DNA損傷反應(yīng)誘導(dǎo)炎癥和衰老通過抑制GATA4自噬

1、TheDNAdamageresponseinducesinflammationandsenescencebyinhibitingautophagyofGATA4DNA損傷反應(yīng)通過抑制GATA4自噬誘導(dǎo)炎癥和老化introduction:細(xì)胞衰老是一個(gè)由多重應(yīng)激導(dǎo)致基因表達(dá)變異和擴(kuò)增的過程。雖然這也是一種潛在的腫瘤抑制機(jī)制，但衰老機(jī)制也參與了一些病理過程，包括老化，年齡相關(guān)的疾病，甚至與致瘤機(jī)制有關(guān)。衰老細(xì)胞能分泌一些衰老相關(guān)分泌表型SASP影響自身的微環(huán)境，這些SASP包括前炎性細(xì)胞因子，趨化因子，生長因子和蛋白酶。SASP啟動(dòng)和維持的機(jī)制以轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和C/EBPb為特征的經(jīng)典炎癥調(diào)節(jié)

2、機(jī)制。rational:P53和p16INK4a/RB是衰老過程的兩個(gè)重要核心調(diào)控通道。不依賴于p53或p16INK4a的另一種獨(dú)立衰老調(diào)控通路能調(diào)節(jié)SASP。根據(jù)miR-146a的啟動(dòng)子片段開發(fā)了一種綠色熒光蛋白標(biāo)記的衰老信號(hào)，可以檢測(cè)到人類成纖維細(xì)胞衰老過程中的miR-146a。衰老誘導(dǎo)刺激物能激活SASP,包括復(fù)制疲憊，DNA損傷，致癌RAS激活。RESULTS:通過對(duì)miR-146a啟動(dòng)子的分析，我們定位衰老誘導(dǎo)活化的關(guān)鍵區(qū)域并確定了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GATA4在衰老調(diào)控中的作用。正常情況下，GATA4與P62自噬體結(jié)合發(fā)生選擇性自噬而被降解。在衰老反應(yīng)中，GATA4和P62反應(yīng)減弱可以抑制

3、這種自噬反應(yīng)。GATA4通過誘導(dǎo)能激活NF-kB通路的因子啟動(dòng)和維持SASP,從而可以促進(jìn)衰老過程，這些因子包括月中瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白2和IL-1A。GATA4通路的活化同p53和p16INK4a通路活化機(jī)制相似，需要DDR激酶ATM和ATR的活化。不同的是，GATA4通路是不同于p53和p16INK4a的另外的獨(dú)立通路。GATA4蛋白大量存在與衰老刺激物誘導(dǎo)的老鼠、正常老化的老鼠及人的多個(gè)組織中，包括腦細(xì)胞，這些發(fā)現(xiàn)均提示GATA4通路參與年齡相關(guān)性炎癥反應(yīng)的過程。CONCLUSION:我們的結(jié)果說明GATA4通過TRAF3IP2和IL-1A激活的NF-kB通路參與自噬反應(yīng)、DDR所致的

4、衰老及炎癥過程。GATA4通過DDR調(diào)控衰老是不同于P53和p16INK4a通路的獨(dú)立通路的關(guān)鍵。我們認(rèn)為衰老細(xì)胞中大量積聚的GATA4能通過炎癥反應(yīng)促進(jìn)老化和疾病，而抑制GATA4通路可能為疾病的治療提供了一個(gè)新方向。細(xì)胞老化是應(yīng)激反應(yīng)的最終階段，由P53和p16INK4a月中瘤抑制蛋白調(diào)控。老化的顯著特征是一種與腫瘤生長和老化相關(guān)的前炎性反應(yīng)，SASP。已經(jīng)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子GATA4可以調(diào)控老化和SASP。正常情況下，GATA4能通過P62介導(dǎo)的選擇性自噬作用降解，而衰老反應(yīng)則可使GATA4保持恒定。Text:在應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞老化是一種防止異常細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)增的機(jī)制。細(xì)胞老化抑制細(xì)胞和組織的再

5、生能力，衰老細(xì)胞的消除有助于誘導(dǎo)老化模型鼠的老化相關(guān)表型的表達(dá)。而如何接收衰老信號(hào)啟動(dòng)老化反應(yīng)的具體調(diào)節(jié)機(jī)制并不清楚。多種衰老刺激信號(hào)能引起哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)入不可逆的生長阻滯期，這些信號(hào)包括復(fù)發(fā)擴(kuò)散導(dǎo)致的端粒的縮短、DNA損傷以及活化癌基因的表達(dá)。衰老細(xì)胞除了能引起細(xì)胞生長阻滯外，在基因表達(dá)中也有很大的作用，包括SASP的表達(dá)。在生理狀態(tài)下，SASP因子可以通過自分泌和旁分泌的方式加強(qiáng)衰老細(xì)胞的生長阻滯，老化細(xì)胞能刺激癌前細(xì)胞或癌變細(xì)胞擴(kuò)增形成月中瘤。另一方面，SASP激活免疫系統(tǒng)可以抑制月中瘤，而當(dāng)衰老細(xì)胞在發(fā)揮作用被移除后可以促進(jìn)受損組織的修復(fù)。SASP可以直接或間接地促進(jìn)與一些年齡相關(guān)性疾

6、病的慢性炎性因子的分泌。盡管SASP由很廣泛的生物學(xué)活性，但是對(duì)于SASP產(chǎn)生的NF-kB經(jīng)典途徑以外的作用卻是有限的，比如CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白b(C/EBPb),IL-1a和P38MAPK。在老化刺激下NF-kB炎性反應(yīng)被激活的機(jī)制亦是未知的。與老化生長停滯相比，P53和p16INK4a/Rb月中瘤抑制途徑有重要的作用，SASP并不依賴于P53和p16INK4a/Rb月中瘤抑制途起作用，而是有自己獨(dú)立的衰老調(diào)控通路。與急劇的正常炎性反應(yīng)相比，SASP反應(yīng)很緩慢，到老化細(xì)胞生長阻滯通常需要幾天的時(shí)間，這將提供一個(gè)衰老特異性的激活機(jī)制。除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，自噬通過targetofrapamyc

7、in(TOR)autophagyspatialcouplingcompartment(TASCC影響SASP的形成。TASCC通過mTOR與自噬溶酶體氨基酸殘基結(jié)合而起到促進(jìn)分泌蛋白質(zhì)合成的作用。也有研究表明抑制自噬在某些條件下能促進(jìn)老化。因此，自噬和老化之間的關(guān)系暫時(shí)還不清楚GATA4,anovelsenescenceregulator我們分析了microRNA在非老化細(xì)胞和衰老人成纖維細(xì)胞的表達(dá)，通過復(fù)制疲憊誘導(dǎo)老化并發(fā)現(xiàn)miR-146a在老化細(xì)胞中高度表達(dá)。我們猜測(cè)miR-146a調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平的初始階段。我們將1.5-kbmiR-146a啟動(dòng)子片段融合如綠色熒光蛋白中PmiR-

8、146a-GFP。miR-146a在一些老化誘導(dǎo)因子作用下表達(dá)增加，包括復(fù)制疲憊、電離輻射及致癌基因RAS的表達(dá)。通過ECB瀏覽器，我們發(fā)現(xiàn)miR-146a有兩個(gè)高度進(jìn)化的保守域，ECR1和ECRU2。ECR2對(duì)基因活性有重要的作用，因?yàn)镋CR2有NF-kB結(jié)合部位，而NF-kB能調(diào)控miR-146a,我們從藥理學(xué)和遺傳學(xué)角度抑制了完全表達(dá)SASP的衰老細(xì)胞的NF-kB通路。而衰老細(xì)胞中只有部分NF-kB被抑制，這個(gè)結(jié)果表明其它的轉(zhuǎn)錄因子也作用于激活miR-146a關(guān)聯(lián)的細(xì)胞老化。為了確定其它轉(zhuǎn)錄因子的活性，我們搜查了那些被預(yù)測(cè)能結(jié)合ECR2的轉(zhuǎn)錄因子。我們逐一將搜查13個(gè)轉(zhuǎn)錄因子過度表達(dá)并檢

9、測(cè)miR-146a的活性，只有GATA4符合條件。在衰老細(xì)胞中，siRNAGATA4被耗盡。ChIP-qPCR顯示GATA4表達(dá)與miR-146aECR2直接連接。GATA4是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在各種器官的發(fā)育中是必不可少的，包括心臟，睪丸，前腸，肝，和腹側(cè)胰腺。為了檢測(cè)GATA4的功能，我們研究了異位表達(dá)或缺乏在人二倍體成纖維細(xì)胞老化反應(yīng)中的影響。GATA4異位表達(dá)誘導(dǎo)人包皮成纖維細(xì)胞和IMR-90成纖維細(xì)胞的老化，通過增加SA-b-Gal的活性及減少BrdU的合成。更重要的是，通過穩(wěn)定表達(dá)shRNA導(dǎo)致GATA4耗盡能部分下調(diào)IR誘導(dǎo)的SA-B-Gal的活性和延遲復(fù)制性衰老。這是由于GAT

10、A4發(fā)生CRISPR突變。這些數(shù)據(jù)表明GATA4對(duì)老化有正性調(diào)節(jié)作用。在衰老中GATA4有調(diào)控作用，而在肺，結(jié)腸癌，前列腺癌，卵巢癌和乳腺癌中，則保持沉默。SelectiveautophagysuppressesGATA4andsenescence在檢測(cè)GATA4siRNA的效率時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)GATA4的量在衰老細(xì)胞中增加。事實(shí)上，豐富的GATA4蛋白，而不是mRNA,能增加IR-和癌基因誘導(dǎo)的衰老和復(fù)制老化。這是由于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性提高，通過放線菌酮和全球蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析檢測(cè)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在真核細(xì)胞中有兩個(gè)主要蛋白質(zhì)降解途徑：泛素蛋白酶體和自噬溶酶體途徑。用MG-132抑制蛋白酶體，MG-132

11、是一種蛋白酶體抑制劑，對(duì)GATA4沒有影響，而GATA4蛋白在溶酶體抑制劑（溶酶素A、E64d、胃蛋白酶抑制劑）存在的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)提示自噬溶酶體途徑能調(diào)控GATA4。自噬部件ATG5或ATG7同樣能上調(diào)GATA4蛋白。自噬可以通過特異性自噬受體介導(dǎo)途徑選擇性地降低某些基物。事實(shí)上，自噬受體P62的耗盡能增加GATA4蛋白。衰老過程中外源性表達(dá)和內(nèi)源性GATA4與p62相互作用減弱。因此，在正常條件下，GATA4與P62發(fā)生特異性作用發(fā)生自噬，而在老化中，可能與P62的相互作用減弱，GATA4變得穩(wěn)定了。衰老與自噬之間的關(guān)系目前還不清楚。自噬在老化或抑制老化過程中是必不可少的。我們結(jié)

12、果可以解釋這些矛盾。選擇性自噬可能會(huì)通過抑制衰老調(diào)控因子如GATA4來防止老化。然而，衰老誘導(dǎo)刺激物可以引起GATA4逃脫選擇性自噬。隨后，非選擇性自噬可能激活有助于老化。因此，GATA4的選擇性自噬可能對(duì)老化的起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用。如果是這樣，瞬時(shí)抑制自噬可引起衰老。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們利用多西環(huán)素（阿霉素）誘導(dǎo)的shRNA耗盡ATG5或ATG7和瞬時(shí)抑制自噬，使GATA4增力口，然后通過去除多西環(huán)素恢復(fù)自噬，使細(xì)胞達(dá)到一個(gè)可老化的狀態(tài)。短暫抑制自噬（高濃度GATA4,自噬on）誘導(dǎo)的衰老比持續(xù)性抑制自噬（高濃度GATA4,自噬off）更有效，這種效果，至少在一部分取決于GATA4。連續(xù)和短暫抑

13、制自噬使獲得同樣的GATA4濃度，但連續(xù)抑制未能誘導(dǎo)衰老。在正常狀態(tài)下，P62缺乏比自噬調(diào)節(jié)受體ATG7或ATG5的缺乏更有效率的誘導(dǎo)老化。因此，選擇性自噬可以成為GATA4的抗衰老機(jī)制，而非選擇性自噬則是促衰老機(jī)制。GATA4regulatestheSASP為了確定GATA4調(diào)節(jié)老化的機(jī)制，我們探究了GATA4是如何影響人成纖維細(xì)胞基因表達(dá)的。GATA4異位表達(dá)時(shí)可以誘導(dǎo)老化，我們利用阿霉素誘導(dǎo)GATA4載體在GATA4表達(dá)之前和之后對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄普進(jìn)行測(cè)序。我們根據(jù)基因本體論系統(tǒng)描述了GATA4是如何影響細(xì)胞進(jìn)程的?；虮磉_(dá)GATA4的增加對(duì)一些應(yīng)答是有意義的，如免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷反應(yīng)

14、，而GATA4的表達(dá)減少則與細(xì)胞周期的生理過程有關(guān)。我們比較了GATA4基因集和與增殖老化基因集的區(qū)別，無論基因是上調(diào)還是下調(diào)均有意義，而基因的上調(diào)更具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明GATA4有轉(zhuǎn)錄激活因子的作用。結(jié)果說明GATA4可能激活一部分老化相關(guān)基因。在GATA4調(diào)節(jié)的老化相關(guān)基因中我們發(fā)現(xiàn)了很多SAPA基因，這些基因能編碼IL6,IL8,CXCL1,粒-巨細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）,細(xì)胞外基質(zhì)蛋白激酶和抑制劑。炎癥應(yīng)答和免疫應(yīng)答中的細(xì)胞因子和趨化因子由老化細(xì)胞分泌，可以改變細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境，增強(qiáng)老化阻滯，GATA4通過SASP可能直接調(diào)節(jié)其他的老化表型，尤其是生長阻滯。GATA4的異位表達(dá)通過R

15、t-qPCR可以誘導(dǎo)SASP相關(guān)的基因表達(dá)。更為重要的是，在建立老化過程中，GATA4的過度消耗可以抑制很多SASP基因的表達(dá)，說明GATA4控制了很多SASP基因而GATA家族的另一成員GATA3并不能增力口SASP相關(guān)基因的表達(dá)，即使預(yù)測(cè)說它是一種很強(qiáng)的月中瘤抑制因子。同樣的，GATA3的表達(dá)不能增加月中瘤壞死因子相關(guān)受體蛋白2TRAF3IP2的表達(dá)。GATA4regulatesNF-kBNF-kB在調(diào)控SASP上有至關(guān)重要的作用，但對(duì)于NF-kB是如何激活衰老過程的人們知道得很少。為了檢測(cè)GATA4與NF-kB在調(diào)節(jié)SASP的關(guān)系，我們測(cè)試了當(dāng)NF-kB的重要成分RELA受到抑制時(shí)，是如

16、何影響GATA4誘導(dǎo)SASP。RELA耗盡能夠抑制GATA4調(diào)節(jié)的SASP相關(guān)基因表達(dá)。GATA4的表達(dá)觸發(fā)NF-kB的激活，而GATA4缺乏在老化過程中抑制NF-KB的活化；這些研究結(jié)果表明，GATA4在調(diào)節(jié)SASP過程中彳用于NF-kB的上游。為了了解GATA4是如何激活NF-kB的，我們收索了在基因組芯片實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的約束GATA4的啟動(dòng)子，據(jù)此發(fā)現(xiàn)并檢驗(yàn)與激活NF-kB具有同樣功能的基因是如何被GATA4調(diào)控的。GATA4減少TRAF3IP2的表達(dá)，一種TRAF6的泛素連接酶和TRAF3IP2的缺乏能部分阻滯GATA4激活NF-kB,可以通過SASP基因的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估。TRAF3IP2異

17、位表達(dá)能部分緩解在IR誘導(dǎo)老化細(xì)胞中由于GATA4缺乏導(dǎo)致的SASP減少。SASP因子能抵抗TRAF31P2消耗，如IL6和CXCL3,結(jié)果表明GATA4的下游基因通過TRAF31P2通路對(duì)SASP起到調(diào)控作用。RELA消耗能完全阻滯GATA4調(diào)控的SASP的活化，除了IL1A外。IL1A在SASP調(diào)控中，對(duì)NF-KB有正反饋調(diào)控作用。因此，SASP在GATA4依賴的途徑中，IL1A可能與TRAF3IP2有協(xié)同作用。通過評(píng)估SASP基因的表達(dá)，IL1A缺乏能減少GATA活化的NF-KB途徑。此外，將SASP相關(guān)的活化基因轉(zhuǎn)移到缺乏GATA4反應(yīng)的細(xì)胞中，由GATA4誘導(dǎo)的細(xì)胞通過條件培養(yǎng)液獲得

18、。因止匕，GATA4通過TRAF3IP2andIL1A激活NF-KB途徑作用于SASP°TRAF31P2缺失也部分阻滯GATA4誘導(dǎo)的衰老，SA-B-Gal的活性。不同于GATA4的表達(dá)，TRAF31P2表達(dá)不足以誘導(dǎo)的SA-B-Gal的活化，卻能激活SASP相關(guān)的基因表達(dá)。止匕外，TRAF3IP2異位表達(dá)與IL1A一起仍然不足以誘導(dǎo)SA-B-Gal活化，卻能激活GATA4。因此，該SASP可能不是GATA4調(diào)控衰老的唯一機(jī)制。事實(shí)上，此前確定的老化調(diào)控基因，如早幼粒白血病蛋白（PML）和YPEL3都屬于GATA4誘導(dǎo)的基因。GATA4,anewbranchofthesenescen

19、ceregulatorypathway為了更全面地了解GATA4調(diào)控衰老的機(jī)制，我們研究了兩個(gè)核心衰老的調(diào)節(jié)通路中，p53和p16INK4a通路。GATA4對(duì)老化的影響是獨(dú)立于p53和p16INK4a/Rb途徑的。GATA4激活產(chǎn)生能誘導(dǎo)老化的IR劑量，能保持完整的細(xì)胞中缺乏的p53或p53基因和Rb。止匕外，沒有活化的P53和p16INK4a中，GATA4同樣被激活。因此，GATA4是獨(dú)立于p53-和p16INK4a的途徑。DNA損傷應(yīng)答（DDR）作用于該途徑的上游。事實(shí)上，抑制DDR調(diào)控因子ATM和ATR能抑制老化的GATA4途徑。因此，GATA4途徑誘導(dǎo)的SASP似乎是在DDR的一個(gè)獨(dú)立

20、分支。DDR是如何抑制自噬基礎(chǔ)上GATA4降解仍然是今后研究的核心問題。GATA4sroleinsenescenceinvivo為了測(cè)試GATA4活性和調(diào)控作用在體內(nèi)同樣發(fā)生，我們檢測(cè)了存在氧生理?xiàng)l件下小鼠胚胎成纖維細(xì)胞通過IR誘導(dǎo)的老化的GATA4表達(dá)。Gata4增加能引起衰老誘導(dǎo)的IR增加，需要幾個(gè)GATA4靶基因的作用，包括那些編碼Traf3ip2和SASP因子的基因，如IL6,IL1A,和CXCL1因子。因此，GATA4調(diào)節(jié)老化表型的途徑也能存在與小鼠中。為了確定GATA4在小鼠體內(nèi)對(duì)老化應(yīng)答是否有作用，我們檢測(cè)了多種組織均老化的輻射鼠的GATA4水平。在皮膚可肝臟中，GATA4增加引

21、起老化誘導(dǎo)的IR增加，因此，GATA4在體內(nèi)積聚能通過DNA損傷誘導(dǎo)老化。衰老細(xì)胞隨著小鼠和人年齡的增長而堆積。我們研究了年輕和老的小鼠（分別是6月齡和22月）并發(fā)現(xiàn)年齡大的小鼠的腎臟和肝臟中GATA4積聚增加：這種積累與p16INK4a基因相關(guān)。而且，老化小鼠肝臟表明NF-KB通過RELAX磷酸化被活化，這個(gè)結(jié)果與我們培養(yǎng)的細(xì)胞一致。我們也研究了人腦中的GATA4,老年人的額葉皮質(zhì)中，GATA4和p16INK4a均增加。為了證實(shí)這些結(jié)果，我們通過免疫熒光微鏡研究了年輕人和老年人額葉皮質(zhì)GATA4和p16INK4a基因之間的空間關(guān)系。GATA4和p16INK4a在老年人大腦中的表達(dá)更多。止匕外

22、，我們?cè)谏偻荒z質(zhì)細(xì)胞、椎體神經(jīng)元、星形細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了GATA4和p16INK4a的一個(gè)顯著空間相關(guān)性，進(jìn)一步支持GATA4在人衰老過程中的老化作用。因此，在鼠和人衰老過程中，GATA4可能促進(jìn)細(xì)胞衰老和炎癥反應(yīng)。我們的研究結(jié)果表明，自噬對(duì)衰老有正性和負(fù)性調(diào)節(jié)作用。InresponsetoIR,這些衰老表型依賴于DDR信號(hào)激酶ATM和ATR,和衰老相關(guān)基因p53和p16INK4a的表達(dá)類似。然而，GATA4途徑是方4立于p53和p16INK4a通路的，從而建立了一個(gè)新的DDR途徑。GATA4調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老一部分是通過影響SASP起作用的。同樣，GATA4可以作為TRAF3IP2andIL1A介導(dǎo)的N

23、F-kB的上游調(diào)節(jié)因子啟動(dòng)和維持NF-kB活性的調(diào)節(jié)因子。GATA4也激活的miR-146a的表達(dá)，從而降低NF-KB的活性。GATA4-MIR-146A-NF-kB通路形成了一個(gè)無規(guī)律的正反饋途徑，在SASP基因表達(dá)風(fēng)暴形成之后，能抑制炎癥反應(yīng)。然而，這并不終止炎癥反應(yīng)，盡管在高水平的miR-146A存在下，衰老細(xì)胞也能維持SASP的水平。miR-146a可能防止意外激活該途徑以至于GATA4或其它因子在正常狀態(tài)下隨機(jī)波動(dòng)?？傊?，我們的結(jié)果表明，GATA4是一衰老表型的關(guān)鍵條件因子，并通過IL1A和TRAF3IP2激活NF-kB途徑參與自噬和DDR所致的老化過程。細(xì)胞老化被證明是把雙刃劍。這

24、個(gè)途徑可以促進(jìn)正常的發(fā)育和傷口的愈合。然而，衰老細(xì)胞的積累可作為識(shí)別生物體年齡，能促進(jìn)老化相關(guān)的表型與衰老相關(guān)的疾病，包括癌癥和神經(jīng)退行性變。因此，了解潛在的對(duì)老化的控制途徑對(duì)人體健康有重要意義。調(diào)節(jié)GATA4途徑可能為治療年齡相關(guān)性疾病提供了一個(gè)新思路。GATA4,anovelsenescenceregulatorInanefforttodevelopnewmarkersforsenescence,weanalyzedmicroRNAexpressioninnonsenescentandsenescenthumanfibroblasts(strainIMR-90fromfetallung).

25、WeinducedsenescencebyreplicativeexhaustionandfoundmiR-146atobehighlyexpressedbysenescentbutnotnonsenescentcells(fig.S1A),aresultalsoreportedforhumanforeskinfibroblasts(HCA2)(34).Givenitsabundantexpression,wesuspectedthatmiR-146aregulationoccursprimarilyattheleveloftranscription.Wethereforegenerateda

26、1.5-kbmiR-146apromoterfragmentfusedtogreenfluorescentprotein(PmiR-146a-GFP).Expressionofthisreporterconstructwassignificantlyincreasedinresponsetoseveralsenescence-inducingstimuli,includingreplicativeexhaustion,ionizingradiation(IR;12Gy),andexpressionofoncogenicRAS(fig.S1B).UsingtheEvolutionarilyCon

27、servedRegionsbrowser(35),wefoundthatthemiR-146apromotercontainstwoevolutionarilyconservedregions,ECR1andECR2.ECR2wascriticalforreporteractivity(fig.S1C).BecauseECR2hasaputativeNF-kBbindingsiteandNF-kBisknowntoregulatemiR-146a(36),weinhibitedNF-kBeitherpharmacologically(withaninhibitorofIkBkinase,Bay

28、11-7082)orgeneticallywithshortinterferingRNAs(siRNAs)targetingtheNF-kBfamilymemberRELA(p65)infullysenescentSASP-expressingcells.NF-kBinhibitiononlypartiallydecreasedreporteractivityinsenescentcells(fig.S1D).Theseresultsindicatethatothertranscriptionfactorsalsocontributetosenescencedependentactivatio

29、nofthemiR-146areporter.Toidentifyadditionaltranscriptionfactorsresponsibleforthereporteractivity,wesearchedforonesthatwerepredictedtobindtoECR2(seeMaterialsandMethods).Weindividuallyoverexpressedeachcandidateandexaminedreporteractivity.Of13transcriptionfactorsselected,onlyGATA4,butnototherGATAfamily

30、members,activatedthereporter(Fig.1Aandfig.S2,AandB).DepletionofGATA4withsiRNAsshowedthatitwasrequiredforreporteractivationduringsenescence(Fig.1B).Chromatinimmunoprecipitationcombinedwithquantitativepolymerasechainreaction(ChIP-qPCR)revealedthatexogenouslyexpressedGATA4bounddirectlythemiR-146aECR2re

31、gion(fig.S2C).TheseresultsindicatethatGATA4contributestoactivationofthemiR-146apromoterinsenescentcells.GATA4isazincfingertranscriptionfactoressentialforthedevelopmentofvariousorgans,includingheart,testis,foregut,liver,andventralpancreas(37).ToexaminewhetherGATA4functionsinsenescence,weexaminedtheef

32、fectsofectopicexpressionordepletionduringthesenescenceresponseofhumandiploidfibroblasts.EctopicexpressionofGATA4inducedsenescenceinhumanforeskinfibroblasts(strainBJ;Fig.1C)andIMR-90fibroblasts(fig.S3,AandB),asshownbyincreasedsenescence-associateb-galactosidase(SA-b-Gal)activityanddecreased5-bromo-2&

33、#39;-deoxyuridine(BrdU)incorporation.Moreimportant,depletionofGATA4withstablyexpressedshorthairpinRNAs(shRNAs)partiallydecreasedIR-inducedSA-b-Galactivity(Fig.1Dandfig.S3C)anddelayedreplicativesenescence(Fig.1E).WeconfirmedtheseresultsbyCRISPRmutationofGATA4(fig.S3D).ThesedataindicatethatGATA4isapos

34、itiveregulatorofsenescence.Consistentwitharegulatoryroleinsenescence,GATA4isfrequentlysilencedinlung,colon,prostate,ovarian,andbreastcancer(38,39).SelectiveautophagysuppressesGATA4andsenescenceWhileexaminingtheefficiencyofGATA4siRNAs(Fig.1B),wenoticedthattheamountofGATA4increasedinsenescentcells.Ind

35、eed,abundanceoftheGATA4protein,butnotmRNA,increasedduringIR-andoncogene-inducedsenescenceandreplicativesenescence(Fig.2A).Thisincreasewasprimarilyduetoincreasedproteinstability,asindicatedbythemeasurementofproteinstabilityinthepresenceofcycloheximide(Fig.2B)andbyglobalproteinstabilityprofiling(40)(f

36、ig.S4A).Twomajorpathwaysineukaryoticcellsmediateproteindegradation:theubiquitin-proteasomeandautophagy-lysosomepathways.InhibitionoftheproteasomebyMG-132,aproteasomeinhibitor,hadnoeffectonGATA4abundance,whereasGATA4proteinwasstabilizedincellstreatedwithdistinctlysosomalinhibitorsknowntoblockautophag

37、y:bafilomycinA1(aselectiveinhibitorofthevacuolar-typeH+-adenosinetriphosphatase)orE64dandpepstatin(lysosomalproteaseinhib-itors)(Fig.2,CandD).Thesefindingsuggesttheautophagy-lysosomepathway,nottheubiquitinproteasomepathway,regulatesGATA4.Consistentwiththisinterpretation,depletionoftheautophagycompon

38、entsATG5orATG7alsoincreasedtheabundanceofGATA4protein(Fig.2E).Autophagycanselectivelydegradecertainsubstrates,mediatedbyspecificautophagicadaptors(4143).Indeed,depletionoftheautophagicadaptorp62increasedtheabundanceofGATA4protein(Fig.2F).ExogenouslyexpressedandendogenousGATA4physicallyinteractedwith

39、p62,andtheinteractionwasreducedduringsenescence(Fig.2Gandfig.S4B).Thus,GATA4appearstobetargetedforautophagicdegradationthroughitsassociationwithp62undernormalconditionsbutbecomesstabilizedduringsenescence,possiblythroughreducedassociationwithp62.Therelationshipbetweensenescenceandautophagyisunclear.

40、Autophagyisreportedtoberequiredfortheestablishmentofsenescence31,32,44)ortoinhibitsenescence(33).Ourresultscanreconciletheseconflictingreports.SelectiveautophagymightpreventsenescencebysuppressingpositivesenescenceregulatorssuchasGATA4.However,senescence-inducingstimulicauseGATA4toescapeselectiveaut

41、ophagy.Subsequently,generalautophagymaybeactivated,whichthencontributestoestablishmentofsenescence.Hence,selectiveautophagyforGATA4maybeanegativesenescenceregulator,whereasgeneralautophagyisapositiveregulatorofsenescence.Ifso,transientlyinhibitingautophagyshouldinducesenescence.Totestthis,weuseddoxy

42、cycline(Dox)-inducibleshRNAstodepleteATG5orATG7andtransientlyinhibitautophagy(45),allowingGATA4toaccumulate,andthenrestoredautophagybyremovingDox,returningthecelltoasenescencepermissivestate.Transientinhibitionofautophagy(GATA4abundancehigh,autophagyon)inducedsenescencemoreeffectivelythandidcontinuo

43、usinhibition(GATA4abundancehigh,autophagyoff);thiseffect,atleastinpart,dependedonGATA4(Fig.2,HandI,andfig.S4C).ContinuousandtransientinhibitionofautophagyincreasedGATA4abundancetosimilarextents,butcontinuousinhibitionfailedtoinducesenescence(Fig.2I).Consistentwiththisfinding,p62depletioninducedsenes

44、cenceevenmoreeffectivelythandiddepletionofthecoreautophagyregulatorsATG7orATG5undernormalconditions(fig.S4D).Thus,selectiveautophagyforGATA4appearstofunctionasanantisenescencemechanism,whereasgeneralautophagyfunctionsasapro-senescencemechanism.GATA4regulatestheSASPToinvestigatethemechanismsthroughwh

45、ichGATA4regulatessenescence,weexploredhowGATA4influencesgeneexpressioninhumanfibroblasts.BecauseGATA4inducessenescencewhenectopicallyexpressed,weperformedtranscriptionalprofilingwithRNAsequencing(RNA-seq)beforeandafterGATA4expressionusingaDoxinducibleGATA4vector.WeusedGeneOntology(GO)analysistosyste

46、maticallycharacterizethecellularprocessesaffectedbyGATA4(46).GenesshowingincreasedexpressioninresponsetoGATA4showedsignificantenrichmentforthetermsimmuneesponse,finflammatoryresponse,ahdresponsewounding,IIwhereasgeneswithdecreasedexpressionweremostlyenrichedforbiologicalprocessesrelatedtothecellcycl

47、e,whichcorrelatedwellwithtermspreviouslylinkedtosenescence(Fig.3AandtableS1).WecomparedtheGATA4-regulatedgeneset(GATA4-regulatedset)withagenesetdifferentiallyregulatedduringreplicativesenescence(Senescerslet).Bothup-regulatedanddown-regulatedgenesoverlappedsignificantly,withgreaterstatisticalsignifi

48、cancefortheup-regulatedgenes(P=2.4610-40),consistentwiththefactthatGATA4actsmostlyasatranscriptionalactivator(Fig.3B).TheseresultssuggestthatGATA4mightactivateamajorportionofsenescence-associatedgenes.AmongtheGATA4-regulated,senescence-associatedgenes,wefoundseveralSASPgenes,includingthoseencodingIL

49、6,IL8,C-X-Cmotifligand1(CXCL1),granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor(GM-CSF),andextracellularmatrix(ECM)proteasesandinhibitors(7).Becauseinflammatoryandimmune-modulatorycytokinesandchemokinessecretedbysenescentcellscanreinforcesenescencearrestandalterthemicroenvironment(1,2,10),GATA4mightin

50、directlyregulateothersenescentphenotypes,notablygrowtharrest,throughtheSASP.WeconfirmedthatectopicexpressionofGATA4inducestheexpressionofgenesassociatedwiththeSASPbyreversetranscriptionqPCR(RT-qPCR)(Fig.3C).Moreimportant,depletionofGATA4suppressedtheexpressionofseveralSASPgenesduringtheestablishment

51、ofsenescence(Fig.3D),indicatingthatGATA4indeedcontrolsmanySASPgenes.EctopicexpressionofGATA3anotherGATAfamilymemberpredictedtobeastrongtumorsuppressor(47,48)didnotincreaseexpressionofgenesassociatedwiththeSASP.Likewise,ectopicexpressionofGATA3didnotincreaseexpressionofTRAF3IP2tumornecrosisfactorrece

52、ptorassociatedfactor(TRAF)interactingprotein2,akeyGATA4downstreamtarget(seebelow),althoughhitisfunctionallyactive,asshownbyitsabilitytoactivateitswell-knowntargetIL13(fig.S5A).TheseresultssupportaspecificroleforGATA4inSASPregulation.However,wecannotruleoutthepossibilitythatotherGATAfactorsincludingG

53、ATA3mayhaveasimilarroleinothercelltypes.GATA4regulatesNF-kBNF-kBhasacrucialroleincontrollingtheSASP(18,19,49)(Fig.3D),yetlittleisknownabouthowNF-kBisactivatedduringsenescence.ToexaminetherelationshipbetweenGATA4andNF-kBinregulatingtheSASP,wetestedhowsuppressionoftheessentialNF-kBcomponentRELAaffecte

54、dtheGATA4-inducedSASP.RELAdepletioninhibitedtheexpressionofgenesassociatedwiththeSASPinresponsetoGATA4(Fig.4A).GATA4expressiontriggeredNF-kBactivation,andGATA4depletioninhibitedNF-kBactivationduringsenescence(Fig.4B);thesefindingssuggestthatGATA4actsupstreamofNF-kBinregulatingtheSASP.Tounderstandhow

55、GATA4activatesNF-kB,wesearchedpromotersboundbyGATA4ingenomewideChIPexperiments(50)tofindassociatedgenesthatfunctionasNF-kBactivators,andexaminedtheirregulationbyGATA4.GATA4inducedtheexpressionofTRAF31P2,anE3ubiquitinligaseforTRAF6(51)(Fig.4C),andTRAF3IP2depletionpartiallyblockedGATA4activationofNF-k

56、B,asassessedbytheexpressionofSASPgenes(Fig.4D).Furthermore,ectopicexpressionofTRAF3IP2partiallyrescuedthereducedSASPcausedbyGATA4depletioninIR-inducedsenescentcells(Fig.4E).NotethatcertainSASPfactors,suchasIL6andCXCL3,wereresistanttoTRAF31P2depletion;thisresultsuggeststhatGATA4regulatestheminaTRAF3I

57、P2-independentmanner,eitherdirectlyorindirectlythroughitsotherdownstreamtargets.RELAdepletionalmostcompletelyblockedtheactivationofSASPgenesbyGATA4,withtheexceptionofIL1A(Fig.4A).IL1A,aSASPcomponent,isthoughttoformafeedforwardactivationloopwithNF-kBinSASPregulation(13,52).Thus,IL1Amightcooperatewith

58、TRAF3IP2duringGATA4-dependentproductionoftheSASP.Consistentwiththisidea,depletionofIL1AreducedGATA4activationofNF-kB,asassessedbytheexpressionofSASPgenes(fig.S5B).Furthermore,activationofSASP-associatedgeneswastransmittedtocellslackingGATA4inductionbyconditionedmediumfromGATA4-inducedcells(fig.S5C).

59、Thus,GATA4appearstoact,atleastinpart,throughTRAF3IP2andIL1AtoactivateNF-kBinactivatingtheSASP.TRAF3IP2depletionalsopartiallyblockedGATA4-inducedsenescence,asdeterminedfromSA-b-Galactivity(Fig.4F).UnlikeGATA4expression,however,TRAF3IP2expressionalonewasnotsufficienttoinduceSA-b-Galactivity(fig.S6A),despiteactivatingexpressionofanumberofSASPassociatedgenes(fig.S6C).Moreover,ectopicexpressionofTRAF3IP2togetherwithIL1AwasstillnotsufficienttoinduceSA-b-Galactivity,incontrasttothatofGATA4(fig.S6B).Thus,theSASPmaynotbetheonl