生化技術(shù)考核

1、 中 國(guó) 海 洋 大 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告 姓名： 周夢(mèng)陽(yáng) 專業(yè)年級(jí)： 07生物技術(shù) 學(xué)號(hào)： 040012007184 實(shí)驗(yàn)時(shí)間：周二90節(jié) 教師： 孔凡娜 課程： 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目： 基因組DNA的提取與電泳鑒定 一.【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆栈蚪MDNA的提取原理和方法二.【實(shí)驗(yàn)原理】1、用機(jī)械的方法使組織和細(xì)胞破碎；加入SDS等離子型活性劑，溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白；加入酚氯仿等表面活性劑使蛋白變性。離心，除去組織和變性蛋白，上清液中加入冰凍的無(wú)水乙醇使DNA沉淀，離心，棄上清，70%乙醇漂洗DNA；倒掉上清，風(fēng)干，溶于滅菌的雙蒸水中。2、分子置于電場(chǎng)中以一定速度（遷移率）移向適當(dāng)電極。遷移率同電場(chǎng)

2、強(qiáng)度、電泳分子所攜帶的靜電荷數(shù)成正比，還與介質(zhì)的摩擦系數(shù)相關(guān)。一定電場(chǎng)強(qiáng)度下DNA分子的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。3、瓊脂糖是D-和L-半乳糖殘基殘基通過(13)和(14)糖苷鍵交替構(gòu)成的線狀聚合物。瓊脂糖凝膠可以形成直徑50nm-200nm的三維篩孔通道。瓊脂糖溶液的密度取決于瓊脂糖的濃度，我們所用的是經(jīng)過化學(xué)修飾的低熔點(diǎn)（LMP）瓊脂糖，結(jié)構(gòu)上比較脆弱，較低溫度下即可熔化。濃度越高，孔隙越小，分辨能力越強(qiáng)。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2-50Kb；聚丙烯酰胺凝膠分辨力為1bp-1000bp。4、凝膠電泳中，加入溴化乙錠（簡(jiǎn)稱EtBr）染料對(duì)核酸分子染色之后，將電泳標(biāo)本放

3、置在紫外光下觀察，便可以十分敏感兒方便地檢測(cè)出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶位置。三.【實(shí)驗(yàn)材料與用品】材料：龍須菜用具：天平、離心管、高速離心機(jī)、水浴鍋、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)等。藥品：液氮、緩沖液、SDS、蛋白酶K、tris飽和酚、氯仿、冰凍的無(wú)水乙醇、70%乙醇、RNA酶、TBE、瓊脂糖四.【實(shí)驗(yàn)步驟】（一）基因組DNA的提?。?）將龍須菜從培養(yǎng)瓶中取出，吸干表面水分后用電子天枰秤取0.2g，液氮充分研磨后分裝到1.5ml的離心管中。（2）在裝有藻體粉末的離心管中加入900l提取緩沖液、90l 20%的SDS、10l 10mg/ml的蛋白酶K。充分混勻后于37水浴鍋中裂解30mi

4、n，每5min混勻一次。（3）12000轉(zhuǎn)離心10min，取上清。（4）加入等體積Tris飽和酚抽提，充分混勻后12000轉(zhuǎn)離心10min，取上清。（5）加入等體積氯仿抽提，充分混勻后12000轉(zhuǎn)離心10min，取上清。（6）加入等體積氯仿抽提，充分混勻后12000轉(zhuǎn)離心10min，取上清。（7）加入兩倍體積的無(wú)水乙醇，充分混勻后于-20半小時(shí)。（8）將上述溶液從冰箱中取出，12000轉(zhuǎn)離心10min，出現(xiàn)的沉淀即為基因組DNA。（9）倒掉上清，加入800l 70%的無(wú)水乙醇，洗沉淀，12000轉(zhuǎn)離心10min。洗兩次。（10）倒掉上清后，將沉淀晾干后加入50去離子水溶解。 （11）加入Rna

5、se消化30min。（12）-20保存?zhèn)溆茫ǘ┗蚪MDNA的電泳檢測(cè)（1）配制1%的Agarose膠(1gAgarose粉末，融于100ml1×TAE中)（2）分別在樣品槽中加入標(biāo)準(zhǔn)DNA marker和樣品DNA 3l（buffer與樣品DNA的混合物），電泳。（3）將瓊脂糖膠放在EB溶液中染色5-10分鐘。（4）使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并檢驗(yàn)。五.【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】我們是第2組，由下圖可見無(wú)明顯條帶，這說(shuō)明樣品中混有蛋白質(zhì)雜質(zhì)，抽提不完全。六.【思考題】1、簡(jiǎn)述DNA提取過程中各種試劑的作用。SDS：破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性，解聚核糖體，使DNA得以釋放。蛋白酶K：降解蛋白質(zhì)乙醇：沉

6、淀DNATris：緩沖液EDTA：螯合劑，螯合酶活性中心的金屬離子，從而抑制DNase的活性酚氯仿：使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了DNase的降解作用。用苯酚抽提過程中，蛋白質(zhì)與DNA分離，蛋白質(zhì)與苯酚相似相溶，DNA溶于水相，離心分離后保持水相，加入酒精沉淀DNA。重蒸水：吸取DNA上面所粘附的離子RNA酶：降解混雜在DNA 中的RNA 2、簡(jiǎn)述DNA提取過程中需要注意哪些問題。1）材料量不能太多,氯仿的加入量不能太少,且要充分搖勻,否則蛋白質(zhì)變性不完全。2）苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到皮膚、粘膜和眼睛會(huì)造成損傷，因此應(yīng)注意防護(hù)。氯仿易燃、易爆、易揮發(fā)，具有神經(jīng)毒作用，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。3） 操作要

7、快，酚暴露在空氣和光線下易被氧化，呈紅色。4）收集細(xì)胞的多少是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵；5）沉淀中加1ml STE后，打散細(xì)胞團(tuán)便于充分消化細(xì)胞；6）飽和酚吸取時(shí)記得吸取下層的有機(jī)相；7）乙醇沉淀時(shí)，要沿離心管壁向DNA溶液中加入無(wú)水乙醇，輕輕搖動(dòng)離心管混和至體系完全均一，見白色絮狀DNA。3、查閱資料簡(jiǎn)單介紹通過紫外分光光度計(jì)給核酸定量的原理。分光光度計(jì)計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光源透過測(cè)試的樣品后，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于