如何做原核表達(dá)——面面俱到Novagen產(chǎn)品

1、之所以首先介紹 Novagen公司的產(chǎn)品是因?yàn)橛眠^它的 pET系列載體，感覺很好用。 Novagen的母公司是德國默克（ Merck ）公司，它是國際著名的化學(xué)及制藥公司總部 位于德國的 Darmstadt,已有300多年的歷史。已在全世界 55個(gè)主要國家設(shè)立了分 公司，其中在28個(gè)國家建有62個(gè)生產(chǎn)基地。 Novagen公司出品的pET系列載體是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)， 已經(jīng)成 功地在大腸桿菌中表達(dá)了各種各樣的異源蛋白。 pET系列載體是利用大腸桿菌 T7 噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的載體，其表達(dá)原理見下圖。 for Expression T7噬菌體具有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系， 利用

2、這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建 的表達(dá)系統(tǒng)稱為 T7表達(dá)系統(tǒng)。T7噬菌體基因編碼的 T7 RNA聚合酶選擇性的激活 T7噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。它是一種高活性的 RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比 大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌 RNA聚合酶有 效轉(zhuǎn)錄的序列。在細(xì)胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌體啟動(dòng)子的情形下， 大腸桿 菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過 T7噬菌體轉(zhuǎn)錄體系， 最終受T7噬菌體啟動(dòng)子控制 的基因的轉(zhuǎn)錄能達(dá)到很高的水平。 T7噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于 T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄 調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式。 噬菌體DE3是

3、入噬菌體的衍生株，一段含 有l(wèi)ac I, lacUV5啟動(dòng)子和T7 RNA聚合酶基因的 DNA片段倍插入其int基因中, 用噬菌體 DE3的溶源菌，如 BL21(DE3)、HMS174(DE3)等作為表達(dá)載體的宿主菌， 調(diào)控方式為化學(xué)信號(hào)誘導(dǎo)型，類似于 Lac表達(dá)系統(tǒng)。 從開始涉及表達(dá)的時(shí)候可以根據(jù)是否要用基因本身的起始密碼子進(jìn)行選擇， Novagen公司僅提供三個(gè)載體： pET-21(+) , pET-24(+)和pET-23(+)。如果你打算利 用載體的起始密碼子，那么就有許多選擇。 根據(jù)是否要可溶性表達(dá)，選擇加有不同標(biāo)記的載體。一般說來在大腸桿菌中不加 標(biāo)記外源蛋白都會(huì)以不溶的包涵體形式

4、表達(dá)。為了讓外源蛋白融合表達(dá)一般說來有 三個(gè)策略： 1. 與一個(gè)高度可溶的多肽聯(lián)合一起表達(dá)， 比如：谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S transferase, GST)、硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx )和 N 利用質(zhì) A( N utilization substance A, NusA )。 2. 轉(zhuǎn)入一個(gè)酶催化二硫鍵的形成，如：硫氧還蛋白， DsbA , DsbC。 3. 插入一個(gè)定位到周質(zhì)空間的信號(hào)序列。 不同載體提供不同的標(biāo)記，有的可以同時(shí)帶有多個(gè)標(biāo)記。如果你不希望在蛋白的 N末端加入任何的多肽， 你也可以選擇用 Nde I直接從起始密碼子后插入外源片斷， 或

5、者在得到表達(dá)產(chǎn)物后利用蛋白氨基酸的酶切位點(diǎn)把多余的多肽切除。 以下是Novagen載體帶有標(biāo)記及抗性的列表： T7& S*Tg! CJDH婀 思忡N皿T 用麗職 HHI1 T? 冊(cè)虹/. T7*T | m T廣 MS PH* 6ST*T| 項(xiàng)曜幡I 聚 11 . . IK |ET 1心 . H , , . . TT THsT- 年 161 ii t IE1 lTb TF VTn , . TT in Kb n rr |ET-20l . 4 IT 1 N TT * iET37hti . . c M I 1 T . iH Sbti . . HE T . lEYMbritl pIT T . i

6、fHOhti . ,1： 1 TT . it TT iFTHHiir I T* TF rTT 簡42頃 fix nr rrr 粉M J * . . pT7 c N rrn | |J|3 ItkLK - IT 1 T T TT N LC iT TF Yecloi kiF TWc TE 5*T| CgTam HSV*TJHI D&m叩 Nm*Tayi lifMl mp* T7 Hit*T 神 T7 T 岬 m T 鯽 KSI PO pmieue 生物通注：帶（+）指此載體利用 fl作為復(fù)制起點(diǎn) T7 Tag11 = 11 aa fusion tag T7 Tag260 = 260 aa f

7、usion tag signal seq. = signal sequence for potential periplasmic localization I = internal tag N = N-terminal tag C = optional C-terminal tag protease cleavage sites: T = thrombin E = enterokinase X = Factor Xa LIC = ligation-independent cloning 以上載體都是采用抗生素抗性篩選，如果你希望用藍(lán)白斑篩選可以使用 pETBlue 系列載體。在重組技術(shù)上，

8、Novagen除了傳統(tǒng)的酶切、連接方式外，還有不需要連 接的克隆方式： Ligation-Independent cloning ，簡稱 LIC。采用LIC方法的pET載體 是線性化的，在末端有12-15個(gè)突出的堿基以在退火時(shí)和目的片斷互補(bǔ)。 在設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物時(shí)加入與 LIC載體互補(bǔ)的序列， PCR產(chǎn)物用3 t5的內(nèi)切酶消化出單鏈與 載體互補(bǔ)的序列。通過這種方式就可以把目的片斷定向、高效地插入 LIC載體上。 一般的pET載體是先在不含 DE3片段的菌株中進(jìn)行克隆篩選，之后再把陽性克 隆轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)菌株，如 BL21 (DE3)中，通過IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)。而 pETcoco 載體它引入

9、了低拷貝控制元件， F附加體上的oriS和repE元件與parABC共同作用 下使質(zhì)粒在細(xì)菌中保持單拷貝，這樣即可以使質(zhì)粒在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在又可以減少外 源蛋白對(duì)細(xì)胞的毒害作用。當(dāng)我們需要大量表達(dá)時(shí)加入樹膠醛醺誘導(dǎo) trfA基因表達(dá)， 質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)就可以增加到 25-50。 pETcoco載體同時(shí)兼容了 DE3調(diào)控模 型，在加入IPTG后誘導(dǎo)表達(dá)量達(dá)升高 2500倍。 在保證質(zhì)粒穩(wěn)定性這一點(diǎn)上除了 pETcoco的方法還有另一種方法就是將重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化進(jìn)入含有T7 RNA聚合酶抑制劑的 T7溶菌酶表達(dá)基因的菌株中，在含有pLysS 的pLysE宿主菌內(nèi)重組質(zhì)粒的本底表達(dá)被進(jìn)一步抑制，質(zhì)粒

10、可以更穩(wěn)定地存在。 Novagen提供多種表達(dá)使用的菌株，為了提高表達(dá)量做出了各種改造，它們大致 分為以下幾個(gè)種類： 1. 蛋白酶缺陷型 所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，這包括有B834, BL21, BLR, Origami? B, Rosetta? 和Tuner?。因此在純化時(shí)可以保持蛋白 的穩(wěn)定不被降解。BL21(DE3)是應(yīng)用最多的表達(dá)的表達(dá)菌株。另外它的衍生 株BLR(DE3)是recA , RecA是大腸桿菌中介導(dǎo)同源重組的重要蛋白之一。 它的缺失，可以保證質(zhì)粒的穩(wěn)定。 2. 保證所有細(xì)胞以同樣量進(jìn)行表達(dá) Tuner?株及它的衍生株( Origami?

11、B 和Rosetta?)是BL21菌株的lacY1 缺失突變型，在這些菌株中可以使蛋白以同樣水平在所有細(xì)胞中表達(dá) 滲透酶的突變使進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞的 IPTG量都是一致的，這樣使蛋白表達(dá)濃度 可以隨著IPTG濃度而改變。通過對(duì)IPTG濃度的控制可以使細(xì)胞微量表達(dá)或 者大量表達(dá)。一般說來，低濃度表達(dá)有利于蛋白的可溶性和活性。 3. 二硫鍵形成與溶解性增強(qiáng) 二硫鍵的形成對(duì)某些蛋白的可溶性起到重要的作用， 而Novagen也專門設(shè)計(jì) 了一些菌株是谷胱甘肽還原酶（ gor）和/或硫氧還蛋白還原酶（trxB ）缺陷型 的，包括 AD494 , BL21trxB , Origami , Origami B 和

12、Rosetta-gami?。在這 些菌株中表達(dá)蛋白，可以更大程度促進(jìn)二硫鍵的形成，并使蛋白以可溶形式 和有活性形式出現(xiàn)的可能增加。 4. 稀有密碼子的補(bǔ)給 不同物種有不同的密碼子偏愛性，如果外源蛋白中含大量大腸桿菌的稀有密 碼子，特別當(dāng)這些稀有密碼子呈連續(xù)分布的時(shí)候， 就會(huì)造成蛋白表達(dá)量極低， 或者翻譯提前終止。 Rosetta?是為了表達(dá)真核蛋白而特別設(shè)計(jì)的，它含有大 腸桿菌稀有的密碼子 tRNA ,包括AUA , AGG , AGA , CUA , CCC和GGA。 它們以氯霉素抗性的質(zhì)粒形式存在。 Rosetta系列是來自BL21lacY1，所以它 具有BL21lacY1的所有特性。 5

13、. 硒蛋氨酸標(biāo)記 B834是來源于BL21的蛋氨酸（met）營養(yǎng)缺陷型菌株。它在高度特異活性 35S-met標(biāo)記和晶體成像蛋氨酸標(biāo)記中非常有用。 我們常用的培養(yǎng)基有 LB、TB、M9、M9ZB , LB因?yàn)槠涑杀镜土詰?yīng)用最為 廣泛，而 Novagen 有提供特殊的培養(yǎng)基 Overnight Express? Autoinduction System 。 使用這種培養(yǎng)基不需要按照傳統(tǒng)方法先培養(yǎng)一段時(shí)間再加 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，它可以 直接進(jìn)行過夜培養(yǎng)。在這種培養(yǎng)基中含有痕量金屬，可以滿足合成蛋白時(shí)對(duì)金屬的 需求。同時(shí)提供除了各種氨基酸，這其中蛋氨酸是另外加入的。這樣培養(yǎng)基可以滿 足細(xì)菌生長的各

14、種需求， 使細(xì)菌密度更高； 可以自動(dòng)誘導(dǎo)無需自己加 IPTG ;使蛋白 Lac 更加容易溶于培養(yǎng)基中；并且如果需要的話，可以對(duì)蛋氨酸進(jìn)行硒標(biāo)記。 同時(shí)Novagen還有表達(dá)雙外源蛋白的載體 pCDFDuet-1 DNA 、pETDuet? -1 DNA、pRSFDuet-1 DNA。這些載體含有兩個(gè)不同多克隆位點(diǎn)，可以插入兩個(gè)外源 蛋白基因，利用單獨(dú)的T7啟動(dòng)子，乳糖操縱子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行表達(dá)。 載體轉(zhuǎn) 化進(jìn)入合適的菌株中最多可以同時(shí)表達(dá) 8個(gè)外源蛋白。 Novagen的原核表達(dá)載體可以說是一面金字招牌，有許多不同系列的載體、菌 株供選擇；與原核表達(dá)的各種相關(guān)產(chǎn)品都一應(yīng)俱全，比如：載體、菌株、培養(yǎng)基、 檢測表達(dá)的抗體、純化產(chǎn)品等等。原核表達(dá)的東西要說真是一天一夜都說不完，今 天就先說到這里吧。之后還將介紹Invitrogen、Qiagen等公司的各種載體及相關(guān)產(chǎn)品， 請(qǐng)繼續(xù)留