動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用生物反應(yīng)器

1、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器 生物反應(yīng)器的一些概念生物反應(yīng)器的一些概念 生物反應(yīng)器的基本類型生物反應(yīng)器的基本類型第二章第二章 動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和專動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用生物反應(yīng)器用生物反應(yīng)器 學(xué)時：學(xué)時：2 2節(jié)課節(jié)課 主要內(nèi)容：主要內(nèi)容： 常用培養(yǎng)方法常用培養(yǎng)方法 動物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式動物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式 細(xì)胞培養(yǎng)過程的放大細(xì)胞培養(yǎng)過程的放大 動物細(xì)胞培養(yǎng)生物放大器動物細(xì)胞培養(yǎng)生物放大器相關(guān)知識介紹相關(guān)知識介紹 動物細(xì)胞培養(yǎng)開始于上世紀(jì)初動物細(xì)胞培養(yǎng)開始于上世紀(jì)初19621962年年, , 其其規(guī)模逐漸擴(kuò)大規(guī)模逐漸擴(kuò)大, ,

2、 發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法( (生生產(chǎn)酶、生長因子、疫苗和單抗等產(chǎn)酶、生長因子、疫苗和單抗等) )。利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的生物制品已占利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的生物制品已占世界生物高技術(shù)產(chǎn)品市場份額的世界生物高技術(shù)產(chǎn)品市場份額的50% 50% 。 發(fā)展：發(fā)展：在過去幾十年來，從使用轉(zhuǎn)瓶在過去幾十年來，從使用轉(zhuǎn)瓶(roller (roller bottle) bottle) 、CellCubeCellCube等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)展為等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)展為生物反應(yīng)器（生物反應(yīng)器（BioreactorBioreac

3、tor）進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培）進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。養(yǎng)。 一是在工藝生產(chǎn)時不能大規(guī)模制備產(chǎn)品；一是在工藝生產(chǎn)時不能大規(guī)模制備產(chǎn)品； 二是非批量生產(chǎn)容易導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量的不均一性二是非批量生產(chǎn)容易導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量的不均一性 三是難以對同批生產(chǎn)進(jìn)行生產(chǎn)和質(zhì)量控制。三是難以對同批生產(chǎn)進(jìn)行生產(chǎn)和質(zhì)量控制。 第一代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)核心問題：難以產(chǎn)業(yè)化！第一代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)核心問題：難以產(chǎn)業(yè)化！ 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，迫切需要大規(guī)模的細(xì)胞隨著生物技術(shù)的發(fā)展，迫切需要大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，以便獲得大量有用的細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。培養(yǎng)，以便獲得大量有用的細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。 采用玻璃瓶靜置或旋轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng)方法，已不能采用玻璃瓶靜置或旋轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng)方法，

4、已不能滿足所需細(xì)胞數(shù)量及其分泌產(chǎn)物。滿足所需細(xì)胞數(shù)量及其分泌產(chǎn)物。 自自7070年代以來，較常見的細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器年代以來，較常見的細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器有空氣提升反應(yīng)器，中空纖維管反應(yīng)器，無泡有空氣提升反應(yīng)器，中空纖維管反應(yīng)器，無泡攪拌反應(yīng)器及籃式生物反應(yīng)器等。攪拌反應(yīng)器及籃式生物反應(yīng)器等。 8080年代以來，人們逐漸開始以生物反應(yīng)器培養(yǎng)年代以來，人們逐漸開始以生物反應(yīng)器培養(yǎng)代替鼠腹水的方法獲得單克隆抗體。代替鼠腹水的方法獲得單克隆抗體。 動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)：（large-scale culture technology）l定義：定義：指在人工條件下（設(shè)定指在人工條件

5、下（設(shè)定pHpH、溫度、溶、溫度、溶氧等），在細(xì)胞生物反應(yīng)器中高密度大量培氧等），在細(xì)胞生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)養(yǎng)動物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。通過大規(guī)模體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)哺乳類通過大規(guī)模體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)哺乳類動物細(xì)胞是生產(chǎn)生物制品的有效方法動物細(xì)胞是生產(chǎn)生物制品的有效方法雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì)雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì)胞胞人二倍體細(xì)胞人二倍體細(xì)胞chocho（中華倉鼠卵巢）細(xì)胞（中華倉鼠卵巢）細(xì)胞BHK-21(BHK-21(倉鼠腎細(xì)胞倉鼠腎細(xì)胞) )VeroVero細(xì)胞細(xì)胞( (非洲綠猴腎傳代細(xì)胞，是貼壁依非洲綠猴腎傳代細(xì)胞，是貼壁依賴

6、的成纖維細(xì)胞賴的成纖維細(xì)胞) )等。等。l可大規(guī)模培養(yǎng)的動物細(xì)胞可大規(guī)模培養(yǎng)的動物細(xì)胞個性化培養(yǎng)基是胞細(xì)培養(yǎng)基的發(fā)展方向個性化培養(yǎng)基是胞細(xì)培養(yǎng)基的發(fā)展方向圖圖 8.1 細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)瓶圖圖 8.3 細(xì)胞工廠細(xì)胞工廠Spinner培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒疫苗、巨細(xì)胞病毒疫苗、疫苗、巨細(xì)胞病毒疫苗、及及干擾素、血纖維干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子蛋白溶酶原激活劑、凝血因子和和、促紅細(xì)胞、促紅細(xì)胞素、松弛素、生長激素、蛋白素、松

7、弛素、生長激素、蛋白C C、免疫球蛋白、尿、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶及激酶、激肽釋放酶及200200種單克隆抗體等。種單克隆抗體等。 目前已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的產(chǎn)品：目前已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的產(chǎn)品：第一節(jié)第一節(jié) 常用的培養(yǎng)方法常用的培養(yǎng)方法6.6.原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖5050代即退化死亡代即退化死亡 動物細(xì)胞生長特性：動物細(xì)胞生長特性：1.1.細(xì)胞生長緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素細(xì)胞生長緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素2.2.細(xì)胞大，無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境適應(yīng)性差細(xì)胞大，無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境適應(yīng)性差 3.3.需氧少，不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌需氧少，不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌 4.4.群體

8、生長效應(yīng)，貼壁生長（錨地依賴性）群體生長效應(yīng)，貼壁生長（錨地依賴性） 5.5.培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，成本高培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，成本高 非貼壁依賴型細(xì)胞：非貼壁依賴型細(xì)胞：無需附著于固相表面無需附著于固相表面即可生長，包括血液、淋巴組織細(xì)胞、許即可生長，包括血液、淋巴組織細(xì)胞、許多腫瘤細(xì)胞及某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞。多腫瘤細(xì)胞及某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 依據(jù)在體外培養(yǎng)時對生長基質(zhì)依賴性差異，依據(jù)在體外培養(yǎng)時對生長基質(zhì)依賴性差異，動物細(xì)胞可分為兩類：動物細(xì)胞可分為兩類： 貼壁依賴型細(xì)胞：貼壁依賴型細(xì)胞：需要附著于帶適量電荷需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長，大多數(shù)動物的固體或半固體表面才能生長，大

9、多數(shù)動物細(xì)胞，包括非淋巴組織細(xì)胞和許多異倍體細(xì)細(xì)胞，包括非淋巴組織細(xì)胞和許多異倍體細(xì)胞均屬于這一類。胞均屬于這一類。 “貼壁單核貼壁單核”細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)貼壁的單核細(xì)胞貼壁的單核細(xì)胞貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)的人參愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)的人參愈傷組織知識回顧知識回顧一般步驟：一般步驟： 無菌取出目的細(xì)胞所在組織，用培養(yǎng)液漂洗干凈無菌取出目的細(xì)胞所在組織，用培養(yǎng)液漂洗干凈 以鋒利無菌刀具割舍多余部分，切成小組織塊以鋒利無菌刀具割舍多余部分，切成小組織塊 將小組織塊置解離液（含蛋白酶類）離散細(xì)胞。將小組織塊置解離液（含蛋白酶類）離散細(xì)胞。低速離心洗滌細(xì)胞后，將目的細(xì)胞吸移培養(yǎng)瓶培養(yǎng)低速離心洗滌細(xì)胞后，將目

10、的細(xì)胞吸移培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 動物細(xì)胞培養(yǎng)步驟動物細(xì)胞培養(yǎng)步驟 植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)流程植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)流程懸浮細(xì)胞培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)提取純化提取純化產(chǎn)物產(chǎn)物脫分化：離體植物器官、組織或細(xì)胞，在培養(yǎng)了一段時間脫分化：離體植物器官、組織或細(xì)胞，在培養(yǎng)了一段時間后，會通過細(xì)胞分裂，形成愈傷組織（細(xì)胞排列疏松而無后，會通過細(xì)胞分裂，形成愈傷組織（細(xì)胞排列疏松而無規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞）。規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞）。 收集細(xì)胞收集細(xì)胞藥物制劑藥物制劑通過植物組織培養(yǎng)的藥物：奎寧、長春堿、洋地黃、通過植物組織培養(yǎng)的藥物：奎寧、長春堿、洋地黃、紫草素、人參皂甙等紫草

11、素、人參皂甙等大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)工藝流程圖大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)工藝流程圖細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器提取提取細(xì)胞細(xì)胞誘生劑誘生劑細(xì)胞細(xì)胞產(chǎn)品（腫瘤抗原）產(chǎn)品（腫瘤抗原）純化純化產(chǎn)品（干擾素）產(chǎn)品（干擾素）純化純化提取提取產(chǎn)品（單克隆抗體）產(chǎn)品（單克隆抗體）濃縮純化濃縮純化79865432110大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法：大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法： 貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng) 固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng) 一、貼壁培養(yǎng)（一、貼壁培養(yǎng)（attachment cultureattachment culture）細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。 1 1、生長特性：貼

12、壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時要、生長特性：貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形數(shù)生長期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。成致密的細(xì)胞單層。 貼壁培養(yǎng)細(xì)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶機(jī)胞轉(zhuǎn)瓶機(jī) 2 2、貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：、貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)： 容易更換培養(yǎng)液：細(xì)胞緊密黏附于固相表面，容易更換培養(yǎng)液：細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。液。 容易采用容易

13、采用灌注培養(yǎng)灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的；因細(xì)胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。的目的；因細(xì)胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。 當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長基質(zhì)時，很多細(xì)胞將更有當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長基質(zhì)時，很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品。效的表達(dá)一種產(chǎn)品。 同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/ /細(xì)胞的比例。細(xì)胞的比例。 適用于所有類型細(xì)胞。適用于所有類型細(xì)胞。灌注培養(yǎng)灌注培養(yǎng) 3 3、貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)：、貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)： 與懸浮培養(yǎng)法相比，與懸浮培養(yǎng)法相比， 擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大；擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大； 占地面積大；占地面積大； 不能有效監(jiān)測細(xì)胞的生長；不能有效監(jiān)測細(xì)胞

14、的生長； 4 4、細(xì)胞貼壁的表面：、細(xì)胞貼壁的表面： 要求具有凈陽電荷和高度表面活性。對要求具有凈陽電荷和高度表面活性。對微載體而言還要求具一定電荷密度；若為微載體而言還要求具一定電荷密度；若為有機(jī)物表面，必須具有親水性，并帶陽電有機(jī)物表面，必須具有親水性，并帶陽電荷。荷。 5 5、貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)：、貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)： 主要有主要有轉(zhuǎn)瓶轉(zhuǎn)瓶、中空纖維中空纖維（后面專題介紹）、（后面專題介紹）、玻璃珠玻璃珠、微載體系統(tǒng)微載體系統(tǒng)（后面介紹）等。（后面介紹）等。 貼壁培養(yǎng)細(xì)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶機(jī)胞轉(zhuǎn)瓶機(jī)細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)： 為最初采用系統(tǒng)，一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培為最

15、初采用系統(tǒng)，一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反應(yīng)器接種細(xì)胞準(zhǔn)備的一條養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反應(yīng)器接種細(xì)胞準(zhǔn)備的一條途徑。細(xì)胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器途徑。細(xì)胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器轉(zhuǎn)瓶中，培轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不斷旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不斷旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，從而提供較好的傳質(zhì)和傳熱條件。從而提供較好的傳質(zhì)和傳熱條件。 轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的優(yōu)、缺點(diǎn)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的優(yōu)、缺點(diǎn)勞動強(qiáng)度大，占地空間大，單位體積提供細(xì)胞生勞動強(qiáng)度大，占地空間大，單位體積提供細(xì)胞生長的表面積小，細(xì)胞生長密度低，培養(yǎng)時監(jiān)測和長的表面積小，細(xì)胞生長密度低，培養(yǎng)時監(jiān)測和

16、控制環(huán)境條件受到限制?？刂骗h(huán)境條件受到限制。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單，投資少，技術(shù)結(jié)構(gòu)簡單，投資少，技術(shù)成熟，重復(fù)性好，放大只成熟，重復(fù)性好，放大只需簡單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等。需簡單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 二、二、懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)（suspension culturesuspension culture） 指細(xì)胞在反應(yīng)器中自由懸浮生長的過指細(xì)胞在反應(yīng)器中自由懸浮生長的過程。主要用于非貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)，如程。主要用于非貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等，是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上雜交瘤細(xì)胞等，是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。發(fā)展起來的。 小規(guī)模懸浮培養(yǎng)小規(guī)模懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)瓶懸浮培養(yǎng)瓶 用已

17、知人源或動物來源的蛋白或激素代替用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細(xì)胞培養(yǎng)方式，它能減少動物血清的一種細(xì)胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的新方向。為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的新方向。 無血清懸浮培養(yǎng)無血清懸浮培養(yǎng)三、固定化培養(yǎng)三、固定化培養(yǎng)（immobilization cultureimmobilization culture）： 將動物細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合起來，將動物細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合起來，再進(jìn)行培養(yǎng)。上述兩大類細(xì)胞都適用，具再進(jìn)行培養(yǎng)。上述兩大類細(xì)胞都適用，具有細(xì)胞生長密度高，抗剪切力和抗污染

18、能有細(xì)胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞易與產(chǎn)物分開，有利于力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞易與產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物分離純化。制備方法很多，包括產(chǎn)物分離純化。制備方法很多，包括吸附吸附法、共價貼附法、離子法、共價貼附法、離子/ /共價交聯(lián)法、包共價交聯(lián)法、包埋法、微囊法埋法、微囊法等。等。 1 1、吸附法、吸附法: : 用固體吸附劑將細(xì)胞吸附在其表面而用固體吸附劑將細(xì)胞吸附在其表面而使細(xì)胞固定化的方法稱為吸附法使細(xì)胞固定化的方法稱為吸附法（adhesionadhesion）。操作簡便、條件溫和、是）。操作簡便、條件溫和、是動物細(xì)胞固定化中最早研究使用的方法。動物細(xì)胞固定化中最早研究使用的方法。

19、缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：載體的負(fù)荷能力低，細(xì)胞易脫載體的負(fù)荷能力低，細(xì)胞易脫落落。微載體培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)是該方法。微載體培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)是該方法的代表，稍后專門介紹。的代表，稍后專門介紹。 2 2、共價貼附法、共價貼附法: : 利用共價鍵將動物細(xì)胞與固相載體結(jié)利用共價鍵將動物細(xì)胞與固相載體結(jié)合的固定化方法稱為共價貼附法合的固定化方法稱為共價貼附法（attachment by covalent bondingattachment by covalent bonding）。）。此法可減少細(xì)胞的泄漏，但須此法可減少細(xì)胞的泄漏，但須引入化學(xué)試引入化學(xué)試劑，對細(xì)胞活性有影響劑，對細(xì)胞活性有影響，且因貼附而導(dǎo)致，

20、且因貼附而導(dǎo)致擴(kuò)散限制小，細(xì)胞得不到保護(hù)。擴(kuò)散限制小，細(xì)胞得不到保護(hù)。 3 3、離子、離子/ /共價交聯(lián)法共價交聯(lián)法: : 雙功能試劑處理細(xì)胞懸浮液，會在細(xì)雙功能試劑處理細(xì)胞懸浮液，會在細(xì)胞間形成橋而絮結(jié)產(chǎn)生交聯(lián)作用，此固定胞間形成橋而絮結(jié)產(chǎn)生交聯(lián)作用，此固定化細(xì)胞方法稱為離子化細(xì)胞方法稱為離子/ /共價交聯(lián)法共價交聯(lián)法（cross-linking by covalent cross-linking by covalent bondingbonding）。交聯(lián)試劑會使一些細(xì)胞死亡，）。交聯(lián)試劑會使一些細(xì)胞死亡，也會產(chǎn)生擴(kuò)散限制。也會產(chǎn)生擴(kuò)散限制。 4 4、包埋法、包埋法: : 將細(xì)胞包埋在多孔

21、載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞的方法稱為包埋法（的方法稱為包埋法（entrapmententrapment）。）。 優(yōu)點(diǎn)：步驟簡便、條件溫和、負(fù)荷量大、細(xì)優(yōu)點(diǎn)：步驟簡便、條件溫和、負(fù)荷量大、細(xì)胞泄漏少，抗機(jī)械剪切。胞泄漏少，抗機(jī)械剪切。 缺點(diǎn)：擴(kuò)散限制，并非所有細(xì)胞都處于最佳缺點(diǎn)：擴(kuò)散限制，并非所有細(xì)胞都處于最佳基質(zhì)濃度，且大分子基質(zhì)不能滲透到高聚物網(wǎng)基質(zhì)濃度，且大分子基質(zhì)不能滲透到高聚物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部。一般適用于非貼壁依賴型細(xì)胞的固定絡(luò)內(nèi)部。一般適用于非貼壁依賴型細(xì)胞的固定化，常用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、?；?，常用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖

22、維蛋白。藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。 石蠟切片中底部薄層軟蠟包埋法石蠟切片中底部薄層軟蠟包埋法甲基丙烯酸甲酯包埋標(biāo)本甲基丙烯酸甲酯包埋標(biāo)本微囊型包埋法微囊型包埋法5 5、微囊法（、微囊法（microencapsulationmicroencapsulation）: : 用一層親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的用一層親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營養(yǎng)微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小培養(yǎng)環(huán)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少受損傷，境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少受損傷，故細(xì)胞生長好、密度高。

23、微囊直徑控制在故細(xì)胞生長好、密度高。微囊直徑控制在200-200-400m400m為宜。為宜。第二節(jié)第二節(jié) 大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式式 深層培養(yǎng)可分為深層培養(yǎng)可分為: :l分批式分批式l流加式流加式l半連續(xù)式半連續(xù)式l連續(xù)式連續(xù)式l連續(xù)式連續(xù)式l灌注式灌注式 一、分批式培養(yǎng)（一、分批式培養(yǎng)（batch culturebatch culture） 較早期的方式，采用機(jī)械攪拌式生較早期的方式，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)物反應(yīng)器，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng) 一次性收獲一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基。細(xì)胞、產(chǎn)物、

24、培養(yǎng)基。 特點(diǎn)特點(diǎn): :操作簡單，培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變的風(fēng)險小操作簡單，培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變的風(fēng)險小直觀反映細(xì)胞生長代謝的過程。直觀反映細(xì)胞生長代謝的過程?？芍苯臃糯??？芍苯臃糯蟆?細(xì)胞的生長分：延滯期、對數(shù)生長期、減細(xì)胞的生長分：延滯期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期五個階段。速期、平穩(wěn)期和衰退期五個階段。 分批培養(yǎng)的周期多在分批培養(yǎng)的周期多在3-53-5天，天，細(xì)胞生長動細(xì)胞生長動力學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞先經(jīng)歷對數(shù)生長期（力學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞先經(jīng)歷對數(shù)生長期（48-48-72h72h）細(xì)胞密度達(dá)到最高值后，由于營養(yǎng)）細(xì)胞密度達(dá)到最高值后，由于營養(yǎng)物質(zhì)耗竭或代謝毒副產(chǎn)物的累積細(xì)胞生長物質(zhì)耗竭

25、或代謝毒副產(chǎn)物的累積細(xì)胞生長進(jìn)入衰退期進(jìn)而死亡，表現(xiàn)出典型的生長進(jìn)入衰退期進(jìn)而死亡，表現(xiàn)出典型的生長周期。周期。收獲產(chǎn)物通常是在細(xì)胞快要死亡前收獲產(chǎn)物通常是在細(xì)胞快要死亡前或已經(jīng)死亡后進(jìn)行?；蛞呀?jīng)死亡后進(jìn)行。 二、流加式培養(yǎng)二、流加式培養(yǎng)（feeding culturefeeding culture） 細(xì)胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終細(xì)胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的體積的1/21/21/31/3，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基，通常在細(xì)胞進(jìn)入衰亡的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基，通常在細(xì)胞進(jìn)入衰亡期或衰亡

26、期后進(jìn)行終止回收整個反應(yīng)體系，期或衰亡期后進(jìn)行終止回收整個反應(yīng)體系，分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮、純化目標(biāo)蛋分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮、純化目標(biāo)蛋白。白。 1、流加培養(yǎng)物的方式、流加培養(yǎng)物的方式 流加的時間通常在指數(shù)生長后期，細(xì)胞進(jìn)入衰流加的時間通常在指數(shù)生長后期，細(xì)胞進(jìn)入衰退期之前，添加高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)。退期之前，添加高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)。流加的總體原則是維持細(xì)胞。流加的總體原則是維持細(xì)胞生長相對穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，營養(yǎng)成分既不過剩生長相對穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，營養(yǎng)成分既不過剩而產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成營養(yǎng)利用效率下而產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成營養(yǎng)利用效率下降而成為無效的利用；也不缺乏導(dǎo)致細(xì)胞生長降而成為無效的利

27、用；也不缺乏導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制或死亡。抑制或死亡。 2 2、流加工藝中的營養(yǎng)成分（三大類）：、流加工藝中的營養(yǎng)成分（三大類）： 葡萄糖：葡萄糖：供能物質(zhì)、碳源物質(zhì)供能物質(zhì)、碳源物質(zhì)，濃度較高則濃度較高則產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要控制濃度，產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要控制濃度，以足夠維持細(xì)胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)以足夠維持細(xì)胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。物的濃度為佳。 谷氨酰胺：谷氨酰胺：供能物質(zhì)、氮源物質(zhì)供能物質(zhì)、氮源物質(zhì)，需要控制濃需要控制濃度。度。 大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡，大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡，。氨基酸、維生素及其他：氨基酸、維生素及其他：必需氨基酸、非必需必需氨基酸

28、、非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營養(yǎng)成谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營養(yǎng)成分如膽堿、生長刺激因子。分如膽堿、生長刺激因子。三、三、半連續(xù)式培養(yǎng)半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuous semi-continuous cultureculture） 1 1、又稱重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。、又稱重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間式。在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時間，隔一段時間，從中取出

29、部分培養(yǎng)物從中取出部分培養(yǎng)物，再用再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。的總體積不變。 2 2、半連續(xù)式特點(diǎn)：、半連續(xù)式特點(diǎn)： 培養(yǎng)物的體積逐步增加；培養(yǎng)物的體積逐步增加； 可進(jìn)行多次收獲；可進(jìn)行多次收獲； 細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長時間。時間。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長時期進(jìn)行生優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長時期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直

30、保持在較高的水平。在動物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生直保持在較高的水平。在動物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。 四、連續(xù)式培養(yǎng)四、連續(xù)式培養(yǎng)（continuous culturecontinuous culture） 1、常見的懸浮培養(yǎng)模式：采用機(jī)械攪拌式常見的懸浮培養(yǎng)模式：采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。生物反應(yīng)器系統(tǒng)。在細(xì)胞達(dá)最大密度之前，在細(xì)胞達(dá)最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基（養(yǎng)基（）；同時，）；同時，含有細(xì)含有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定出，以保持培養(yǎng)體積

31、的恒定。理論上講，。理論上講，該過程可無限延續(xù)下去。該過程可無限延續(xù)下去。 2 2、連續(xù)式培養(yǎng)的特點(diǎn)：、連續(xù)式培養(yǎng)的特點(diǎn)： 細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長；細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長； 產(chǎn)物體積不斷增長；產(chǎn)物體積不斷增長； 可控制衰退期與下降期?？煽刂扑ネ似谂c下降期。 連續(xù)式培養(yǎng)連續(xù)式培養(yǎng) 3、優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：l 培養(yǎng)狀態(tài)恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。培養(yǎng)狀態(tài)恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。l 穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長期。期。l 在穩(wěn)定狀態(tài)下細(xì)胞所處的環(huán)境條件可維持不變在穩(wěn)定狀態(tài)下細(xì)胞所處的環(huán)境條件可維持不變（如營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、如營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、p

32、HpH值可保持恒定，細(xì)值可保持恒定，細(xì)胞濃度以及細(xì)胞比生長速率）胞濃度以及細(xì)胞比生長速率）。l 細(xì)胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響，細(xì)胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響，特別是生物反應(yīng)器的主要營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷特別是生物反應(yīng)器的主要營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺，維持在一個較低的水平，從而使他們氨酰胺，維持在一個較低的水平，從而使他們的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。 4 4、不足：、不足： 由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長，容由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長，容易造成污染；易造成污染； 在長周期的連續(xù)培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長特性以在長周期的連續(xù)培養(yǎng)中，

33、細(xì)胞的生長特性以及分泌產(chǎn)物容易變異；及分泌產(chǎn)物容易變異； 對設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。對設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。 五、灌流式培養(yǎng)五、灌流式培養(yǎng)（perfusion cultureperfusion culture） 1 1、把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)、把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出件培養(yǎng)基取出，同時又連續(xù)不斷地灌注新的同時又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分條件培它與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而

34、半連養(yǎng)基時，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時同時也取出了部分細(xì)胞。續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時同時也取出了部分細(xì)胞。 一種是用攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，一種是用攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，這種反應(yīng)器必須具有細(xì)胞截流裝置，細(xì)胞這種反應(yīng)器必須具有細(xì)胞截流裝置，細(xì)胞截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過濾或旋轉(zhuǎn)膜截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過濾或旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)系統(tǒng)，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)?；蛲肝鱿到y(tǒng)。 如：中空纖維生物反應(yīng)器如：中空纖維生物反應(yīng)器灌流式培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要有兩種形式：灌流式培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要有兩種形式：中空纖維反應(yīng)器示意圖中空纖維反應(yīng)

35、器示意圖 中空纖維半透膜可透過小分子量的產(chǎn)物和底物，中空纖維半透膜可透過小分子量的產(chǎn)物和底物，截流細(xì)胞和分子量較大的產(chǎn)物截流細(xì)胞和分子量較大的產(chǎn)物，在連續(xù)灌流過，在連續(xù)灌流過程中將絕大部分細(xì)胞截留在反應(yīng)器內(nèi)；近年中程中將絕大部分細(xì)胞截留在反應(yīng)器內(nèi)；近年中空纖維生物反應(yīng)器被廣泛用于產(chǎn)物分泌性動物空纖維生物反應(yīng)器被廣泛用于產(chǎn)物分泌性動物細(xì)胞的生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單細(xì)胞的生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體?？寺】贵w。 細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基出口培養(yǎng)基出口空氣與空氣與CO2出口出口空氣與空氣與CO2入口入口培養(yǎng)基入口培養(yǎng)基入口 固定床是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝固定床是在反應(yīng)器中裝配

36、固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細(xì)胞可附著在載體上生長，填聚脂纖維載體，細(xì)胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負(fù)壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營養(yǎng)負(fù)壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細(xì)胞在載體中高密度生長。流化床生物反應(yīng)器細(xì)胞在載體中高密度生長。流化床生物反應(yīng)器是通過流體的上升運(yùn)動使固體顆粒維持在懸浮是通過流體的上升運(yùn)動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)，適合于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)。狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)，適合于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)。 另一種形式是固定床或流化

37、床生物反應(yīng)器另一種形式是固定床或流化床生物反應(yīng)器軸向絕熱式軸向絕熱式 徑向絕熱式徑向絕熱式 列管式列管式固定床反應(yīng)器固定床反應(yīng)器：氣體流經(jīng)固定不動的催氣體流經(jīng)固定不動的催化劑床層進(jìn)行催化反應(yīng)化劑床層進(jìn)行催化反應(yīng)的裝置的裝置流化床反應(yīng)器：流化床反應(yīng)器：固體顆粒被流體吹起呈懸浮狀態(tài)，可作上下左固體顆粒被流體吹起呈懸浮狀態(tài)，可作上下左右劇烈運(yùn)動和翻動，好象是液體沸騰一樣，故右劇烈運(yùn)動和翻動，好象是液體沸騰一樣，故流化床反應(yīng)器又稱沸騰床反應(yīng)器。流化床反應(yīng)器又稱沸騰床反應(yīng)器。1旋風(fēng)分離器旋風(fēng)分離器2筒體擴(kuò)大段筒體擴(kuò)大段3催化劑入口催化劑入口4筒體筒體5冷卻介質(zhì)出口冷卻介質(zhì)出口6換熱器換熱器7冷卻介質(zhì)進(jìn)口

38、冷卻介質(zhì)進(jìn)口8氣體分布板氣體分布板9催化劑出口催化劑出口10反應(yīng)氣入口反應(yīng)氣入口 2 2、灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：、灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)： 細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞或酶細(xì)胞或酶保留在反應(yīng)器內(nèi)，保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)一般可達(dá)10107 7-10-109 9/ml/ml，從，從而較大的而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量；提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量； 連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞穩(wěn)定的處在較好的營連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞穩(wěn)定的處在較好的營養(yǎng)環(huán)境中，養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；有害代謝廢物濃度積累較低； 反應(yīng)速率容易控制，反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長，可提高培養(yǎng)周期較長，可提高生

39、產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高； 產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時回收到低溫產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時回收到低溫下保存，下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。有利于保持產(chǎn)品的活性。 六、細(xì)胞工廠培養(yǎng)六、細(xì)胞工廠培養(yǎng) 聚苯乙烯材料，無菌，聚苯乙烯材料，無菌，長度長度335mm335mm，寬度，寬度205mm205mm 這套系統(tǒng)使用很方便，可產(chǎn)生類似塑料培養(yǎng)瓶這套系統(tǒng)使用很方便，可產(chǎn)生類似塑料培養(yǎng)瓶的效果。由組織培養(yǎng)級聚苯乙烯制成，使用后的效果。由組織培養(yǎng)級聚苯乙烯制成，使用后可隨意處理。其最大缺點(diǎn)是：經(jīng)胰酶消化后，可隨意處理。其最大缺點(diǎn)是：經(jīng)胰酶消化后，很難將細(xì)胞完全洗出。很難將細(xì)胞完全

40、洗出。 第四節(jié)第四節(jié) 動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡介簡介 動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)能否大規(guī)模工業(yè)化、商業(yè)化，動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)能否大規(guī)模工業(yè)化、商業(yè)化，關(guān)鍵在于能否設(shè)計(jì)出合適的生物反應(yīng)器。首先關(guān)鍵在于能否設(shè)計(jì)出合適的生物反應(yīng)器。首先必須滿足在低剪切力及良好的混合狀態(tài)下，能必須滿足在低剪切力及良好的混合狀態(tài)下，能夠提供充足的氧以供細(xì)胞生長及細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)物夠提供充足的氧以供細(xì)胞生長及細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)物的合成。的合成。 細(xì)胞培養(yǎng)罐細(xì)胞培養(yǎng)罐一、生物反應(yīng)器分類一、生物反應(yīng)器分類 1.1.懸浮培養(yǎng)用反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)用反應(yīng)器：如攪拌反應(yīng)器、：如攪拌反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反

41、應(yīng)中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器；器、氣升式反應(yīng)器； 2.2.貼壁培養(yǎng)用反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)用反應(yīng)器：如攪拌反應(yīng)器：如攪拌反應(yīng)器（微載體培養(yǎng)）、玻璃珠床反應(yīng)器、中空纖（微載體培養(yǎng)）、玻璃珠床反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器；維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器； 3.3.包埋培養(yǎng)用反應(yīng)器包埋培養(yǎng)用反應(yīng)器：如流化床反應(yīng)器、：如流化床反應(yīng)器、固化床反應(yīng)器。固化床反應(yīng)器。 按其培養(yǎng)細(xì)胞的方式不同，可分三類：按其培養(yǎng)細(xì)胞的方式不同，可分三類： 二、攪拌罐生長反應(yīng)器二、攪拌罐生長反應(yīng)器 最經(jīng)典、最早被采用。針對動物細(xì)胞培養(yǎng)的特最經(jīng)典、最早被采用。針對動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，采

42、用了不同的攪拌器及通氣方式。通過攪點(diǎn)，采用了不同的攪拌器及通氣方式。通過攪拌器的作用使細(xì)胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液中均勻分布，拌器的作用使細(xì)胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液中均勻分布，使養(yǎng)分充分被細(xì)胞利用，并增大氣液接觸面，使養(yǎng)分充分被細(xì)胞利用，并增大氣液接觸面，有利于氧的傳遞。有利于氧的傳遞。三、氣升式生物反應(yīng)器三、氣升式生物反應(yīng)器 19791979年首次成功應(yīng)用氣升式生物反應(yīng)器進(jìn)行了年首次成功應(yīng)用氣升式生物反應(yīng)器進(jìn)行了動物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。氣升式生物反應(yīng)器的優(yōu)動物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。氣升式生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)：點(diǎn)： 罐內(nèi)液體流動溫和均勻，產(chǎn)生剪切力小，對罐內(nèi)液體流動溫和均勻，產(chǎn)生剪切力小，對細(xì)胞損傷較??；細(xì)胞損傷較小； 可直

43、接噴射空氣供氧，因而氧傳遞率較高；可直接噴射空氣供氧，因而氧傳遞率較高； 液體循環(huán)量大，細(xì)胞和養(yǎng)分都能均勻分布于液體循環(huán)量大，細(xì)胞和養(yǎng)分都能均勻分布于培養(yǎng)液中；培養(yǎng)液中； 結(jié)構(gòu)簡單，利于密封并降低了造價。結(jié)構(gòu)簡單，利于密封并降低了造價。 四、鼓泡式生物反應(yīng)器四、鼓泡式生物反應(yīng)器 與氣升式反應(yīng)器相類似，是利用氣體鼓泡來進(jìn)與氣升式反應(yīng)器相類似，是利用氣體鼓泡來進(jìn)行供氧及混合，其設(shè)計(jì)原理與氣升式生物反應(yīng)行供氧及混合，其設(shè)計(jì)原理與氣升式生物反應(yīng)器也相同。器也相同。 五、中空纖維生物反應(yīng)器五、中空纖維生物反應(yīng)器 用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的

44、培養(yǎng)。于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。板框式中空纖維反應(yīng)器板框式中空纖維反應(yīng)器 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 占地空間少；占地空間少； 細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá)細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá)10109 9數(shù)量級；數(shù)量級； 生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時間長，適用生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時間長，適用于長期分泌的細(xì)胞。于長期分泌的細(xì)胞。 液營養(yǎng)液營養(yǎng) 中空纖維板中空纖維板注意幾個問題：注意幾個問題：( (一一) )細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境(1)(1)氨離子：細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是提氨離子：細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是提高細(xì)胞密度的主要限制因素。高細(xì)胞密度的主要限制因素。(2)(2)乳酸：高乳酸濃度必將抑制細(xì)胞生長乳酸：高乳

45、酸濃度必將抑制細(xì)胞生長(3)(3)二氧化碳：二氧化碳積聚，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作二氧化碳：二氧化碳積聚，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用或者改變細(xì)胞代謝水平。用或者改變細(xì)胞代謝水平。 (4)(4)甲基乙二醛甲基乙二醛( (Mc)Mc)：對細(xì)胞有潛在的損傷作用對細(xì)胞有潛在的損傷作用(5)(5)滲透壓：恒定、適宜滲透壓：恒定、適宜(6)(6)載體：可考慮載體：可考慮采用多孔徑載體采用多孔徑載體替代容易使細(xì)胞替代容易使細(xì)胞受機(jī)械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。受機(jī)械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。( (二二) )細(xì)胞死亡與凋亡細(xì)胞死亡與凋亡 大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的后期，維持細(xì)胞高的活力是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的后期，維持細(xì)胞高的活力是個富有挑戰(zhàn)

46、性的課題。最初的研究似乎表明細(xì)個富有挑戰(zhàn)性的課題。最初的研究似乎表明細(xì)胞死亡大多由于壞死，而人們逐漸認(rèn)識到至少胞死亡大多由于壞死，而人們逐漸認(rèn)識到至少是一些細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中死亡主要原因是是一些細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中死亡主要原因是細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡。 用基因工程方法將用基因工程方法將bcl2bcl2基因這種細(xì)胞凋基因這種細(xì)胞凋亡抑制基因?qū)爰?xì)胞，亡抑制基因?qū)爰?xì)胞，bcl2bcl2基因的過量表達(dá)基因的過量表達(dá)能抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)能抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)量。量。 大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，可通過大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，可通過“細(xì)胞靜止細(xì)胞靜止”過程來降低營養(yǎng)

47、成分消耗和代謝毒物產(chǎn)生。過程來降低營養(yǎng)成分消耗和代謝毒物產(chǎn)生。 ( (三三) ) 培養(yǎng)基與細(xì)胞系培養(yǎng)基與細(xì)胞系 動物細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞賴以生長、增殖的重動物細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞賴以生長、增殖的重要因素。天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清要因素。天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清培養(yǎng)基開發(fā)成為當(dāng)今細(xì)胞領(lǐng)域的一大課題。培養(yǎng)基開發(fā)成為當(dāng)今細(xì)胞領(lǐng)域的一大課題。 無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢在于避免血清的批次、質(zhì)無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢在于避免血清的批次、質(zhì)量、成分等對細(xì)胞造成的污染、毒性和不利于量、成分等對細(xì)胞造成的污染、毒性和不利于產(chǎn)品純化等不良影響。產(chǎn)品純化等不良影響。 在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生物在生產(chǎn)疫苗、

48、單抗和各種生物活性蛋白等生物制品的應(yīng)用領(lǐng)域中，優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的成分制品的應(yīng)用領(lǐng)域中，優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的成分可使不同的細(xì)胞在最有利于細(xì)胞生長和表達(dá)目可使不同的細(xì)胞在最有利于細(xì)胞生長和表達(dá)目的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。( (四四) )過程監(jiān)控過程監(jiān)控 測量在線氧吸收速率確定從細(xì)胞生長期生產(chǎn)病測量在線氧吸收速率確定從細(xì)胞生長期生產(chǎn)病毒到病毒感染期和細(xì)胞死亡后終止感染的轉(zhuǎn)換毒到病毒感染期和細(xì)胞死亡后終止感染的轉(zhuǎn)換時間；時間； 用在線葡萄糖分析儀的測定調(diào)整灌流速度；用在線葡萄糖分析儀的測定調(diào)整灌流速度； 測定氧消耗估計(jì)營養(yǎng)供應(yīng)率的代謝負(fù)荷；測定氧消耗估計(jì)營養(yǎng)供應(yīng)率的代謝

49、負(fù)荷； 測定氧吸收速率估測測定氧吸收速率估測ATPATP的形成；的形成； 測量在線氧化還原能力作為活細(xì)胞濃度的指標(biāo)測量在線氧化還原能力作為活細(xì)胞濃度的指標(biāo)等均得以應(yīng)用。等均得以應(yīng)用。測定在線氧吸收速率并用質(zhì)譜儀分析廢氣中測定在線氧吸收速率并用質(zhì)譜儀分析廢氣中二氧化碳呼出率計(jì)算呼吸商。一般來說，呼吸商二氧化碳呼出率計(jì)算呼吸商。一般來說，呼吸商應(yīng)接近應(yīng)接近1.01.0，這就要求細(xì)胞培養(yǎng)中盡量降低氧消耗，這就要求細(xì)胞培養(yǎng)中盡量降低氧消耗和二氧化碳排出。和二氧化碳排出。用親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)進(jìn)行在線蛋白用親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)進(jìn)行在線蛋白質(zhì)含量測定。另外，用在線蛋白分解與反相質(zhì)含量測定。另外

50、，用在線蛋白分解與反相色譜監(jiān)測重組蛋白的糖基化以了解產(chǎn)品的一色譜監(jiān)測重組蛋白的糖基化以了解產(chǎn)品的一致性。致性。計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)法( (細(xì)胞運(yùn)輸細(xì)胞運(yùn)輸) )當(dāng)前培養(yǎng)細(xì)胞既在國內(nèi)進(jìn)行寄贈、交換和購買，也在當(dāng)前培養(yǎng)細(xì)胞既在國內(nèi)進(jìn)行寄贈、交換和購買，也在國際交流，為此需要裝運(yùn)細(xì)胞的方法。國際交流，為此需要裝運(yùn)細(xì)胞的方法。一種是用液氮或干冰貯存運(yùn)輸，需要特殊容器，較麻一種是用液氮或干冰貯存運(yùn)輸，需要特殊容器，較麻煩，且不適于長時間運(yùn)行。另一方法為充液法，方便當(dāng)行，煩，且不適于長時間運(yùn)行。另一方法為充液法，方便當(dāng)行，是當(dāng)前多采用的方法。是當(dāng)前多采用的方法。具體方法：具體方法：選生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，待培養(yǎng)近單層后，去掉培養(yǎng)選生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，待培養(yǎng)近單層后，去掉培養(yǎng)液充滿新培養(yǎng)液。液量要達(dá)培養(yǎng)瓶頸部，擰緊螺帽或塞一液充滿新培養(yǎng)液。液量要達(dá)培養(yǎng)瓶頸部，擰緊螺帽或塞一吸塞，保留微量空氣。空氣留量過多，運(yùn)輸時大氣泡來回吸塞，保留微量空氣?？諝饬袅窟^多，運(yùn)輸時大氣泡來回流動流動對細(xì)胞有干擾作用。對細(xì)胞有干擾作用。一般經(jīng)一般經(jīng)4 45 5天運(yùn)