動物細胞融合

1、動物細胞融合【實驗?zāi)康摹?. 了解動物細胞融合的常用方法2. 學(xué)習(xí)化學(xué)融合和電融合的基本操作過程3. 觀察動物細胞融和過程中細胞的行為和變化【實驗原理】A. 細胞融合的方法細胞融合是指在自發(fā)或者誘導(dǎo)條件下，兩個或兩個以上細胞合并為雙核或者多核細胞的過程。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有很多方法可以誘導(dǎo)細胞融合，包括病毒誘導(dǎo)融合、化學(xué)誘導(dǎo)融和和電激誘導(dǎo)融合。1.病毒誘導(dǎo)融合仙臺病毒、牛痘病毒、新城雞瘟病毒和皰疹病毒等可以介導(dǎo)細胞的融合。這類病毒的被膜中有融合蛋白，可介導(dǎo)病毒同宿主細胞融合，同時也可介導(dǎo)細胞與細胞的融合。用紫外線滅活后，這些病毒即可誘導(dǎo)細胞發(fā)生融合。但該法由于病毒的滅活較為復(fù)雜，故實驗室多不采用

2、此法用于細胞的融合。2.化學(xué)誘導(dǎo)融合 很多化學(xué)試劑能夠誘導(dǎo)細胞融合，如聚乙二醇()、二甲基亞砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰絲氨酸等。這些物質(zhì)能夠改變細胞膜脂質(zhì)分子的排列，在去除這些物質(zhì)之后，細胞膜趨向于恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)。在恢復(fù)過程中想接觸的細胞由于接口處脂質(zhì)雙分子層的相互親和與表面張力，細胞膜融合，胞質(zhì)流通，發(fā)生融合。化學(xué)誘導(dǎo)方法，操作方便，誘導(dǎo)融合的概率比較高，效果穩(wěn)定，適用于動、植物細胞，但對細胞具有一定的毒性。PEG是廣泛使用的化學(xué)融合劑。3.電激誘導(dǎo)融合 包括電誘導(dǎo)、激光誘導(dǎo)等。其中，電誘導(dǎo)是先使細胞在電場中極化成為偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強度、短時程的電脈沖擊破細

3、胞膜，細胞膜的脂質(zhì)分子發(fā)生重排，由于表面張力的作用，兩細胞發(fā)生融合。電誘導(dǎo)方法具有融合過程易控制、融合概率高、無毒性、作用機制明確、可重復(fù)性高等優(yōu)點。B. PEG誘導(dǎo)細胞融合聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C(CH20CH2)nCH2OH，為一系列不同相對分子量的多聚體。相對分子質(zhì)量在200-6000均可用作細胞融合劑。普遍認為聚乙二醇分子能與水分子借氫鍵結(jié)合，導(dǎo)致細胞膜由于脫水而膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使兩細胞接觸點處質(zhì)膜的脂 類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細胞發(fā)生融合：細胞融合率是指在顯微鏡 的一個視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細胞核總數(shù)與該視

4、野內(nèi)所有細胞(包括已融合的細胞)的細胞核總數(shù)之比，通常以百分比表示。該方法的優(yōu)點是：用法簡單，容易獲得融合體，融合效果好。實驗室常用分子量為400-6000D的PEG用于動物細胞的融合，動物細胞的融合受到很多外界因素的影響，如：PEG的濃度，作用時間，PH等。一般來說，PEG相對分子量越大，融合效果越好，而PEG的濃度通常為40%60%。PEG的作用時間通常為：15min,作用溫度為：3840，常使用GKN液將溶液的PH調(diào)節(jié)至8.08.2。同時GKN液還可以調(diào)節(jié)動物細胞的滲透壓從而使細胞保持一定的形態(tài)。【實驗用品】1. 材料雞血紅細胞；2. 試劑50%PEG、GKN液（NaCl 8g，KCl

5、0.4g，Na2HPO4·2H2O 1.77g，NaH2PO4·H2O 0.69g，葡萄糖 2g，酚紅 0.01g，溶于1000ml雙蒸水）、Alsevers細胞保存液、0.85%氯化鈉溶液；3. 器材顯微鏡、離心機、燒杯、載玻片、蓋玻片、離心管（帶刻度）、液體混合器、膠頭滴管、廢液缸等?！静僮鞑襟E】1. 雞血紅細胞的制備與保存用無菌注射器抽取Alsevers細胞溶液2ml，再從雞翼下靜脈取血2ml，取出后至于離心管中再加入6mlAlsevers細胞溶液，混勻并封口，至于4的冰箱中保存。2. PEG誘導(dǎo)融合1) 取雞血1ml+4ml 0.85%的NaCl溶液，在1200r/

6、min的離心機內(nèi)離心5分鐘。2) 將離心后的溶液，去上清液后，剩余。在沉降血球中，加入GKN液至4ml，使之成每毫升含血球15000萬個，即15x103 個/ml。3) 取上述1ml加0.5ml 60%的PEG液，先靜置使之呈明顯的分層3min,然后用液體混合器將液體混勻，停留1-2分鐘，即可鏡下觀察。4) 取上述制備的液體約半滴于載玻片上，蓋上蓋玻片進行觀察，觀察時注意找不同融合時期的融合細胞進行觀察與拍攝?！緦嶒灲Y(jié)果】實驗結(jié)果如下圖所示：圖2兩個細胞發(fā)生部分融合圖1兩個細胞開始接觸圖4兩個細胞完全融合圖3兩個細胞絕大多數(shù)部位發(fā)生融合【實驗結(jié)果分析與注意事項】1. 制備的雞血紅細胞懸液的濃度

7、不宜過高，否則細胞容易聚集，融合效果受影響。濃度可根據(jù)集體細胞情況調(diào)節(jié)。PEG的分子量應(yīng)為400-6000之間，PEG溶液濃度為40%-60%，融合時間為1-5分鐘。若超過以上三個條件，可能超過了細胞膜的自我修復(fù)限度，導(dǎo)致細胞膜破損，無法修復(fù)；若低于以上三個條件，可能細胞的破損程度較低，不能進行融合。2. 溶液的pH值：8.0-8.2，可采用緩沖液。溫度為：38-40。適當(dāng)?shù)靥岣邷囟瓤梢允辜毎诤系酶浞?，但溫度不能過高，以免細胞膜上的蛋白質(zhì)變性。3從試管中提取溶液時，最好使用注射器，不宜污染試管而且容易控制。4. 切記:加入PEG時，應(yīng)該先反應(yīng)后搖勻，否則會導(dǎo)致細胞融合不充分?！舅伎碱}】1.

8、 思考細胞融合的理論和實際意義（1） 理論：主要利用了質(zhì)膜的流動性和自動修復(fù)功能。（詳細理論見）（2） 實際意義：細胞融合不僅可用于基礎(chǔ)研究，而且還有重要的應(yīng)用價值，在植物育種方面已經(jīng)成功的有蘿卜+甘藍、粉藍煙草+郎氏煙草、番茄+馬鈴薯等等。細胞融合另一個重要應(yīng)用就是制備單克隆抗體，單克隆抗體可以用作診斷試劑，治療疾病和運載藥物，具有準確，高效，簡易，快速等優(yōu)點。【附】細胞融合技術(shù)的應(yīng)用一、動物細胞融合技術(shù)動物細胞融合是從細胞水平來改變動物細胞的遺傳性，用于生產(chǎn)單克隆抗體、疫苗等特定的生物制品。培育動物新品種，縮短動物的育種過程，動物細胞融合的應(yīng)用范圍已廣及生物學(xué)的各個分支學(xué)科，可別是在繪制人

9、類基因圖譜方面取得了顯著成就。雖然細胞雜交屬于理論生物學(xué)范疇，但是在實際應(yīng)用方面也有重大突破。在基礎(chǔ)理論研究上，動物細胞融合技術(shù)對于研究細胞分化、基因定位、腫瘤發(fā)生機制等方面都有重要意義。在實際應(yīng)用方面，動物細胞融合技術(shù)在藥物定向釋放系統(tǒng)、細胞治療以及抗腫瘤免疫等方面起到重要的作用。1. 用于生產(chǎn)單克隆抗體只針對某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細胞(myeloma cell)與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細胞融合得到雜交瘤細胞(hybridoma cell)，雜交瘤細胞既能像骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體

10、技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)。中科院上海細胞生物學(xué)研究所研制成功抗北京鴨紅細胞和淋巴細胞表面抗原的單克隆抗體，同時還與有關(guān)醫(yī)學(xué)部門合作，成功地制備了抗人肝癌和肺癌的單克隆抗體。2. 用于基因定位和繪制人類基因圖譜雜種細胞中某一染色體或其片段的存在與否與細胞的某一性狀表達與否相聯(lián)系，從而可以實現(xiàn)把基因定位于某一染色體或某一區(qū)段上。3. 用于動物育種體細胞核移植技術(shù)是將細胞核移植到另一細胞的細胞質(zhì)中的生物技術(shù)。動物體細胞融合后，雜種細胞難以發(fā)育再生為一個個體。但借助于細胞核移植的方法將融合后雜種細胞的細胞核移入去核成熟卵內(nèi)，可培育新的雜種。另外，細胞核移植技術(shù)的建立，還為目前進行的哺乳動物體細胞克隆和轉(zhuǎn)基

11、因技術(shù)做了良好的鋪墊。4. 用于細胞療法將患者的任何體細胞與去核卵細胞融合，融合子進行有絲分裂形成囊胚，囊胚的內(nèi)細胞團是多能干細胞，對多能干細胞進行誘導(dǎo)使其定向分化可形成所需的組織和器官用于器官移植，不僅解決了器官和組織來源問題，而且也避免宿主對外來物的免疫排斥。5. 動物體細胞融合在基礎(chǔ)理論研究方面的作用在這方面，細胞融合主要用于研究細胞核質(zhì)關(guān)系和個體發(fā)育，解釋疾病的發(fā)生機制和膜蛋白動力學(xué)研究。二、植物細胞融合技術(shù)植物細胞融合技術(shù)目前主要是作為擴大變異的手段，同時也朝著將抗藥性和胞質(zhì)雄性不育等細胞基質(zhì)基因?qū)肓硪粋€體細胞的方向發(fā)展，有可能形成新的核質(zhì)雜種。如果獲得了有用性狀的細胞系，在還不能

12、形成植株時，就可以通過快速大量繁殖細胞加以利用。1. 在生產(chǎn)研究方面植物細胞融合在育種上有重要的應(yīng)用價值，在生產(chǎn)研究應(yīng)用方面，通過誘導(dǎo)不同種屬間甚至不同科間原生質(zhì)體的融合，可能打破有性雜交不親和性的界限，廣泛地組合各種基因型，從而有可能形成有性雜交方法所無法獲得的新型雜交植株。2. 運用于外源遺傳物質(zhì)引入原生質(zhì)體植物細胞融合可以將細胞器、DNA、質(zhì)粒、病毒、細菌等外源遺傳物質(zhì)引入原生質(zhì)體，從而有可能引起細胞遺傳性的改變，為某些珍稀動物的復(fù)壯等提供了可行的方法，應(yīng)用于植物育種、種質(zhì)保存、無性系的快速繁殖和有用物質(zhì)生產(chǎn)等等。三、微生物細胞融合技術(shù)用于植物和微生物育種是細胞融合技術(shù)最基本的應(yīng)用領(lǐng)域，對微生物而言，該技術(shù)主要用于改良微生物菌種特性，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，使菌種獲得新的性狀，合成新產(chǎn)物等。1. 微生物細胞融合技術(shù)的對象在目前，微生物細胞融合的對