生物工程大實驗報告

1、生物工程大實驗30L發(fā)酵罐上黃原膠發(fā)酵實驗姓 名： 學(xué) 號： 學(xué) 院： 生命學(xué)院專 業(yè)： 生物工程年 級： 同組成員： 1. 材料和方法1.1菌株：HYJ1.2培養(yǎng)基1.2.1斜面培養(yǎng)基（100ml）葡萄糖 3.0；蛋白胨 0.5；酵母粉 0.3；氯化鈉 0.5；瓊脂 2.0；pH 7.0-7.3滅菌條件：115，20min；培養(yǎng)溫度：30；培養(yǎng)時間：24-48 h1.2.2種子培養(yǎng)基（100ml）葡萄糖 2.0；蛋白胨 0.5；酵母粉 0.1；牛肉膏 0.3 g；pH 7.0-7.3滅菌條件：115，20 min；培養(yǎng)溫度：30；培養(yǎng)時間：10-15 h1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基（100ml）葡萄

2、糖 3.0；蛋白胨 0.2；酵母粉 0.1；Na2HPO412H2O 0.252；KH2PO4 0.3；K2SO4 0.1；MgSO47H2O 0.1；pH 7.0-7.3滅菌條件：115，20 min；培養(yǎng)溫度：30；培養(yǎng)時間：48-62 h1.3. 培養(yǎng)條件1.3.1斜面培養(yǎng)1）配置400 ml的斜面培養(yǎng)基，分裝試管，于115下滅菌20 min，之后擺斜面，冷卻至室溫后，將凝固后的斜面放于30培養(yǎng)箱過夜。2）轉(zhuǎn)接斜面菌種，將轉(zhuǎn)接好的斜面菌放于30培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48 h。1.3.2一級種子培養(yǎng)1）配置種子培養(yǎng)基：按照種子培養(yǎng)基配方配制3000 ml，分別分裝到5000 ml和500 ml的

3、三角瓶中，裝液量分別為100 ml/500 ml三角瓶（用于一級種子培養(yǎng)）；1000 ml/5000 ml三角瓶（用于二級種子培養(yǎng)），于115下滅菌20 min。2）接種：將培養(yǎng)好的斜面菌種接種到一級種子培養(yǎng)基中（100 ml/500 ml三角瓶），接種量為每瓶2-3接種環(huán)，放在30搖床培養(yǎng)10-15 h，轉(zhuǎn)速為200 rpm。1.3.3二級種子培養(yǎng)將培養(yǎng)好的一級種子接種到二級種子培養(yǎng)基中（1000 ml/5000 ml三角瓶），接種量為10%（v/v），放在30搖床培養(yǎng)6-8 h，轉(zhuǎn)速為200 rpm。1.3.4發(fā)酵罐培養(yǎng)1）配置發(fā)酵培養(yǎng)基20 L，考慮到接入的種子液的體積（10%, 200

4、0 ml），所以培養(yǎng)基配置定容時為18 L。2）將培養(yǎng)好的二級種子接種到發(fā)酵罐中，接種量為10%（v/v），溫度30，發(fā)酵罐初始攪拌轉(zhuǎn)速約為100 rpm，通風(fēng)量1.5-2.0 vvm，初始pH為7.0-7.3，中間過程不控制pH。1.4 檢測方法1.4.1發(fā)酵液OD取一定體積的發(fā)酵液進行適當(dāng)稀釋，然后用分光光度計在620 nm波長下測定吸光度。1.4.2葡萄糖含量取一定發(fā)酵液進行適當(dāng)稀釋，8000 rpm/min 離心15 min，取上清，采用SBA檢測。1.4.3發(fā)酵液粘度發(fā)酵過程中取大約100 ml發(fā)酵液，用Blankspoon粘度計(DV-E，VISCOMETER)測定其粘度。1.4.

5、4黃原膠產(chǎn)量測定發(fā)酵結(jié)束后取10 ml發(fā)酵液，用3倍體積無水乙醇沉淀黃原膠， 8000 rpm/min 離心15 min，去上清，沉淀的黃原膠50通風(fēng)箱內(nèi)干燥至恒重，用分析天平稱重。1.4.5 pH值測定 用pH計測定發(fā)酵液的pH值。1.4.6菌體干重的測定取發(fā)酵液10 ml加入20 ml去離子水稀釋，放置在80水浴鍋中用1 mol/l NaOH調(diào)節(jié)pH10后，水浴15 min，然后再用1 mol/l HCl調(diào)節(jié)pH7.0，迅速12000 rpm離心20 min，去上清，留沉淀，于50通風(fēng)箱內(nèi)干燥至恒重（8-10 h）。1.4.7計劃取樣時間及待測參數(shù)：前24 h發(fā)酵過程中，每隔4 h取一次樣

6、測定pH、發(fā)酵液OD、黃源膠產(chǎn)量、菌體干重，葡萄糖含量、發(fā)酵液粘度。2. 結(jié)果與討論2.1實驗圖片其中A為斜面上菌的鏡檢圖B為二級種子鏡檢圖C為28.5h鏡檢圖D為70h鏡檢圖2.2 30L發(fā)酵罐上的發(fā)酵曲線a) 發(fā)酵曲線匯總b) 菌干重上圖為菌干重數(shù)據(jù)以及擬合曲線（OD實際也是反映菌體濃度，因此在此不做討論），可以看出實際的數(shù)據(jù)與擬合曲線擬合的并不是很好。而且我們由于接種量比較大，為15%的接種量，且經(jīng)過二級種子的培養(yǎng)也沒有延遲期，故最大生長速率應(yīng)該在20h左右，但由于發(fā)酵液后期產(chǎn)膠過大，粘度過大，而我們分離菌的方法比較簡單原始，故后期很難將菌從發(fā)酵液中分離下來，故后期所測的菌的干重實際是菌

7、和部分膠的重量，后期數(shù)據(jù)不準(zhǔn)因而導(dǎo)致實驗結(jié)果誤差較大。c) 膠干重曲線其中A為原始數(shù)據(jù)作圖，B為刪掉0小時數(shù)據(jù)作圖在0h我們?nèi)訒r可能未等發(fā)酵液混勻后便取，因而測得的膠干重數(shù)據(jù)異常，可以看出A圖數(shù)據(jù)擬合的并不是很好，在B圖中我將0h膠干重設(shè)為0，可以看出擬合度大大提高。從數(shù)據(jù)來看，膠干重測量還是不錯的，當(dāng)然由于提取膠的方法比較簡單，會有部分菌帶到膠中，這也是不可避免的誤差。可以看出在15小時左右時膠的產(chǎn)生速率最大，而到30小時左右時膠的產(chǎn)生速率有所下降并在逐漸降低，這與底物的消耗、溶氧的降低等因素有關(guān)。d) 殘?zhí)乔€從圖中可以看出所測的數(shù)據(jù)與擬合直線擬合的較好，這證明實際的操作比較規(guī)范。從一開

8、始糖的消耗來看，消耗量較小，原因可能是菌種有延遲期；但從8h開始，糖的消耗量迅速增加，到30h左右殘?zhí)橇恳呀?jīng)到了一個較低的值，這證明在這段時間內(nèi)菌體大量繁殖消耗了糖分。到發(fā)酵后期，發(fā)酵液中溶氧量和菌對糖的消耗量處在一個很低的水平，此時菌體進入衰退期。e) 溶氧曲線在最初的4個小時內(nèi)通風(fēng)量變化不大，轉(zhuǎn)速也較低的情況下氧變化比較小，因為此時菌體處于適應(yīng)期，沒有大量繁殖，消耗的氧氣不多。在對數(shù)生長的初期，比耗氧速率達到最大值，但此時細(xì)胞濃度還很低，攝氧率并不高。隨著細(xì)胞濃度的迅速增高，培養(yǎng)液的攝氧率也迅速增高，并在對數(shù)生長的后期達到峰值。于是表現(xiàn)為發(fā)酵液中溶氧迅速降低，最后低至負(fù)值。由于接種量為15

9、%，比一般接種量偏大，所以菌體生長及產(chǎn)生速度也偏快，因此在最初的10h內(nèi)溶解氧就降到了一個很低的水平。之后由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，以及培養(yǎng)裝置氧傳遞能力的限制，到對數(shù)生長階段結(jié)束，溶氧已經(jīng)降到了一個極低的水平，雖然細(xì)胞濃度可能還會有所增加，但溶解氧量也不會再升高。此后，由于本實驗菌種產(chǎn)生的黃原膠分子量較大，粘度較大，因此即使再加大通風(fēng)量提高轉(zhuǎn)速，發(fā)酵液的溶氧量也不會再增加。f) 粘度曲線本次實驗統(tǒng)一使用S4轉(zhuǎn)子進行粘度的測量，可以看出前8個小時并未測出發(fā)酵液的粘度，但從測得的膠干重來看，此時應(yīng)該會有一定的粘度，可能由于轉(zhuǎn)子測量范圍有限，因此并未測出一定的數(shù)值?？梢钥闯鲈?0h左右粘度開始迅

10、速增加，此時菌體數(shù)量已達到一個比較穩(wěn)定數(shù)值，開始大量產(chǎn)生黃原膠，所以隨著產(chǎn)膠量的不斷增加，發(fā)酵液的粘度在不斷變大。在后期隨著營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡以及代謝產(chǎn)物不斷增多，菌體數(shù)量也會逐漸減少，因此產(chǎn)膠能力也下降，所以雖然粘度仍不斷增加，但其增長速率已經(jīng)大大下降，最后會達到一個峰值。g) pH曲線從最上方匯總的發(fā)酵曲線中可以看出，隨著發(fā)酵過程的進行，發(fā)酵液的pH有下降的趨勢。在生產(chǎn)階段，一般發(fā)酵液的pH趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定在最適合產(chǎn)物生成的pH范圍。2.2 菌體比生長速率2.3 產(chǎn)物比生成速率2.4 底物比消耗速率3、實驗總結(jié)通過本次實驗，我系統(tǒng)學(xué)習(xí)了微生物發(fā)酵的全過程，包括發(fā)酵過程中各個環(huán)節(jié)的基礎(chǔ)理論，如菌

11、種培養(yǎng)及種子的擴大培養(yǎng)、發(fā)酵過程控制、發(fā)酵動力學(xué)等。了解了發(fā)酵設(shè)備的種類及結(jié)構(gòu)。學(xué)習(xí)實驗室階段發(fā)酵方法及如何進行工藝放大。由于我們組做這個實驗總共做了兩遍，因此對發(fā)酵罐已經(jīng)比較了解。整體來說兩次實驗都比較順利。但最后測量菌體干重時可能由于操作不規(guī)范（我認(rèn)為是我們在調(diào)節(jié)pH時沒有很好的把握好應(yīng)該加多少酸堿量，所以每個管加的量都不大一樣）以及本次實驗固有的誤差的影響，菌干重的測量數(shù)據(jù)不夠好。 在寫實驗報告的過程中我感覺我確確實實學(xué)到了很多，通過與老師和同學(xué)的溝通交流中，我現(xiàn)在已經(jīng)比較熟練的用Origin作圖，這是我最大的收獲。4、致謝附件：發(fā)酵實驗原始數(shù)據(jù)黃原膠發(fā)酵實驗數(shù)據(jù)記錄表發(fā)酵時間（h）粘度

12、（cP）膠干重（g/l）葡萄糖（g/l）發(fā)酵OD620菌體干重g/l）溫度溶氧（%）轉(zhuǎn)速（rpm）通風(fēng)量vvmpH003.66261.120.6635.240.81501.66.7403.0025.53.90.3634.720.02501.756.7804.1723.58.072.7834.637.23501.76.7128.75.831711.345.0635.111.53502.156.7161697.911411.886.9534.7-14.44002.26.5204868.6612118.2335.0-17.74002.36.5243608.961017.7810.8535.1-17.44002.06.529.59309.4782113.2435.4-17.64002.46.338.5270010.03716.6543.6735.6-17.34002.46.342.5357010.1