酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實(shí)驗(yàn) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)蔗糖酶米氏常數(shù)的測(cè)【目的要求】1了解酶促動(dòng)力學(xué)研究的范圍。2以蔗糖酶為例，掌握測(cè)定米氏常數(shù)(Km)【實(shí)驗(yàn)原理】 在酶促反應(yīng)中，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度、pH和酶濃度恒定時(shí)，反應(yīng)初速度(v)則隨底物濃度S的增加而加速，最后達(dá)到極限，稱為最大反應(yīng)速度(v)。Michaelis和Menten根據(jù)反應(yīng)速度與底物濃度的這種關(guān)系，推導(dǎo)出如下方程： 此式稱為米氏方程，式中Km稱為米氏常數(shù)，按此方程，可用作圖法求出Km。方法有：1以vS作圖 由米氏方程可知，v=V2時(shí)，KmS即米氏常數(shù)值等于反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)所需底物濃度。因此，可測(cè)定一系列不同底物濃度的反應(yīng)速

2、度v,以v對(duì)S作圖。當(dāng)vV2時(shí)，其相應(yīng)底物濃度即為Km。2以1v對(duì)1S作圖 取米氏方程的倒數(shù)式： 以1v對(duì)1S作圖可得一直線，其斜率為KmV，截距為1/V。若將直線延長(zhǎng)與橫軸相交，則該交點(diǎn)在數(shù)值上等于lKm。本實(shí)驗(yàn)以蔗糖為底物利用一定量蔗糖酶水解不同濃度蔗糖所形成的產(chǎn)物(葡萄糖和果糖)的量來計(jì)算蔗糖酶的Km值。葡萄糖和果糖能與3，5二硝基水楊酸試劑反應(yīng)，生成桔紅色化合物，可于520nm處比色測(cè)定之。【試驗(yàn)材料】1試劑(1)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：準(zhǔn)確稱取100mg葡萄糖溶于少量飽和的苯甲酸溶液(0.3%)，再轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，用飽和苯甲酸溶液稀釋到刻度，混勻，即得濃度為1mgm1的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶

3、液。冰箱貯藏可長(zhǎng)期保存；(2)pH4.5的0.1mol/L醋酸緩沖液：取lmol/L醋酸鈉溶液43m1及l(fā)molL醋酸溶液57m1，稀釋至1000m1即得；(3)pH4.5的10蔗糖溶液：準(zhǔn)確取l0g蔗糖溶于少量pH4.5的0.1molL醋酸緩沖液，轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，用同樣緩沖液稀釋到刻度備用；(4)3，5二硝基水楊酸試劑：溶液I：4.5NaOH溶液300m1，13，5一二硝基水楊酸溶液880m1及酒石酸鉀鈉(KNaC4O64H20)255g三者一起混合均勻。溶液：取結(jié)晶酚10g及l(fā)oNaOH溶液22m1，加蒸餾水稀釋成100ml，混勻。溶液：取6.9gNaHSO3溶于64ml溶液n中

4、。將溶液皿和溶液I混合，激烈振搖混勻，即得3，5二硝基水楊酸溶液，放置一周后備用。(5)酵母蔗糖酶溶液：稱取鮮酵母l0g于研缽中，加少量細(xì)砂及10一15ml蒸餾水研磨。磨細(xì)后置冰箱中，過濾，濾液加23倍體積冷丙酮，攪拌均勻后離心，沉淀用丙酮洗兩次，真空干燥得固體粉末狀酶，再溶于100ml蒸餾水，即得酶溶液。若有不溶物可用離心法除去。該酶液活力以612單位為佳。蔗糖酶活力單位的定義為：在一定條件下反應(yīng)5min，每產(chǎn)生lmg葡萄糖所需要的酶量。備用。2器材(1)100m1三角燒瓶2只；(2)研缽1只；(3)50m1及100m1容量瓶各1只；(4)離心機(jī)1臺(tái)(4000rpm)；(5)糖管8支；(6)

5、恒溫水浴1臺(tái)；(7)吸量管：1.0ml2支；(8)秒表1只；(9)72l型分光光度計(jì)1臺(tái)。【實(shí)驗(yàn)方法】1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取干凈糖管6支，如下表所示添加試劑。 管號(hào)試劑 0 1 2 3 4 5標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液, ml蒸餾水 ， ml3，5二硝基水楊酸液， ml 02.0 3.0 0.21.83.0 0.4 1.6 3.0 0.6 1.4 3.0 0.8 1.2 3.0 1.0 1.0 3.0加畢混勻于沸水中準(zhǔn)確煮5min，取出用自來水冷卻3min，稀釋至25ml，混勻后以零號(hào)管調(diào)零點(diǎn)，于520nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖。2根據(jù)活力選擇酶濃度 將10蔗糖溶液稀釋成pH

6、4.5的6.5的溶液，取此溶液5m1于試管中，共加兩管。將兩管同時(shí)置于25水浴中保溫5min，然后向管中加入蔗糖酶溶液1.0ml，立即混勻，同時(shí)用秒表計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)5min后，立即加入5ml0.1mol/LNaOH溶液終止酶反應(yīng)。另一管先加入5.0ml0.11mol/LNaOH溶液，再加入蔗糖酶溶液1.0ml(此為對(duì)照管)。取干凈糖管3支，第l、2管分別加入上述反應(yīng)液各1.0ml及水各1.0m1，第3管加蒸餾水2.0ml，然后各管均加3.0ml二硝基水楊酸溶液。置沸水浴中煮5min，取出后經(jīng)自來水冷卻3min，加水至25m1，混勻，以第3管調(diào)零點(diǎn)，于520nm處測(cè)吸光度值。以測(cè)定管的吸光度值減

7、去對(duì)照管吸光度值，求得的差值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的葡萄糖含量，并乘以ll，即為每1ml酶溶液的活力。測(cè)定管中因酶催化水解而產(chǎn)生的葡萄糖含量以在0.41.6mg之間為佳，過高或過低均應(yīng)適當(dāng)改變蔗糖酶溶液的濃度或反應(yīng)液用量后再測(cè)。3底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響米氏常數(shù)購(gòu)測(cè)定 取試管7支，按下表所示加入試劑。當(dāng)加完蔗糖溶液及pH4.5醋酸緩沖液后，均放置室溫或恒溫水浴(20或25)保溫5min，再分別依次向各管加入蔗糖酶溶液1.0ml，立即搖勻記錄時(shí)間。準(zhǔn)確反應(yīng)5min，再準(zhǔn)時(shí)加入0.1mol/L的NaOH溶液，立即搖勻，以終止反應(yīng)。 測(cè)定管反應(yīng)完成后，取8支潔凈糖管，前7支分別加入相應(yīng)的上述反應(yīng)液

8、各1.0ml及蒸餾水各1.0ml，第8支糖管加入2.0ml蒸餾水作空白，然后各管均加入3.0ml二硝基水楊酸溶液，沸水浴5min。取出用自來水冷卻3min，稀釋到25m1，混勻，于520nm處比色測(cè)定并記錄吸光度值。對(duì)照管的測(cè)定與測(cè)定管的操作相同?！窘Y(jié)果處理】根據(jù)各測(cè)定管的吸光度值(需減去相應(yīng)對(duì)照管的吸光度值)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)(以在04一16mg范圍內(nèi)為佳，否則應(yīng)調(diào)整反應(yīng)液用量后重新測(cè)定)，再乘以11，即得各管的產(chǎn)物量，然后分別計(jì)算各反應(yīng)管相應(yīng)的S、lS、v及1/v，并作出vS及1/v1S曲線。再根據(jù)所作的兩種動(dòng)力學(xué)曲線，分別求出酵母蔗糖酶的Km值，并加以比較。上述數(shù)據(jù)可記

9、錄在下表中。 酵母蔗糖酶的提取實(shí)驗(yàn)原理：蔗糖酶主要存在于酵母中，但工業(yè)上通常從酵母中制取。酵母蔗糖酶系胞內(nèi)酶，提取時(shí)細(xì)胞破碎或菌體自溶。常用的提純方法有鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、離子交換和凝膠柱層析。以此可得到較高純度的酶。細(xì)胞破壁的幾種方法1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動(dòng)開關(guān)后，逐步加速至所需速度。2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動(dòng)，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。3、反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩

10、余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。4、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料。5、化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。有機(jī)溶劑沉淀法即向水溶液中加入一定量的親水性的有機(jī)溶劑可降低溶質(zhì)的溶解度使其沉淀被析出。三、試劑： 啤酒酵母 、 二氧化硅 、甲苯（使用前預(yù)冷到0以下）、去離子水（使用前冷至4左右）、1mol / L 醋酸 、95%乙醇四、儀器：研缽1個(gè)、離心管3個(gè) 、 3. 滴管3個(gè)、量筒50ml 1個(gè)、水浴鍋1個(gè)、恒溫水浴、燒杯100ml 2個(gè)、廣泛pH試紙、高速冷凍離心機(jī)四、操作步驟：1. 提取 （1）準(zhǔn)備一個(gè)冰浴，將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中。預(yù)先在冰箱中冷卻20g干酵母和10g二氧化硅。（2）將20g干酵母粉和10g二氧化硅，放入研缽中。量取預(yù)冷的甲苯30ml緩慢加入酵母中，邊加邊研磨成糊狀，約需60分鐘。研磨時(shí)用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細(xì)胞大部分研碎。（3）緩慢加入預(yù)冷的40ml去離子水，每次加2ml左右，邊加邊研磨，至少用30分鐘。以便將蔗糖酶充分轉(zhuǎn)入水相。（4）將混合物轉(zhuǎn)入兩個(gè)離心管中，平衡后，用高速冷離心機(jī)離心，4，10000rpm，10min。如果中間白色的脂肪層厚，說明研