等研究手段的飛速進(jìn)步，各種分析技術(shù)對生物樣本的質(zhì)量也提出了更高的要求1, 2。生物樣本的質(zhì)量鑒定目前尚未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但其提取產(chǎn)物DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的質(zhì)量控制已較為成熟。因此，為了評估各保存方式的效果，可以通過檢測樣本中提取的生物大分子的質(zhì)量來間接衡量生物樣本的質(zhì)量3。目

2、前生物樣本及其提取產(chǎn)物主要有深低溫和常溫兩大類保存方式，針對不同科研需求，更多的樣本保存方式也不斷相繼問世，但各種方式的保存效率不盡相同4。本文將對當(dāng)前國內(nèi)外常用的樣本保存方式及其效果進(jìn)行分析和小結(jié)，為臨床生物樣本的保存提供可行的建議，為獲得高質(zhì)量的樣本提供理論基礎(chǔ)。一、深低溫保存相比甲醛液固定的組織，低溫凍存組織中可以提取到更高質(zhì)量的生物大分子，以滿足現(xiàn)代檢測技術(shù)的需要5。但有研究表明，-25低溫凍存約1年后，組織中的蛋白活性發(fā)生了顯著下降6。相比之下，深低溫凍存（-196-80）的保存效果更佳，已成為一種廣為接受的生物樣本長期保存方式7。1. -196/-150深低溫凍存是理想的樣本保存方

3、式：目前，液氮保存（-196）是公認(rèn)最可靠的樣本保存方式，樣本在此溫度可長期保持穩(wěn)定8, 9。然而，由于樣本完全浸沒在液氮中，游離的組織碎片可能會帶來交叉生物污染的潛在風(fēng)險，因此催生了氣相液氮（-150）這種新型保存方式。所謂氣相液氮保存，就是將樣本置于液態(tài)氮以上、氣相氮的包圍之中，可以很好的避免交叉污染的風(fēng)險。除此之外，還可以通過電力冰箱制冷達(dá)到-150的深低溫。對于-150深低溫的保存效果,目前雖缺乏長期數(shù)據(jù)支持，但從理論上說，該溫度應(yīng)該可以滿足樣本的長期保存需求。因為-137是水的玻璃化溫度，低于此溫度時細(xì)胞內(nèi)能導(dǎo)致內(nèi)容物降解的一切生化反應(yīng)均處于失活狀態(tài)，可長期保存樣本并保證其質(zhì)量10。

4、但是，又有研究發(fā)現(xiàn)，一般的組織凍存液由DMSO、血清、細(xì)胞培養(yǎng)液組成，需要現(xiàn)用現(xiàn)配。但是由于血清的成分不定，凍存液的穩(wěn)定性差，使得這種組織凍存液的保質(zhì)期較短，保存條件也較為苛刻。使用現(xiàn)有的組織凍存液凍存腫瘤組織時，只有極少數(shù)的腫瘤組織可以復(fù)蘇或以腫瘤細(xì)胞的形式進(jìn)行傳代，更無法以原代腫瘤的形態(tài)增殖，且極易丟失腫瘤的原始突變，只能獲得分子水平的數(shù)據(jù)信息。故而，現(xiàn)有的組織凍存液的應(yīng)用范圍狹窄，降低了腫瘤組織樣本的應(yīng)用價值和科研轉(zhuǎn)化能力。上海賽立維生物科技有限公司研發(fā)的玻璃化凍存技術(shù)，使腫瘤組織暫時脫離生產(chǎn)狀態(tài)，可在液氮中長期保存，使得腫瘤組織可以隨時制備、保存和應(yīng)用，這樣的保存方式操作簡便，且成本低

5、廉。移植后可使之以原代腫瘤的形態(tài)增殖或傳代，且保存了腫瘤的原始基因突變。成功突破了活腫瘤組織凍存復(fù)蘇后存活率低的難題，使得凍存的腫瘤細(xì)胞可長期保存腫瘤組織活性，組織復(fù)蘇后可維持與新鮮腫瘤組織幾乎相同的形態(tài)特征和功能?？偨Y(jié)，賽立維研發(fā)的組織凍存和復(fù)蘇試劑盒有如下優(yōu)勢：（1）凍存后可長期保存（10年）。（2）復(fù)蘇后形態(tài)功能與新鮮組織一致。（3）復(fù)蘇后仍可分離原代腫瘤細(xì)胞。（4）凍存前后PDX成瘤能力基本不變。（5）可替代冰凍切片和石蠟固定組織。（6）實現(xiàn)DNA、RNA和蛋白活性保存。（7）手術(shù)標(biāo)本、活檢組織均適用。（詳情請聯(lián)系產(chǎn)品經(jīng)理楊經(jīng)理）2. -80深低溫凍存聯(lián)合核

6、酸穩(wěn)定劑也可作為較理想的樣本保存方式：在不具備液氮保存條件的生物樣本庫，也可考慮使用-80深低溫冰箱代替液氮來保存組織樣本。那么，-80深低溫凍存對組織的保存效果究竟如何呢？有研究發(fā)現(xiàn)，組織長期保存在-80環(huán)境，可以很好地保護(hù)其內(nèi)部的蛋白成分，也可以提取到高質(zhì)量的RNA，與凍存在氣相液氮（-150）中相比沒有顯著差異11；但也有研究發(fā)現(xiàn)，組織凍存在-80深低溫環(huán)境，雖然其DNA產(chǎn)量、完整性以及RNA產(chǎn)量可以維持長達(dá)7年而不發(fā)生明顯改變，但其RNA完整性卻在凍存5年后開始下降12。因此有研究者建議將組織小份分裝，加入RNA特異性穩(wěn)定劑后再凍存于-80環(huán)境，更有利于組織內(nèi)RNA的保存10。關(guān)于蛋白

7、質(zhì)的保存，目前以深低溫凍存為主，可以很好地保護(hù)其穩(wěn)定性。也有研究表明，凍存之前添加蛋白保護(hù)劑，如海藻糖等，保存效果更佳13, 14。除外以上對生物大分子的檢測，還有研究者對組織進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，發(fā)現(xiàn)組織凍存于-80深低溫27年后，光鏡下其形態(tài)結(jié)構(gòu)仍保持良好狀態(tài)15。以上研究證明，在不具備液氮保存條件時，生物樣本分裝小份并根據(jù)需要結(jié)合核酸穩(wěn)定劑后凍存在-80深低溫環(huán)境，可以長期有效地保護(hù)其質(zhì)量，以滿足多種下游實驗的需要。二、常溫保存鑒于深低溫凍存方式存在著一定的缺點和風(fēng)險，諸如運輸和操作不便、能源消耗大、空間利用率低等，樣本的常溫保存技術(shù)應(yīng)運而生。常溫保存技術(shù)的原理可類比線蟲的脫水休眠現(xiàn)象，

8、利用某些特殊技術(shù)或容器將脫水干燥后的樣本置于密閉環(huán)境中，隔絕水、空氣、微生物等有害因素；或者向生物樣本中添加保護(hù)劑，保護(hù)劑滲入組織細(xì)胞內(nèi)部，使相關(guān)酶失活，從而達(dá)到常溫環(huán)境下保護(hù)樣本的目的16。在實際的科研中,除了直接保存生物樣本之外,也可以將后續(xù)實驗所需的生物大分子提取出來加以保存。因此，在研究樣本常溫保存方式的同時，研發(fā)人員也致力于探索如何在常溫環(huán)境有效保存樣本提取產(chǎn)物。下文列舉了幾種常用的常溫保存方式，分別適用于不同的樣本類型，包括樣本和樣本提取產(chǎn)物。1.特殊技術(shù)或容器：（1）石蠟包埋：石蠟包埋技術(shù)被廣泛應(yīng)用于組織學(xué)、免疫組織化學(xué)等領(lǐng)域，技術(shù)成熟，歷史悠久。一直以來科學(xué)家都致力于從石蠟包埋

9、組織中提取高質(zhì)量的核酸，用于分子生物標(biāo)志物的檢測，但是結(jié)果并不容樂觀，不利于多元化、充分利用樣本。在石蠟包埋操作之前，組織的固定非常重要。甲醛液因其固定效果好，且不會影響組織形態(tài)，一直以來都是石蠟包埋技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的一種組織固定液。但甲醛會對組織內(nèi)部的生物分子進(jìn)行化學(xué)修飾，并且在蛋白與核酸之間形成交叉連接，從而影響生物大分子的質(zhì)量17, 18。因此，近年來，為了從石蠟包埋組織中得到高質(zhì)量的生物大分子，新型組織固定液的研究不斷發(fā)展19, 20。以PAXgene為例，這是一種不含甲醛成分的新型組織固定液。研究發(fā)現(xiàn)，與新鮮冰凍組織相比，組織經(jīng)PAXgene或甲醛液固定后，其RNA完整性都有所降低，

10、但RIN值（RNA Integrity Number）仍大于7在公認(rèn)許可范圍之內(nèi)。完成后續(xù)石蠟包埋操作后，甲醛液固定石蠟包埋組織中所得RNA明顯降解，已不適合用于測序等下游實驗，而PAXgene固定石蠟包埋組織中的RNA完整性只發(fā)生輕微下降，RIN值仍大于7。在組織學(xué)方面，兩組組織切片經(jīng)蘇木素-伊紅染色后，光鏡下未見顯著差異，均保持良好的組織形態(tài)。由此可見，固定液不同，雖然對石蠟包埋后的組織形態(tài)沒有影響，但從中提取的RNA質(zhì)量卻存在顯著差異。因此，常規(guī)甲醛液固定后的石蠟包埋組織目前仍舊是形態(tài)及分子病理診斷最主要的樣本來源，如能在取材后就使用新型固定液，石蠟包埋組織也可抽提到高質(zhì)量的RNA等生物

11、大分子，用于下游相關(guān)實驗。（2）Flinders Technology Associates cards（ FTA卡）：是美國GE公司下屬Whatman公司推出的產(chǎn)品，是一種經(jīng)過專利化學(xué)配方浸漬的特制濾紙，內(nèi)含特殊基質(zhì)，可以將接觸到的細(xì)胞裂解，然后與釋放出的核酸緊密結(jié)合，保護(hù)DNA完整性。有研究者從腫瘤組織中分離出腫瘤細(xì)胞，用FTA卡常溫保存后提取DNA，并與新鮮組織抽提的DNA進(jìn)行質(zhì)量比較分析，發(fā)現(xiàn)兩組DNA的擴增能力和功能特性并沒有顯著差異21。另有研究發(fā)現(xiàn)全血用FTA卡保存也可以得到高質(zhì)量的DNA,與乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血中的DNA沒有顯著差異22。FTA卡使用方便，安全穩(wěn)定，

12、可用于長期常溫保存基因組、質(zhì)粒等，但此方法會將細(xì)胞裂解，破壞了形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，故存在局限性，也不適合RNA和蛋白的保存。（3）DNA/RNAshells：是法國Imagene公司推出的產(chǎn)品。DNA/RNAshells是用于保存核酸的一種容器，核酸脫水處理后置于這種微型金屬管，配合后續(xù)的特殊包裝系統(tǒng)，使其處于無水無氧的密閉環(huán)境,隔絕空氣、水、光、微生物等因素對樣本的影響，實現(xiàn)常溫環(huán)境長期保存的目的。Clermont等23將DNA保存在DNAshells中置于常溫常濕環(huán)境，18個月后未檢測到明顯降解。為了檢測樣本長期保存效果，研究者通常采用加速老化實驗（accelerated aging study）

13、在短期內(nèi)模擬樣本的長期保存條件并研究在此過程中生物大分子的穩(wěn)定性：通過人工改變保存條件，升高溫度、增加濕度使短期內(nèi)樣本的保存效果可模擬常溫常濕下樣本的長期保存效果，以縮短研究周期?；诖死碚?，Clermont等將DNA保存于DNAshells中并放在76、50%空氣濕度環(huán)境下30h，相當(dāng)于常溫常濕環(huán)境下100年24，再次檢測DNA完整性依然未發(fā)生顯著變化25。也有人同時針對DNA和RNA都進(jìn)行了加速老化實驗，DNA于60常濕環(huán)境下保存在DNAshells中8天相當(dāng)于常溫常濕14年24，仍保持較高的濃度、純度和完整性，可用于后續(xù)實驗；RNA于60常濕環(huán)境下保存在RNAshells中16天相當(dāng)于常

14、溫常濕7年26，RNA亦保持著較高的濃度、純度和完整性，RIN值仍維持7以上27。以上研究結(jié)果均表明,在常溫常濕的環(huán)境中,DNA/RNAshells可以長期有效的保護(hù)DNA、RNA，為下游實驗分析提供高質(zhì)量核酸樣本，但尚未有文獻(xiàn)報道可以常溫保存蛋白的類似容器。2.樣本保護(hù)劑：（1）DNA/RNAstable ：美國Biomatrica公司推出的產(chǎn)品。是用于DNA或RNA的液相保護(hù)劑，核酸樣本與之混合孵育后可在內(nèi)部形成一種熱穩(wěn)定屏障，脫水干燥后核酸可長期保存于常溫環(huán)境。DNAstable對DNA的常溫保存效果已有多項研究進(jìn)行評估,證實加入DNAstable后,DNA能夠長期保存在常溫環(huán)境,其完整

15、性不會發(fā)生顯著變化28, 29。同時有研究證實，加入RNAstable后的RNA常溫保存4年多，其RIN值仍在9以上，可用于下游實驗如realtime-PCR、測序等30, 31。因此，DNA/RNAstable適用于長期常溫保存核酸，并有效保護(hù)其質(zhì)量，但尚未有可以常溫保存蛋白的類似保護(hù)劑。（2）Allprotect：荷蘭Qiagen公司推出的產(chǎn)品，是一種膠狀保護(hù)基質(zhì)，可以滲透入組織內(nèi)部并對其中的生物大分子形成化學(xué)保護(hù)。研究發(fā)現(xiàn)，將組織浸沒于Allprotect后分別置于室溫（19）和冰箱（8、-20、-80）四種環(huán)境保存1周，與液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80的組織保存方式相比，5種方法保存的生物大分子

16、質(zhì)量沒有顯著差異。但遺憾的是Allprotect對組織的長期保存效果不佳，比如組織浸沒于Allprotect后存放于8環(huán)境，其RNA完整性1周后就開始降低，RIN值降至7以下；Western blot檢測到蛋白表達(dá)量在第3周就開始下降32。因此，Allprotect僅適用于樣本的采集階段，或者作為一個中轉(zhuǎn)途徑，在將樣本轉(zhuǎn)移至更穩(wěn)定的保存環(huán)境之前用以暫時保存組織。（3）RNAlater：美國Ambion公司產(chǎn)品，是一種液態(tài)組織保護(hù)劑。研究發(fā)現(xiàn)其可以滲透入組織內(nèi)部對生物大分子形成化學(xué)保護(hù)，從而有效保護(hù)組織，同時不會影響下游實驗的進(jìn)行33, 34。近來，有研究者將酵母菌細(xì)胞保存于RNAlater中，4放置24h后再轉(zhuǎn)入-80，可以從中提取到產(chǎn)量、純度、完整性均較高的DNA、RNA和蛋白質(zhì)；細(xì)胞加入RNAlater保護(hù)劑后凍存可以成功復(fù)蘇并繼續(xù)傳代培養(yǎng)，其結(jié)構(gòu)形態(tài)不受影響35。有研究結(jié)果顯示RNAlater對組織蛋白的影響與組織種類有關(guān),如Abbaraju等36將組織樣本經(jīng)RNAlater浸沒后轉(zhuǎn)入-80冰箱保存，這種方式可以很好地保護(hù)