藥物分析第十六章抗生素類藥物分析

1、藥物分析第十六章抗生素類藥物分析概 述1-內(nèi)酰胺類2氨基糖苷類3四環(huán)素類4高分子雜質(zhì)檢查5在低微濃度下即可對某些生物在低微濃度下即可對某些生物（病原微生物）的生命活動有特異抑（病原微生物）的生命活動有特異抑制作用的化學(xué)物質(zhì)的總稱制作用的化學(xué)物質(zhì)的總稱喹諾酮類喹諾酮類林可霉素類林可霉素類氨基糖苷類氨基糖苷類酮康唑酮康唑環(huán)絲氨酸環(huán)絲氨酸利福平利福平紅霉素紅霉素制霉菌素制霉菌素桿菌肽桿菌肽甲氧芐胺嘧啶甲氧芐胺嘧啶四環(huán)素類四環(huán)素類兩性霉素兩性霉素B萬古霉素萬古霉素磺胺藥磺胺藥氯霉素氯霉素多粘菌素類多粘菌素類-內(nèi)酰胺類內(nèi)酰胺類核酸合成核酸合成細(xì)胞蛋白合成細(xì)胞蛋白合成細(xì)胞膜滲透性細(xì)胞膜滲透性細(xì)胞壁細(xì)胞壁產(chǎn)

2、品穩(wěn)定性差產(chǎn)品穩(wěn)定性差分子結(jié)構(gòu)大多不穩(wěn)定，降解分子結(jié)構(gòu)大多不穩(wěn)定，降解后療效下降、失效或增加毒后療效下降、失效或增加毒副作用副作用發(fā)酵過程不易控制易受污染發(fā)酵過程不易控制易受污染生產(chǎn)工藝復(fù)雜生產(chǎn)工藝復(fù)雜發(fā)酵液中雜質(zhì)發(fā)酵液中雜質(zhì) 無機(jī)鹽、脂肪、各種蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽、脂肪、各種蛋白質(zhì)、各種降解產(chǎn)物、色素、熱原、各種降解產(chǎn)物、色素、熱原、毒性物質(zhì)毒性物質(zhì) 鑒別：鑒別：理化方法理化方法( (主要方法主要方法) )、微生物法、微生物法官能團(tuán)的顯色反應(yīng)，如：官能團(tuán)的顯色反應(yīng)，如：-內(nèi)酰胺環(huán)的羥肟酸鐵反應(yīng)；內(nèi)酰胺環(huán)的羥肟酸鐵反應(yīng)；鏈霉素的麥芽酚反應(yīng)、坂口反應(yīng)；鏈霉素的麥芽酚反應(yīng)、坂口反應(yīng)；光譜法：紅外光譜及紫

3、外吸收光譜的鑒別。光譜法：紅外光譜及紫外吸收光譜的鑒別。色譜法：色譜法：HPLCHPLC和和TLCTLC法，采用標(biāo)準(zhǔn)品對照品對照法；法，采用標(biāo)準(zhǔn)品對照品對照法；生物學(xué)法：比較抑菌能力，現(xiàn)已少用。生物學(xué)法：比較抑菌能力，現(xiàn)已少用。 檢查：檢查：影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的檢查項(xiàng)目：結(jié)晶性、酸堿度、水分影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的檢查項(xiàng)目：結(jié)晶性、酸堿度、水分或者干燥失重等或者干燥失重等控制有機(jī)和無機(jī)雜質(zhì)的項(xiàng)目：溶液澄清度與顏色、有控制有機(jī)和無機(jī)雜質(zhì)的項(xiàng)目：溶液澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、熾灼殘渣、重金屬等；關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、熾灼殘渣、重金屬等；與臨床安全性有關(guān)的檢查項(xiàng)目：異常毒性、熱源或細(xì)與臨床安全性有關(guān)的檢查項(xiàng)

4、目：異常毒性、熱源或細(xì)菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)、無菌等菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)、無菌等含量/效價測定： 微生物法：與臨床療效吻合與臨床療效吻合, ,靈敏度高，結(jié)果直觀，靈敏度高，結(jié)果直觀，適用范圍廣；但操作復(fù)雜費(fèi)時，誤差大適用范圍廣；但操作復(fù)雜費(fèi)時，誤差大 理化方法：準(zhǔn)確度與專屬性較高準(zhǔn)確度與專屬性較高, , 且操作簡便；但且操作簡便；但與臨床療效有偏差與臨床療效有偏差NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）6-aminopenicillanic acid簡稱簡稱6-APA青霉素類7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基頭孢菌烷酸）RCO7-aminoce

5、phalosporanic acid,簡稱7-ACA頭孢菌素類氫化噻唑環(huán)氫化噻唑環(huán)氫化噻嗪環(huán)氫化噻嗪環(huán)CONSOHNCOOHCH3CH3CH2 青霉素青霉素(芐青霉素芐青霉素) (penicillins)CHCOHNNH2NSCH3CH3COOHO氨芐西林氨芐西林CHCOHNNH2HONSCH3CH3COOHO阿莫西林阿莫西林CHCOHNNH2CH3NOSCOOH頭孢氨芐頭孢氨芐CH3NOSCOOHCHCOHNNH2頭孢拉定頭孢拉定CH3NOSCOOHCHCOHNNH2HO頭孢羥氨芐頭孢羥氨芐SCH2CONONHSCH2OCOCH3COONa頭孢噻吩鈉頭孢噻吩鈉1.酸性（羧基）酸性（羧基） ，

6、酸性較強(qiáng)。堿金屬鹽水溶性好，有機(jī)堿鹽，酸性較強(qiáng)。堿金屬鹽水溶性好，有機(jī)堿鹽難溶于水。難溶于水。2.手性手性C （旋光性）（旋光性）NSO1234567NOS12345678青霉素類：苯環(huán)取代基頭孢菌素類：母核有共軛結(jié)構(gòu)260nm4. 內(nèi)酰胺環(huán)內(nèi)酰胺環(huán)(四元環(huán)張力+酰胺鍵 ) 干燥條件較穩(wěn)定，溶液不穩(wěn)定干燥條件較穩(wěn)定，溶液不穩(wěn)定失失效效降降解解青青霉霉素素類類酸酸、堿堿、青青霉霉素素酶酶某些氧化劑、金屬離子、溫度某些氧化劑、金屬離子、溫度失失效效降降解解頭頭孢孢菌菌素素類類酸酸、堿堿、胺胺類類內(nèi)內(nèi)酰酰胺胺酶酶 ( (一一) )色譜法色譜法HPLC (tR)TLC (Rf)(二)光譜法IR UVN

7、MRNH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2(三)呈色反應(yīng)1 1）羥肟酸鐵反應(yīng)）羥肟酸鐵反應(yīng)內(nèi)酰胺環(huán)內(nèi)酰胺環(huán)內(nèi)酰胺類NH2OHHClNaOH羥肟酸 Fe3+ H+顯色（紅、棕、褐）2 2）類似肽鍵（）類似肽鍵（-CONH-CONH-）a.a.茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng)-氨基氨基 CNH2H+OOHOHOCOHONCOO+CO2+3H2Ob.b.雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)內(nèi)酰胺類內(nèi)酰胺類 堿性酒石酸銅紫色2OHCONH2CuCOHNCCH3COONaCH3SNHNCH3CH3COONaCSNOHOHOOCH2NH2CH2HH3 3）其他呈色反應(yīng)）其他呈色反應(yīng)橙黃色橙黃色重氮苯磺酸重氮苯磺酸 OHH

8、C56（偶合）呈暗黃色氨芐西林水浴加熱甲醛硫酸水濕潤-青霉素鉀和青霉素鈉呈紅棕色(四)各種鹽的反應(yīng)焰色反應(yīng)K+、Na+(聚合物、有關(guān)物質(zhì)、異構(gòu)體等)1.聚合物頭孢他啶中聚合物測定頭孢他啶中聚合物測定分子排阻色譜分子排阻色譜凝膠色譜分子篩機(jī)制凝膠色譜分子篩機(jī)制 主成分自身對照法主成分自身對照法 面積歸一化法面積歸一化法 限量法限量法 自身對照外標(biāo)法自身對照外標(biāo)法OOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOHOOHCH2OOCH3OHOHOOOCH2OHHOOOOHOHOOH2COOOOOHHOH2COOH2COHHOOCH2OOOH2COOHHOOOOOH

9、OOHCH2OOCH2OHHOOOOOCH2OHHOOOOCH2OHHOOOOH2COHHOOOOCH2OHHOOOOOOHOHOH2COOH2COHOCH2OHHOOOH2COCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHHCOHCH2CH2CH2HCOH 萄聚糖凝膠萄聚糖凝膠立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖2.有關(guān)物質(zhì)與異構(gòu)體有關(guān)物質(zhì)與異構(gòu)體頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查 取本品適量，精密稱定，加流動相制成約含的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動相制成2.5 g/ml的溶液，作為對照溶液。

10、取對照溶液20l注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10%，再取供試品溶液和對照品溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的倍，供試品溶液如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和，其中E異構(gòu)體峰面積不得大于對照溶液主峰面積之和(1.0%)，3-異構(gòu)體峰面積不得大于倍(1.5%)，其余單個雜質(zhì)峰面積的和不得大于3倍(3.0%)。(供試品溶液中任何小于對照品溶液主峰面積之和倍的峰可忽略不計) 青霉素鈉青霉素鈉(鉀鉀)的吸光度檢查：的吸光度檢查： 本品加水制成每本品加水制成每1mL含有含有1.80mg的溶液，照的溶液，照UV-Vis法，在法，在280nm波長處測定

11、吸光度，不得大于波長處測定吸光度，不得大于0.10；在；在264nm波長處有最大吸收，吸光度應(yīng)為波長處有最大吸收，吸光度應(yīng)為0.80-0.88. 該法該法264nm處吸收值用來控制青霉素鈉處吸收值用來控制青霉素鈉(鉀鉀)的含量，的含量，280nm處吸收值用來控制雜質(zhì)的含量。處吸收值用來控制雜質(zhì)的含量。4.有機(jī)溶劑：用GC法或者HPLC法5.結(jié)晶性第一法(偏光顯微鏡法)第二法(X射線粉末衍射法)u 碘量法u 汞量法u 酸堿滴定法u 羥肟酸比色法u HPLC法阿莫西林克拉維酸鉀片色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉，加水90

12、0 ml溶解，用磷酸或10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至，加水稀釋至1000ml)-甲醇(95:5)為流動相；流速為；檢測波長為220nm。阿莫西林峰與克拉維酸峰的分離度應(yīng)大于 測定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水適量，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取阿莫西林對照品與克拉維酸對照品各適量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林和克拉維酸的混合溶液，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積分別計算供試品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。 堿性環(huán)己多元醇堿性環(huán)己多元醇+ +氨

13、基糖氨基糖苷苷鏈霉素鏈霉素(Streptomycin)巴龍霉素巴龍霉素(paromomycin)OCH2OHHOOHNH2OOHNH2H2NOOHOOOR2OHHOH2NCH2OHR1D-D-葡萄糖胺葡萄糖胺脫氧鏈霉胺脫氧鏈霉胺巴龍胺巴龍胺D核糖核糖巴龍霉糖巴龍霉糖巴龍二糖胺巴龍二糖胺慶大霉素慶大霉素(Gentamycin)1 1）溶解度（氨基、羥基）：水溶性）溶解度（氨基、羥基）：水溶性2 2）堿性（氨基）：臨床應(yīng)用其硫酸鹽；溶于水，）堿性（氨基）：臨床應(yīng)用其硫酸鹽；溶于水，但不溶于有機(jī)溶劑；但不溶于有機(jī)溶劑；3 3）旋光性（糖）：多個手性碳）旋光性（糖）：多個手性碳4 4）穩(wěn)定性（苷）：強(qiáng)

14、酸、堿條件均可水解；臨）穩(wěn)定性（苷）：強(qiáng)酸、堿條件均可水解；臨床使用時對床使用時對pHpH值有很高的要求；值有很高的要求；5 5）紫外吸收光譜）紫外吸收光譜1. 1.茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng)羥基胺類羥基胺類,-,-氨基酸氨基酸藍(lán)藍(lán)紫紫色色慶慶大大霉霉素素鏈鏈霉霉素素茚茚三三酮酮2. Molisch 試驗(yàn) 五碳糖或六碳糖結(jié)構(gòu)OHOH2CCHOOHOHOH2CCHOHOH紅紫色羥甲基糠醛( (含六碳糖結(jié)構(gòu)氨基糖含六碳糖結(jié)構(gòu)氨基糖苷類酸性水解產(chǎn)物苷類酸性水解產(chǎn)物) )OHOH2CCHOoOH2CCHoo藍(lán)紫色3. N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)（Elson-Morgan反應(yīng)）甲甲基基葡葡萄萄糖糖胺胺慶慶大大霉霉素

15、素鏈鏈霉霉素素水水解解 N乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對二甲氨基苯甲醛H+紅色4.麥芽酚反應(yīng)鏈霉糖特有反應(yīng)紫紅色麥芽酚鏈霉糖鏈霉素分子重排3OHFeH+NH C NH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHNHNHCH3H2O NaOHOOOHCH3OOCH3Fe3+H+OFe33+/紫紅紫紅麥芽酚麥芽酚5.坂口反應(yīng)鏈霉胍特有反應(yīng)橙橙紅紅羥羥基基喹喹啉啉鏈鏈霉霉胍胍鏈鏈霉霉素素次次溴溴酸酸鈉鈉 8OH（或或-萘酚萘酚）NH CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3坂口反應(yīng)麥芽酚反應(yīng)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)6.硫酸鹽反應(yīng)

16、7.色譜法：TLC和HPLC法8.光譜法：IR、UV1.鏈霉素中鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）的檢查來源：發(fā)酵中產(chǎn)生方法：TLC中的對照品法2.硫酸奈替米星中西索米星的檢查(TLC)3.慶大霉素C組分的測定微生物檢定法微生物檢定法平行反應(yīng)，檢測同等量下供試品和對照品對微生物的抑平行反應(yīng)，檢測同等量下供試品和對照品對微生物的抑制作用；制作用；管碟法：利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較管碟法：利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品對菌群產(chǎn)生的抑菌圈大?。粯?biāo)準(zhǔn)品和供試品對菌群產(chǎn)生的抑菌圈大??；濁度法：通過抗生素在液體培養(yǎng)基中對細(xì)菌生長的抑制濁度法：通過抗生素在液體培養(yǎng)基中對細(xì)菌生長的

17、抑制作用，通過測定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品作用，通過測定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品抑菌程度，測定供試品效價；和供試品抑菌程度，測定供試品效價；-該法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、量少、直觀；與臨床要求一直；該法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、量少、直觀；與臨床要求一直；使用范圍廣；是效價測定的最基本方法；目前分子結(jié)構(gòu)使用范圍廣；是效價測定的最基本方法；目前分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多組分抗生素，首選該法測效價。復(fù)雜、多組分抗生素，首選該法測效價。-該法缺陷：操作步驟多，時間長，誤差大。該法缺陷：操作步驟多，時間長，誤差大。HPLC法法有紫外吸收有紫外吸收紫外、熒光檢測器紫外、熒光檢測器無紫外吸收無紫外吸收衍生

18、化；衍生化； 電化學(xué)檢測器或蒸發(fā)光散射法電化學(xué)檢測器或蒸發(fā)光散射法2CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R1ABCD1234567891011121）兩性：）兩性： -OH酸性酸性 N(CH3)2堿性堿性 Ca2+、Mg2+生成不溶性鹽；生成不溶性鹽；Fe3+形成紅色配合物；形成紅色配合物； Al3+形成黃色配合物形成黃色配合物 ；pH3 7.5 多價陽離子與酚二酮多價陽離子與酚二酮熒光熒光 l 與酸、堿均可成鹽；l 臨床多用鹽酸鹽；l 強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中溶解度 2）旋光性）旋光性3）與金屬離子絡(luò)合）與金屬離子絡(luò)合(酚羥基、烯醇基酚羥基、烯醇基)4）UV和熒光和熒光 弱酸性（弱酸性（p

19、H2-6） A環(huán)環(huán)C-4異構(gòu)化異構(gòu)化 差向四環(huán)素差向四環(huán)素酸性（酸性（pH 2） C環(huán)脫水環(huán)脫水 脫水四環(huán)素脫水四環(huán)素堿性堿性 C環(huán)開環(huán)，形成內(nèi)酯環(huán)開環(huán)，形成內(nèi)酯 異四環(huán)素異四環(huán)素5）不穩(wěn)定性A.A.差向異構(gòu)化差向異構(gòu)化差差向向金金霉霉素素差差向向四四環(huán)環(huán)素素金金霉霉素素四四環(huán)環(huán)素素 4462pH藍(lán)色熒光淡黃黑OOHCONH2(CH3)2NOHHOOHCONH2N(CH3)2HOHAApH2.06.02CH3NHOHCONH2OOHOHOOHR2R1HO（氫鍵，土霉素、多西環(huán)素不易差向異構(gòu)化）B.B.酸性脫水降解酸性脫水降解脫脫水水金金霉霉素素脫脫水水四四環(huán)環(huán)素素金金霉霉素素四四環(huán)環(huán)素素 2pHmax = 445nmmax = 435nmROHCH3OHOOHHRCH3OHOOHRCH3OHOHOH2ODDDCBBCBCC.C.堿性脫水降解堿性脫水降解)(無活性無活性異四環(huán)素異四環(huán)素四環(huán)素四環(huán)素 OHROHCH3OHROOHOOHCONH2NHOHCH3CH3CH3CH3ROHROOOHCONH2NHOH