目的基因(COR)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的方法及檢測(cè)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上目的基因（COR）轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的方法及檢測(cè)學(xué)生：魏烈斌 指導(dǎo)老師：高海寧(河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 甘肅 張掖 ）摘要： 利用PGEMT -easy質(zhì)粒為載體，用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞，把人工合成的抗氨芐青霉素的基因?qū)OR基因?qū)氪竽c桿菌，通過(guò)含有氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基篩選出含有抗氨芐青霉素基因的大腸桿菌，對(duì)篩選出的大腸桿菌用堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取,并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增和酶切凝膠電泳圖的分析。用EcoRI酶進(jìn)行酶切研究。結(jié)果表明：人工合成的抗氨芐青霉素的基因在大腸桿菌中跟隨質(zhì)粒的復(fù)制進(jìn)行同步復(fù)制并通過(guò)大腸桿菌自身的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出了抗氨芐青霉素的產(chǎn)物，使大

2、腸桿菌能在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。關(guān)鍵字： PGEM-Teasy質(zhì)粒 抗氨芐青霉素 氯化鈣法 大腸桿菌 引言：在DNA體外重組技術(shù)的研究和應(yīng)用中，轉(zhuǎn)化是個(gè)很重要的步驟。自Cohen等人在1972年首次用CaCl2：處理的方法成功地進(jìn)行了R因子對(duì)E. colt C600的轉(zhuǎn)化之后，這個(gè)方法一直廣泛地應(yīng)用于大腸桿菌各受體菌系的轉(zhuǎn)化。鼠傷寒沙門氏桿菌S. typhimurium和金黃色葡萄球菌S. aureus，的轉(zhuǎn)化也都沿用此法。直至1978年，Michael等在用pBR 322質(zhì)粒DNA對(duì)E. colt X1776的轉(zhuǎn)化中卻采用了與此不同的方法。1 材料和方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.

3、1 供試材料：大腸桿菌（實(shí)驗(yàn)室提供） PGEM-Teasy質(zhì)粒 Taq酶1.1.2 儀器：基因擴(kuò)增儀 移液器 電泳儀 紫外檢測(cè)儀 恒溫?fù)u床 恒溫水浴器 恒溫培養(yǎng)箱 低溫離心機(jī) 超凈工作臺(tái) 冰箱 離心管 小指管 1.1.3 試劑： PCR緩沖液(含Mg+) 4種dNTP Taq酶 DNA模板兩種引物（正向引物和反向引物） EB溶液 氯化鈉(Nacl) 氨芐青霉素 氯化鈣(CaCl2) 酒精燈 牙簽 LB液體培養(yǎng)基 ddH2O 溶液（50 mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl pH8.0,10 mmol/L EDTA） 溶液 0.4mol/L NaOH，2%SDS用前等體積混合

4、 溶液 5 mol/L KAc 溶液60ml， 11.5 ml冰醋酸，28.5 ml 去離子水。 Tris.HCl RNase 溶液 1.2 方法1.2.1 PCR基因擴(kuò)增1.2.1.1 按順序向微量離心管中依次加入：模板DNA 1l 10×PCR 緩沖液 2.5ldNTP 2.0l 引物I 0.5l 引物 0.5l Taq酶 1l加ddH2O 至25l混勻。 1.2.1.2 PCR反應(yīng)參數(shù) (1) 94預(yù)變性 2min (2) 94變性 1min (3) 55退火 1min (4) 72 延伸 2min。 (5) 重復(fù)(2)-(4) 35次（6）72 延伸 10min。（7）4保存

5、1.2.1.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR的結(jié)果：取10l PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。保持電流40mA。電泳結(jié)束后，用EB染色15min，紫外燈下觀察結(jié)果。1.2.2 DNA重組重組體系：T4DNA ligase 10lPGEM-T-easy 0.5lBuffer 1.0lDNA 7.5l在此重組體系中進(jìn)行重組，1416條件下恒溫培養(yǎng)8 h 12 h。即得到重組質(zhì)粒。1.2.3大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化1.2.3.1從新滅活的E.coli DH5菌株平板上挑取一個(gè)單菌落接于3mlLB液體培養(yǎng)基試管中， 37振蕩過(guò)夜。1.2.3.2取0.5ml 過(guò)夜培養(yǎng)液，接種于50ml LB液體培

6、養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)2-3h，至OD600<=0.4-0.5時(shí)，放置于4冰箱冷卻1-2h。（注：以下操作均應(yīng)在冰浴中進(jìn)行。）1.2.3.3取1ml培養(yǎng)液裝入1.5ml離心管中，在冰上冷卻10-30min于4離心，4000r/min離心10min。（從這一步開始，所有操作均在冰上進(jìn)行，速度盡量快而穩(wěn)）1.2.3.4 倒盡上清液，用冰浴的0.1mol/LCaCl2 200µl懸浮，立即置于冰上冰浴30min。0-4離心，4000r/min×10min。1.2.3.5棄去上清，加入冰浴的0.1mol/LCaCl2 200l懸浮于冰上20-30min。4離心，4000r/mi

7、n×10min。1.2.3.6棄去上清。加入冰浴的0.1mol/LCaCl2 20µl，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻后即成轉(zhuǎn)化態(tài)細(xì)胞。1.2.3.7給上述感受態(tài)細(xì)胞中加入連結(jié)體系（共100ml）1.2.3.8將以上樣品輕輕混勻，冰上放置20-30min。1.2.3.9于42熱休克90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，繼續(xù)冰浴1-2min1.2.3.10向上述管中加入800 -900m l LB培養(yǎng)液，使總體積到達(dá)1ml，搖勻后于37震蕩培養(yǎng)45-60min,使受體菌株恢復(fù)到正常狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體表達(dá)抗生素基因產(chǎn)物。1.2.3.11取上步轉(zhuǎn)化細(xì)胞200l涂布于LB固體培養(yǎng)基（含Amp 5mg

8、/ml）,37恒溫培養(yǎng)8-12h。1.2.4質(zhì)粒DNA的提取及酶切1.2.4.1 提取質(zhì)粒1.2.4.1.1 先在3ml液體培養(yǎng)基上加入3mlAmp然后接入一個(gè)含有PETBlue-2質(zhì)粒的大腸桿菌但菌落，37震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 1.2.4.1.2 取過(guò)夜的培養(yǎng)物1.5ml倒入小離心管中8000r/min離心2min。吸去培養(yǎng)液。1.2.4.1.3加100l（5 mg/ml 溶菌酶）溶液，顛倒混勻使菌體懸浮。1.2.4.1.4 加200l的溶液（新鮮配置），輕輕混勻，冰浴2-3 min。 1.2.4.1.5 加150l的溶液，點(diǎn)到混勻，冰浴3-5 min讓質(zhì)粒DNA復(fù)性。1.2.4.1.6 1200

9、0r/min，離心10min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。1.2.4.1.7 向上清液中150µl 酚：氯仿：異戊醇（24：1：1）（去蛋白和脂質(zhì)），反復(fù)混勻，12000r/min，離心10min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。1.2.4.1.8吸取上清，加2倍體積的無(wú)水乙醇，充分混勻，室溫放置2-510min。 12000 r/min離心15 min。倒去上清液。1.2.4.1.9 用400l70乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，8000r/min離心20 min吸去上清液，空氣中干燥。1.2.4.1.10加20lTE（RNAsea），使質(zhì)粒DNA完全溶解，-20保存。1.2.4.2 質(zhì)粒P

10、CR把提取出來(lái)的質(zhì)粒DNA在60下煮10min或加RNA酶除去樣品中的RNA，然后取1 ul質(zhì)粒DNA樣品再加24ul的PCR體系放入PCR儀內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。1.2.4.2 酶切取5.5l質(zhì)粒DNA樣品加4.5l酶切體系后用37下恒溫水浴過(guò)夜即得到酶切質(zhì)粒DNA。然后再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。2 結(jié)果與分析2.1 PCR目的基因的擴(kuò)增電泳圖的分析20001000750500250100 Marker 5 圖1 目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖由上圖可以看出，目的基因的含有1000bp個(gè)堿基對(duì)，擴(kuò)增后的DNA分子濃度大大提高，擴(kuò)增效果良好，達(dá)到了擴(kuò)增的目的。2

11、.2 重組后的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的分析 圖2含有氨芐青霉素抗性基因的大腸桿菌平板受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)氯化鈣法處理后，使大腸桿菌細(xì)胞膜通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，能容忍DNA重組后的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞。導(dǎo)入受體細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制表達(dá)實(shí)現(xiàn)信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞在含AmpLB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可篩選出含有質(zhì)粒DNA的大腸桿菌。由圖2看出利用Cacl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞在導(dǎo)入重組DNA質(zhì)粒后，在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明導(dǎo)入的目的基因跟隨質(zhì)粒的復(fù)制發(fā)生了大量的復(fù)制，并通過(guò)大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)氨芐青霉素抗性基因進(jìn)行了表達(dá)。2.3重組質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳圖的分析25

12、05007501000 Marker 3 圖3質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳圖 由上圖可看出在Marker20003000處有一條較亮的帶就是質(zhì)粒，說(shuō)明質(zhì)粒提取成功，且是插入目的基因的重組質(zhì)粒。但由電泳圖中雜帶太多可看出提取的質(zhì)粒樣品中雜質(zhì)太多，上面有較長(zhǎng)拖拉的那條帶應(yīng)該是大腸桿菌自身的RNA，最下面分子量較大的雜帶可能是大腸桿菌自身的雙螺旋DNA分子。可以考慮進(jìn)一步對(duì)所采用的質(zhì)粒提取的方法進(jìn)行改進(jìn)以達(dá)到更好的效果。2.4質(zhì)粒PCR的電泳圖的分析10025050075010002000 Marker 3 圖4質(zhì)粒PCR瓊脂糖凝膠電泳圖 提取出來(lái)的質(zhì)粒樣品經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后與圖3中的質(zhì)粒相比DNA量和純度大大

13、增加，效果很好，說(shuō)明PCR擴(kuò)增是低濃度DNA樣品由高濃度DNA樣品的必經(jīng)過(guò)程。進(jìn)一步說(shuō)明目的基因成功被導(dǎo)入了大腸桿菌細(xì)胞中，并在體內(nèi)進(jìn)行了大量的復(fù)制。產(chǎn)生了大量的重組質(zhì)粒的復(fù)制子。2.5質(zhì)粒酶切的電泳圖的分析25050075010002000 Marker 3 圖5質(zhì)粒酶切瓊脂糖凝膠電泳圖 由上圖可看出共有三條帶，從上往下分別代：表質(zhì)粒被完全酶切得到的目的基因片段、沒(méi)被酶切的完整質(zhì)粒和質(zhì)粒被部分酶切得到的開環(huán)質(zhì)粒。大部分質(zhì)粒都被部分酶切變成了開環(huán)質(zhì)粒。說(shuō)明重組質(zhì)粒量很多且樣品的純度較高，提取效果較好。3討論 該文中采用常規(guī)的感受態(tài)細(xì)胞制備的方法為氯化鈣法，此法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞成本低，方法

14、簡(jiǎn)便，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的要求也比較低且效果也很好。質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞是分子生物學(xué)中非常重要的常規(guī)操作之一，其轉(zhuǎn)化效率的高低與感受態(tài)細(xì)胞有關(guān)。 對(duì)質(zhì)粒DNA提取采用常規(guī)方法提取，對(duì)蛋白質(zhì)抽提并未省去，這種方法所提取的質(zhì)粒DNA均能夠被酶切開，此方法可以用在后續(xù)的酶切、連接和轉(zhuǎn)化等分子生物操作。 以目的基因?yàn)槟０?，在PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)在1000bp處的條帶比較清晰，說(shuō)明目的基因的分子量在一千左右。對(duì)提取出來(lái)的重組質(zhì)粒酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒在Marker 3000-4000處，由于Marker是線性分子，所以進(jìn)一步判斷重組質(zhì)粒大概含有4000bp的堿基。從而說(shuō)明空質(zhì)粒載體含有的堿基大概是3000bp，這與圖3中對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行凝膠電泳后的結(jié)果一致。參考文獻(xiàn)1金東雁等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南M.北京：科學(xué)出版社，2003:362-3922楊坤，鞏振輝，李大偉. 大腸桿菌高效感受態(tài)細(xì)胞的制備及快捷轉(zhuǎn)化體系的建立.北方園藝 ，2010（14）3陳紹興, 李沁