新剛才傳這幾個(gè)是啥來(lái)著

1、金線蓮組培快繁技術(shù)研究 【摘要】  目的建立金線蓮快繁體系。方法以莖段為外植體，開(kāi)展了莖段不同部位、培養(yǎng)基、激素、有機(jī)物和活性炭對(duì)不定芽增殖、幼苗生長(zhǎng)的影響研究，并進(jìn)行了移栽試驗(yàn)。結(jié)果外植體以不含頂芽和長(zhǎng)根的中間段莖節(jié)為好；不定芽增殖最佳培養(yǎng)基配方為MS（或B5）+BA3.0 mg/L +NAA0.51.0 mg/L，兩個(gè)月增殖倍數(shù)達(dá)5.0以上；壯苗最適培養(yǎng)基為1/2MSNAA3.0 mg/L6-BA 0.5 mg/L香蕉提取物20%（或椰子汁20%）；試管苗移栽適宜的基質(zhì)為菜園土1份23 mm粗砂2份（或1份）木屑1份（或2份），3個(gè)月成活率均達(dá)100%，且生長(zhǎng)良好。結(jié)論采用上述方

2、法，能實(shí)現(xiàn)金線蓮幼苗的快速繁殖。 【關(guān)鍵詞】  金線蓮； 快速繁殖； 增殖； 生長(zhǎng)； 移栽金線蓮Anoectochilus roxburghii（wall.）lindl為蘭科開(kāi)唇蘭屬多年生草本，別名金蠶、金線蘭、金線虎頭蕉等，是我國(guó)傳統(tǒng)珍貴藥材，素有“金草”“神藥”“烏人參”等美稱，在民間應(yīng)用范圍較廣，廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、高血壓病、糖尿病、腎病等疑難雜癥的治療和強(qiáng)身健體、病后體虛恢復(fù)等方面，在浙江、福建、臺(tái)灣等省和東南亞地區(qū)被視為珍稀名貴藥材，特別在臺(tái)灣省更是備受青睞，被稱為“藥中之王”1，2。    金線蓮種子微小，由未成熟的胚及數(shù)層種皮細(xì)胞構(gòu)成，

3、自然萌發(fā)率和繁殖率低，目前市場(chǎng)上貨源主要來(lái)自于野生采挖，產(chǎn)品一直處于供不應(yīng)求的狀況。近年來(lái)，隨著對(duì)其藥效學(xué)和臨床應(yīng)用研究的深入，對(duì)金線蓮藥用價(jià)值的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步提高，其市場(chǎng)貨源緊缺的狀況更為嚴(yán)峻，野生資源也不斷遭到破壞性采挖，以致于處于瀕臨滅絕之地。本研究旨在采用組織培養(yǎng)技術(shù)，解決金線蓮種苗來(lái)源，加快人工栽培，以保護(hù)金線蓮野生資源、穩(wěn)定市場(chǎng)供應(yīng)?，F(xiàn)將有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。1  材料與方法1.1  材料  無(wú)菌繁殖體系的建立為浙江金線蓮野生種源，其它實(shí)驗(yàn)為繼代培養(yǎng)的不定芽及無(wú)根幼苗莖段。1.2  無(wú)菌繁殖體系的建立取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害的植株，去葉后放入低濃度的洗衣

4、粉水中漂洗35 min，然后用流水沖洗30 min。在超靜工作臺(tái)前，用75% 酒精濕潤(rùn)56 s，放入0.1%的HgCl溶液滅菌1213 min，用無(wú)菌水沖洗56次。將消毒好的莖按上段（具莖尖）、中段和下段（匍匐莖段）切成長(zhǎng)約1.52 cm，帶有12個(gè)節(jié)間的小段，分別接種于MS+6BA 4.0 mg/L +NAA 0.4 mg/L 培養(yǎng)基上，pH5.6，蔗糖2.5%，瓊脂0.7%。培養(yǎng)條件為：溫度(25±2） ，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度1 5002 000 lx。1.3  不定芽誘導(dǎo)1.3.1  基本培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響采用單因素實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基選用MS（Mu

5、rashige-Skoog）3，1/2MS（大量元素減半，其他成分不變），VW(Vacin & Went)，B5（Gamborg·Miller & Ojima）和KC(Knudson C)等5種，分別添加6BA 4.0mg/L，NAA 1.0 mg/L。1.3.2  激素對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同種類及濃度的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素。    上述實(shí)驗(yàn)選取無(wú)菌健壯植株，切取長(zhǎng)約11.5 cm，帶有一個(gè)節(jié)間的莖中段，每處理接10個(gè)莖節(jié)，重復(fù)3次。培養(yǎng)期間定時(shí)觀察不定芽生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)。其它條件同實(shí)驗(yàn)

6、“1.2”項(xiàng)。1.4  壯苗培養(yǎng)1.4.1  激素對(duì)幼苗生長(zhǎng)和發(fā)根的影響以1/2MS為基本培養(yǎng)基，NAA設(shè)15 mg/L 5個(gè)處理，6BA設(shè)0.5，1.0和1.5 mg/L 3個(gè)處理，共15個(gè)處理。1.4.2  添加物對(duì)幼苗生長(zhǎng)和發(fā)根的影響以1/2MSNAA 2.0 mg/L6BA 0.5 mg/L為基本培養(yǎng)，考察馬鈴薯提取物、香蕉提取物、蘋果提取物、椰子汁等4種天然有機(jī)物和活性炭對(duì)金線蓮幼苗生長(zhǎng)的影響。    上述每種培養(yǎng)基均接入經(jīng)增殖培養(yǎng)高約3 cm，具34節(jié)間、有12片的無(wú)根幼苗，每處理接種接無(wú)根幼苗10株，重復(fù)3次。培養(yǎng)后每隔

7、15 d觀察生長(zhǎng)情況1次，至3個(gè)月考察每株凈增加的葉片數(shù)、重量及發(fā)根數(shù)，并進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析。1.5  移栽  選苗高約68 cm，莖基直徑約2 mm，叢生根有23條的試管苗，煉苗4 d后，洗凈附著在植株上的培養(yǎng)基，并晾干洗滌水后移人直徑為15 cm，裝有不同基質(zhì)的土盆中，考察不同基質(zhì)對(duì)金線蓮試管苗成活率的影響。移栽前，實(shí)驗(yàn)基質(zhì)均用45%多菌靈可濕性粉劑800倍溶液澆透消毒。實(shí)驗(yàn)條件為遮蔭度80%的蔭棚，保持空氣相對(duì)濕度的80%90%。如發(fā)現(xiàn)有病死植株，及時(shí)拔除。每處理5盆，每盆種5株，重復(fù)3次，移栽3個(gè)月后考察成活株數(shù)，并進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析。2  結(jié)果2.1

8、0; 無(wú)菌繁殖體系的建立  實(shí)驗(yàn)表明，外植體莖段的分化程度對(duì)誘導(dǎo)結(jié)果存在一定的影響。從表1可知，上、中段莖均能萌動(dòng)生長(zhǎng)。上段莖因有頂芽的存在，頂端優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)較為強(qiáng)烈，因而以生長(zhǎng)為主，不定芽發(fā)生較少，平均芽增殖數(shù)為0.6個(gè)；中段莖不定芽發(fā)生快、量大、長(zhǎng)勢(shì)好，平均芽增殖數(shù)為4.05個(gè)，并形成多枝叢生狀。下段莖由于組織相對(duì)老化，雖有不定芽發(fā)生，但發(fā)生量與生長(zhǎng)勢(shì)均較弱。這和陳自力4報(bào)道的結(jié)果一致。    從實(shí)驗(yàn)中觀察到，不定芽的產(chǎn)生以側(cè)芽萌生為主。一般在培養(yǎng)1520 d后，莖節(jié)上潛伏的葉腋芽萌動(dòng)膨大，芽叢在節(jié)的四周萌出，起初為白色略帶黃色，隨著培養(yǎng)時(shí)間加長(zhǎng)，芽不斷

9、伸展，逐漸轉(zhuǎn)為黃綠色，形成主芽。葉腋芽是單生的，極個(gè)別節(jié)上能對(duì)生兩個(gè)腋芽，未發(fā)現(xiàn)莖部或切口處長(zhǎng)出不定芽。培養(yǎng)30 d左右，主芽基部的節(jié)再生側(cè)芽(稱一級(jí)側(cè)芽)，45 d左右一級(jí)側(cè)芽節(jié)上又可發(fā)生二級(jí)側(cè)芽，隨著芽的生長(zhǎng)、出現(xiàn)葉片，節(jié)處毛并產(chǎn)生根，外被濃密的白色絨毛，從而形成完整小植株。培養(yǎng)3個(gè)月后每天觀察，側(cè)芽分生組織的增殖，一般只出現(xiàn)主芽和一二級(jí)側(cè)芽或苗；培養(yǎng)5個(gè)月以上，主芽、側(cè)芽較高，葉片較多、大，只有少數(shù)出現(xiàn)三級(jí)側(cè)芽或苗。這種腋芽萌生的增殖形成了主軸分枝型的芽苗，隨培養(yǎng)時(shí)間或繼代繁殖代數(shù)的增加，或激素的作用，芽或苗因節(jié)間短，多數(shù)為形成似不定芽或叢生苗。培養(yǎng)過(guò)程中，未見(jiàn)愈傷組織，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有原球

10、莖和類原球莖產(chǎn)生。表1  金線蓮莖段外植體不定芽誘導(dǎo)（略）2.2  不定芽誘導(dǎo)2.2.1  基本培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響以金線蓮的莖節(jié)段作為外植體，腋芽能快速萌發(fā)出不定芽體。經(jīng)60 d的培養(yǎng)，增殖倍數(shù)可達(dá)3.15.4倍。但基本培養(yǎng)基對(duì)不定芽的誘導(dǎo)具有明顯的影響，MS，B5培養(yǎng)基不定芽增殖率分別為5.4倍與5.2倍，比其它培養(yǎng)基增加23.8%74.2%。表2  基本培養(yǎng)基對(duì)金線蓮不定芽誘導(dǎo)的影響（略）經(jīng)LSR差異顯著性測(cè)定，MS，B5培養(yǎng)基之間無(wú)明顯差異，與1/2MS，KC和VW之間存在極顯著差異，且MS，B5培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽色綠、粗壯（見(jiàn)表2），

11、表明MS，B5培養(yǎng)基適合作為金線蓮莖段不定芽誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基5。2.2.2  激素對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響  激素種類、水平與配比對(duì)組織培養(yǎng)快速繁殖在效率存在明顯的影響，6-BA、KT和NAA是3種常用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，其添加量對(duì)金線蓮不定芽增殖的影響很大。結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可知，同為細(xì)胞分裂素的6-BA，KT在相同的添加量下對(duì)不定芽的增殖效果差異極顯著，6-BA比KT的增殖率提高46.0%和55.0%，表明6-BA比KT更適合金線蓮莖節(jié)不定芽的誘導(dǎo)。    6-BA的濃度也影響不定芽誘導(dǎo)效果。在添加量小于4.0 mg/L的情況下，隨濃度的提高，不定芽增殖

12、率明顯上升，添加量為4.0 mg/L的不定芽增殖率比2.0，1.0 mg/L分別提高22.1%和47.6%。當(dāng)6-BA添加量達(dá)到6.0 mg/L時(shí)，其增殖率還出現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明本實(shí)驗(yàn)條件下6-BA添加的適宜量為4.0 mg/L。表3  激素對(duì)金線蓮不定芽誘導(dǎo)的影響（略）生長(zhǎng)素NAA對(duì)金線蓮不定芽的誘導(dǎo)與生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。從表3可以看出，添加了NAA的培養(yǎng)基不定芽增殖量與生長(zhǎng)明顯較不添加的好，芽體粗壯、色濃綠，其中添加0.5 mg/L的表現(xiàn)最好，添加1.0 mg/L的其次，但二者間差異未達(dá)到顯著水平；與其它不添加NAA的相比差異達(dá)極顯著水平。表明在本試驗(yàn)條件下NAA適宜添加的量為

13、0.51.0 mg/L。 2.3  壯苗培養(yǎng)2.3.1  激素對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響  在金線蓮壯苗培養(yǎng)中，NAA較6-BA對(duì)促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)的影響更為明顯。結(jié)果見(jiàn)表4。NAA濃度低于3 mg/L時(shí)，對(duì)幼苗生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，隨濃度的增加，葉片凈增量、發(fā)根數(shù)和鮮重凈增量明顯增加，當(dāng)濃度達(dá)到4.0 mg/L時(shí)，葉片凈增量、發(fā)根數(shù)和鮮重凈增量增加不明顯。6-BA在0.5 mg/L情況下，比不加的具有一定的促進(jìn)作用，但未達(dá)顯著水平；在濃度為1.0 mg/L，1.5 mg/L情況下，葉片凈增量、發(fā)根數(shù)和鮮重凈增量反而減少，但在幼苗基部觀察到叢生狀不定芽的產(chǎn)生，表明6-BA在濃度高于1.

14、0 mg/L情況下，有利于金線蓮不定芽的生成，對(duì)幼苗生長(zhǎng)不利。    從表4也可以看出，處理9、10號(hào)在發(fā)根數(shù)、鮮生凈增量方面較其它處理明顯提高，達(dá)極顯著差異；在葉片凈增量方面，除與處理13、14號(hào)無(wú)明顯差異外，與其它處理之間的差異達(dá)極顯著水平，表明在金線蓮壯苗培養(yǎng)中，NAA適宜添加的量為3.04.0 mg/L，6-BA 添加量為0.5 mg/L或不加。表4  激素對(duì)金線蓮幼苗生長(zhǎng)的影響（略）2.3.2  活性炭與有機(jī)添加物對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響  結(jié)果見(jiàn)表5。從表5可知，不同的添加物對(duì)金線蓮幼苗生長(zhǎng)的影響表現(xiàn)不一，香蕉、椰子汁對(duì)促進(jìn)幼苗生

15、長(zhǎng)最為有利，葉片凈增量、發(fā)根數(shù)和鮮重凈增量均高于其它處理，二者間無(wú)明顯差異；馬鈴薯對(duì)幼苗生長(zhǎng)不利，與其它處理相比均存在極顯著差異水平?；钚蕴繉?duì)金線蓮幼苗生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，在添加0.3%情況下，葉片凈增量、發(fā)根數(shù)和鮮重凈增量與對(duì)照相比均顯著提高，差異達(dá)極顯著水平；但與香蕉、椰子汁處理相比，其促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)的作用不如前二者，除發(fā)根數(shù)無(wú)差異外，葉凈增量與香蕉、椰子汁處理差異達(dá)顯著水平，鮮重凈增量差異達(dá)極顯著水平。同時(shí)觀察到活性炭、香蕉和椰子汁新發(fā)根潔白、粗壯。試驗(yàn)結(jié)果表明添加20%香蕉和椰子汁最適宜金線蓮幼苗的生長(zhǎng)。表5  添加物對(duì)金線蓮幼苗生長(zhǎng)的影響（略）2.4  移栽&#

16、160; 金線蓮試管苗移栽3個(gè)月后的植株成活情況見(jiàn)表6。從表6中可以看出，處理7和處理9保持100%的成活率，處理3和處理8的植株成活率也在93%以上，處理1的成活率最低，僅為56%。經(jīng)LSR差異顯著性測(cè)定，處理3、7、8、9號(hào)之間無(wú)明顯差異，與處理5、6號(hào)差異達(dá)顯著水平、與處理1、2、4號(hào)差異達(dá)極顯著水平。表明在菜園土中加入粗砂、木屑能明顯提高金線蓮試管苗移栽的成活率，適宜添加的比例為1份菜園土中加入粗砂2份、木屑1份或粗砂1份、木屑2份，要求充分混勻。表6  種植基質(zhì)對(duì)金線蓮試管苗移栽成活率的影響（略）3  小結(jié)    金線蓮不同部位的莖間對(duì)不定芽的誘導(dǎo)結(jié)果存在明顯的差異，以不含頂芽和長(zhǎng)根的中間段莖節(jié)為好，不定芽增殖率達(dá)4倍以