腦脈通對骨髓干細胞動員保護大鼠腦缺血損傷的影響

1、腦脈通對骨髓干細胞動員保護大鼠腦缺血損傷的影響 10-09-04 16:57:00 編輯：studa20作者：李建生 劉敬霞 張新峰 任偉宏 田玉收 王丁超【摘要】 目的 研究腦脈通對腦缺血大鼠骨髓干細胞動員 (BMSCs) 在血液和腦組織的變化及腦保護作用的影響。方法 大鼠隨機分為假手術組、模型組、腦脈通組、動員組、腦脈通+動員組，線栓法制備MCAO動物模型。皮下注射人重組粒細胞集落刺激因子(rGCSF)；腦脈通灌胃用藥。檢測大鼠外周血WBC及CD34+、腦組織CD34+變化；觀察神經(jīng)功能和腦組織病理改變；測定腦組織含水量和腦梗死面積。結果 模型組大鼠外周血WBC(8.071.27)109/

2、L和CD34+細胞(3.170.75)個/l增加，3 d達到峰值，各治療組增加更為明顯；聯(lián)合組2和3 d外周血WBC、各時間點CD34+細胞均較動員組增加。各模型組大鼠腦組織CD34+表達增強，7 d達到峰值(33.042.62)個/l；各聯(lián)合組較動員組增強明顯。各模型組大鼠神經(jīng)評分降低、腦含水量增加、腦梗死面積增大、腦組織病理損傷明顯，以7 d顯著；動員組大鼠7和14 d的上述指標改善；各聯(lián)合組較動員組的改善明顯。結論 血液WBC數(shù)CD34+計數(shù)，腦組織、CD34+表達均顯著顯示，腦缺血可引起B(yǎng)MSCs進入外周血并向腦組織歸巢，峰值時間存在差異；GCSF可使BMSCs分布增加；腦脈通使動員后

3、血液和腦組織BMSCs增多、腦組織峰值時間延長，且使其腦保護作用增強。 【關鍵詞】 腦缺血；腦脈通；粒細胞集落刺激因子；骨髓干細胞 【Abstract】 Objective To explore the effect of Naomaitong on mobilization of bone marrow stem cells (BMSCs) in blood and brain tissue and the role in protecting brain in rats with cerebral ischemia. Methods Rats were randomly divided i

4、nto different groups. Middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was duplicated with nylon thread. Rats in groups of mobilization and model were administrated with rGCSF（10 g-1d-1）through subcutaneous injection before 3 d and after 2 d of operation respectively, once a day. Naomaitong was used th

5、rough intragastric administration. On 2, 3, 7 and 14 d after operation, rats blood were taken through abdominal aorta, then white blood cells (WBCs) and CD34+ cells in peripheral blood were determined. Expression of CD34+ cells in rats brain tissue were detected. Rats state, ratio of weight change a

6、nd general neural function score (GNFS) and brain pathologic change were observed, and then rats brain water ratio (BWR) and cerebral infarction size (CIS) were measured. Results Rats mortality increased after operation and the decreases of weight on 7 d were more obvious. Compared to model groups,

7、decreases of weight in treat groups abated. WBCs（8.071.27） and CD34+ cells（3.170.75） in peripheral blood in model group increased obviously and showed the highest level on 3 d after operation. Increases of WBCs and CD34+ cells in rats of treat groups were more obvious. In comparison with that of mob

8、ilization groups, rats WBCs on 2 and 3 d combination groups increased more significantly and CD34+ cells in each combination group were more higher. Expression of CD34+ cells in brain of rats in model groups increased and showed the highest level on 7 d （33.042.62）and the changes showed more obvious

9、 in each mobilization and combination group, especially in each combination group. Rats GNFS were lower in each model groups and BWR, CIS and brain pathologic increased obviously, especially on 7 d model group. The changes aboved improved significantly on 7 and 14 d mobilization groups. Compared to

10、the changes in mobilization groups, the improvement in each combination group showed more obvious.Conclusions BMSCs could enter peripheral blood and move towards brain tissue after cerebral ischemia and the peak is different. rGCSF could make BMSCs increase both in peripheral blood and brain. Meanwh

11、ile, Naomaitong could increase BMSCs which are mobilized and make the peak of BMSCs in brain prolong, as well as enhance the protection against brain injury after cerebral ischemia. 【Key words】 Cerebral ischemia; Rats; Naomaitong; GCSF; BMSCs骨髓干細胞(BMSCs)是具有自我更新和多向分化潛能的原始骨髓細胞，可分化為主要的幾類神經(jīng)細胞，被用于腦組織損傷的保

12、護和修復1。因符合機體自身的反應性修復機制，方法簡便、安全且可避免異基因移植的免疫排斥反應，BMSCs動員在腦缺血損傷的應用方面顯示良好前景2，3。粒細胞集落刺激因子(GCSF)是BMSCs有力的動員劑，可使腦缺血損傷后外周血和腦組織的BMSCs增加，并使其保護腦組織的作用增強。中藥在骨髓干細胞動員保護腦組織受損方面研究有待進一步探索。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥腦脈通(由大黃、人參、川芎、葛根組成)可增強BMSCs移植后的腦保護作用4，本研究擬就其對BMSCs動員后的分布變化及抗腦缺血損傷作用的影響進行探討，為中藥在BMSCs動員治療腦缺血方面的應用提供依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料SD大鼠，S

13、PF級，雌雄各半，34月齡，體重(30050)g，202只，由河南省實驗動物中心提供合格證號：scxk(豫)20050001。人重組粒細胞集落刺激因子注射液(rGCSF，商品名瑞白，山東齊魯制藥廠，規(guī)格：150 g/支)；熒光標記單克隆抗體CD34+ (Santa Cruz產(chǎn)品)；羊抗大鼠IgG生物素(BA1005)、檸檬酸鹽緩沖液(AR0024)、正常山羊血清封閉液(AR0009)、DAB 顯色試劑盒 (AR1022)均由武漢博士德生物工程有限公司提供；腦脈通顆粒 (出膏率15%，由大黃、人參、川芎、葛根組成；河南中醫(yī)學院藥物分析學科提供，5 g/袋)。流式細胞儀(Beckman Coult

14、er Epics，XL)；數(shù)碼相機 (Sony Corpatation，Japan，型號：DSCF717 2002)；光學顯微鏡(Olympus optical Co.LTD，japan，型號：PM10AD)；透射電子顯微鏡(Hitachi，Japan，型號 H7500)；圖像分析系統(tǒng)ImageProplus 5.1(Media Cybernetics Inc，USA，型號41N510044800)。1.2 方法大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、腦脈通組、動員組、腦脈通+動員組 (聯(lián)合組)。假手術組10只大鼠，其余4組均為48只；后4組根據(jù)取材時間又分為2、3、7、14 d組，每組大鼠1

15、2只。分別于術前3 d和術后2 d給動員組、聯(lián)合組大鼠皮下注射rGCSF(10 gkg1d-1)；假手術組、模型組和腦脈通組大鼠皮下注射等容積的生理鹽水，每天1次。假手術組、模型組、動員組分別于造模前4 d用生理鹽水灌胃，腦脈通組和聯(lián)合組以生理鹽水制備的腦脈通懸浮液(40.5 mg/ml)灌胃(40.5 mg100 g-1 d-1)，造模前加灌胃1次，術后每日灌胃1次，直至取材 (灌胃容積為1 ml100 g-1d-1)，每周根據(jù)大鼠體重調(diào)整灌胃藥物的用量和灌胃體積5。各組大鼠均于術前禁食12 h，不禁水。參照改良的Longa法用線栓阻塞大鼠大腦中動脈制備局灶性腦缺血動物模型 (MCAO)6。

16、10水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待完全麻醉后，仰臥位固定大鼠，行頸前正中切口，左側鈍性分離頸總動脈(CCA)；分離頸內(nèi)外動脈，穿線備用，結扎翼顎動脈，于頸外動脈近動脈分叉處剪口，栓線穿入頸內(nèi)動脈，緩慢推進，直至感覺有阻力為止，穿線成功后縫合皮膚。假手術組除不穿入栓線外，其余操作相同。手術過程中保持大鼠肛溫(37.00.5)，保持室溫(261)。術后注射青霉素鈉(1萬U100 g-1d-1)，以防感染。假手術組大鼠術后14 d取材，其余各組分別于術后2、3、7、14 d觀察大鼠一般狀況，大鼠稱重，進行神經(jīng)功能評測；麻醉大鼠，腹主動脈取血5 ml，注入EDTA3K試管，流式細胞儀測定血白細胞計數(shù)及C

17、D34+細胞數(shù)量；4%多聚甲醛溶液經(jīng)升主動脈進行灌注固定，取出全腦，4生理鹽水沖洗3遍，除去積血，濾紙吸去表面水分，去除嗅球、小腦和腦干。冰盤上迅速分離大腦半球，棄去右側，取左側半球，從額極向后冠狀切取腦組織3 mm，待測腦組織含水量；依次向后冠狀切取腦組織1 mm，迅速投入備好的內(nèi)盛2%的TTC溶液，37避光育孵30 min，然后用10%的甲醛固定15 min，觀察染色效果，待測腦梗死面積；向后冠狀切取2 mm厚的腦組織投入備好的內(nèi)盛多聚甲醛的小瓶內(nèi)固定，待做腦組織病理和免疫組化檢測；其余標本液氮冷存。1.3 測定指標對術后蘇醒至取材時死亡和存活大鼠進行計數(shù)，計算各組(包括2、3、7、14

18、d 4個時間點)死亡大鼠只數(shù)與總體(造模后死亡與存活大鼠總只數(shù))的比率。大鼠死亡率=(死亡只數(shù)/死亡與存活只數(shù)總和)100%。分別于術后2 d至取材時間在相應時間點大鼠稱重，采集數(shù)據(jù)的時間點數(shù)分別為2 d組(1個)、3 d(2個)、7 d(3個)、14 d(4個)，計算公式為：體重下降率=(術前體重-術后體重)/術前體重100%，體重增長率=(術后體重-術前體重)/術前體重100%。抗凝血液20 l用WBC稀釋液稀釋20倍，取20 l入血細胞計數(shù)盤的計數(shù)室，靜置3 min，待WBC下沉，在低倍鏡下計四角四個大方格的有核細胞，4格總和乘以50則為每立方毫米的有核細胞計數(shù)。抽EDTAK3抗凝腹主動脈血1 ml輕搖混勻，然后按試管編號，取樣本全血50 l，加CD34熒光素5 l，輕混，搖勻后避光置室溫20 min，加溶血素250 l，混勻，避光置室溫10 min，加PBS液500 l，混勻，避光置室溫10 min，離心1 500 r/min 5 min，棄上清，每管加鹽水1 ml混勻，應用流式細胞儀進行檢測，計數(shù)CD34+細胞平均值(個/l)。神經(jīng)功能評測方法按文獻7從自發(fā)運動、輕癱實驗、前肢運動功能檢測、加強運動功能檢測、痛覺、位置覺6個方面進行，總分為18分，癥狀越重，得