大腸癌中MTA1和HIF1α的表達(dá)與淋巴管生成的關(guān)系

1、大腸癌中MTA1和HIF-1的表達(dá)與淋巴管生成的關(guān)系 作者：楊珍玉 周序瓏 夏明汗 蔣光喻 鐘雪云 杜彬【摘要】 【目的】 探討大腸癌中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MTA1)、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)蛋白的表達(dá)及其與淋巴管生成的關(guān)系。【方法】 用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)81例大腸癌中MTA1、HIF-1蛋白的表達(dá)及D2-40標(biāo)記的淋巴管密度。【結(jié)果】 81例大腸癌中MTA1、HIF-1陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.7%和63%，MTA1和HIF-1的表達(dá)均與大腸癌Duke?蒺s分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P < 0.05)而與組織學(xué)分級(jí)和浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P > 0.05)，大腸癌中MTA1

2、和HIF-1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(P < 0.05)，MTA1和HIF-1蛋白過(guò)表達(dá)病例腫瘤旁淋巴管密度分別為18.4 ± 4.9、18.0 ± 5.3，高于MTA1和HIF-1不表達(dá)和弱表達(dá)病例(15.6 ± 4.5、15.4 ± 4.2)，兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。【結(jié)論】 MTA1和HIF-1蛋白的過(guò)表達(dá)可能促進(jìn)了大腸癌旁淋巴管的生成，在腫瘤淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移中起一定作用。 【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸癌; MTA1; HIF-1; 淋巴管密度Abstract： 【Objective】 To investigate the

3、 expression of metastasis-associated gene 1 (MTA1)， hypoxia inducible-factor l alpha (HIF-1) in human colorectal cancer and to explore the relationship between their expression and lymphangiogenesis. 【Methods】 The expression of MTA1 and HIF-1， and D2-40 marked lymphatic vessel density (LVD) were det

4、ected by immunohistochemical staining in eighty-one human colorectal cancer cases. 【Results】 The positive rates of MTA1 and HIF-1 expression were 66.7% and 63.0 % respectively in the eighty-one human colorectal cancer cases. The expression of MTA1 and HIF-1 were both correlate with Dukes stage and l

5、ymph node metastasis (P < 0.05) but did not correlate with the pathological grade and depth of invasion (P > 0.05). In addition， MTA1 and HIF-1 expression has a positive correlation in human colorectal cancer (P < 0.05). In MTA1 and HIF-1 over-expression cases， the peritumoral L

6、VD was 18.4 ± 4.9 and 18.0 ± 5.3 respectively and was higher than that of the MTA1 and HIF-1 expression none or weak cases (15.6 ± 4.5， 15.4 ± 4.2)， the difference has statistically significance (P < 0.05). 【Conclusion】 The overexpression of MTA1 and HIF-1 in colorectal ca

7、ncer possibly promote the cancer lymphangiogenesis and play a role in lymph node metastasis.淋巴道轉(zhuǎn)移是大腸癌轉(zhuǎn)移的重要途徑，而淋巴管的生成則是促進(jìn)大腸癌淋巴道轉(zhuǎn)移的主要因素。MTA1(metastasis-associated gene 1)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的癌基因，MTA1可促進(jìn)大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移，但其與淋巴管生成的關(guān)系尚不明確1。HIF-1是一種腫瘤細(xì)胞缺氧條件下誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子，已有研究表明HIF-1與乳腺癌、胰腺癌的淋巴管生成相關(guān)2-3。特別值得注意的是，MTA1可直接影響HI

8、F-1蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性來(lái)促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移4，那么大腸癌中MTA1和HIF-1的表達(dá)是否有相關(guān)性及其與淋巴管生成的關(guān)系值得進(jìn)一步深入研究。本研究用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)81例大腸癌切除腫瘤組織中MTA1和HIF-1的表達(dá)及用淋巴管特異性標(biāo)記物D2-405標(biāo)記的腫瘤淋巴管密度，探討大腸癌中MTA1和HIF-1的表達(dá)與淋巴管生成的關(guān)系。1 材料與方法1.1 臨床資料收集暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院2007年9月至2008年12月81例大腸癌手術(shù)切除標(biāo)本。其中男性患者45例，女性患者36例，年齡從21歲到93歲，平均年齡61.2歲。81例大腸癌中，高中分化癌59例，低分化癌19例，另外3例粘液腺癌并為低

9、分化癌，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例，其中一例有肝轉(zhuǎn)移，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例?；颊咴谑中g(shù)前均未接受過(guò)放化療。所有標(biāo)本經(jīng)100 mL/L甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 m厚連續(xù)切片，分別做常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)染色。1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑鼠抗人MTA1單克隆抗體、鼠抗人D2-40單克隆抗體和兔抗人HIF-1多克隆抗體分別購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司和武漢博士德生物工程公司。羊抗鼠和羊抗兔SP試劑盒購(gòu)自福州邁新技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，DAB顯色液購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)公司。1.3 免疫組織化學(xué)染色染色方法按照鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(SP)法試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。用已知陽(yáng)性表達(dá)的癌組

10、織做陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。組織均用pH 6.0的檸檬酸修復(fù)液微波修復(fù)抗原處理。鼠抗人MTA1單克隆抗體經(jīng)1：50稀釋后用于實(shí)驗(yàn)，其它兩種抗體均為即用型工作液。1.4 結(jié)果判定1.4.1 MTA1和HIF-1陽(yáng)性判定MTA1和HIF-1均為細(xì)胞漿或核表達(dá)。胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。判定標(biāo)準(zhǔn)綜合染色強(qiáng)度和著色細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分級(jí)：著色略高于背景和著色細(xì)胞數(shù) > 10%為陽(yáng)性;細(xì)胞數(shù) < 25%，著色較弱為弱陽(yáng)性;細(xì)胞數(shù)為25% 50%，著色較強(qiáng)為中度陽(yáng)性;細(xì)胞數(shù) > 50%，著色強(qiáng)為強(qiáng)陽(yáng)性。其中，中度和強(qiáng)陽(yáng)性為過(guò)表達(dá)。1.4.2 淋巴管計(jì)

11、數(shù)方法參照Vermeulen等6-7所用方法，先在40倍視野下尋找淋巴管密度最多的區(qū)域，再在200倍視野下計(jì)數(shù)D2-40陽(yáng)性的淋巴管個(gè)數(shù)。取3個(gè)視野淋巴管的平均值即為所計(jì)淋巴管密度。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，率進(jìn)行2檢驗(yàn)，淋巴管密度的比較用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman檢驗(yàn)， P < 0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 MTA1和HIF-1的表達(dá)和臨床病理指標(biāo)的關(guān)系MTA1和HIF-1的陽(yáng)性表達(dá)均以胞漿為主，僅很少量核表達(dá)(圖1A，B)。MTA1表達(dá)陽(yáng)性率為66.7%，其中中度和強(qiáng)陽(yáng)性病例有23例，弱陽(yáng)性有31例，陰性有27例;HIF-1陽(yáng)性

12、率為63%，中度和強(qiáng)陽(yáng)性有28例，弱陽(yáng)性有23例，陰性有30例。MTA1和HIF-1的陽(yáng)性表達(dá)均與分化程度無(wú)關(guān)(2 = 1.529，P > 0.05; 2 = 0.353， P > 0.05)，與浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(2 = 0.368， P > 0.05; 2 = 0.732，P > 0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Duke?蒺s分期相關(guān)(2 = 4.173，P < 0.05;2 = 4.910，P < 0.05，表1)。2.2 MTA1和HIF-1表達(dá)的相關(guān)性MTA1陽(yáng)性的54例大腸癌中，HIF-1陽(yáng)性率為72.2%(

13、39/54);MTA1陰性的27例中，HIF-1陽(yáng)性率為44.4%(12/27)。MTA1和HIF-1的表達(dá)存在正相關(guān)性(rs = 0.271，P < 0.05，表2)。2.3 淋巴管的觀察淋巴管被染成棕黃色，腫瘤旁比較明顯，大多都呈擴(kuò)張狀態(tài)，管腔不規(guī)則，管壁很薄，為扁平的內(nèi)皮細(xì)胞所圍成，不見(jiàn)肌層(圖1C)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，腫瘤旁淋巴管密度為18.1 ± 5.3，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，腫瘤旁淋巴管密度為15.2 ± 3.9。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例腫瘤旁淋巴管密度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t = 2.508，P < 0.05)。2.4 M

14、TA1和HIF-1的表達(dá)與腫瘤旁淋巴管密度的關(guān)系MTA1中度和強(qiáng)陽(yáng)性的病例腫瘤旁淋巴管密度為18.4 ± 4.9，MTA1陰性和弱陽(yáng)性的病例腫瘤旁淋巴管密度為15.6 ± 4.5，低于MTA1過(guò)表達(dá)的病例， 兩者腫瘤旁淋巴管密度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t = 2.183，P < 0.05);同樣HIF-1中度和強(qiáng)陽(yáng)性的病例腫瘤旁淋巴管密度(18.0 ± 5.3)高于HIF-1弱和不表達(dá)病例(15.4 ± 4.2)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t = 2.230，P < 0.05，圖2)。3 討 論3.1 MTA1及HIF-1與大腸癌淋巴管

15、生成的關(guān)系淋巴道轉(zhuǎn)移是大腸癌等上皮性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要方式，淋巴管生成則是腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。引起淋巴管生成的分子機(jī)制尚未明了，MTA1和HIF-1可能都是影響淋巴管生成的因素。目前已明確，MTA1是促進(jìn)大腸癌等多種腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子。Toh等1人和本研究組前期研究8分別從mRNA與蛋白質(zhì)水平證實(shí)，大腸癌組織中MTA1過(guò)度表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性率顯著相關(guān)。本研究的結(jié)果顯示MTA1過(guò)表達(dá)時(shí)大腸癌旁淋巴管密度LVD增加，則進(jìn)一步提示MTA1可能通過(guò)影響淋巴管生成來(lái)促進(jìn)大腸癌淋巴道轉(zhuǎn)移。HIF-1是缺氧狀態(tài)引起腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子。正常氧條件下，HIF-1易被泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解。缺氧時(shí)，HI

16、F-1降解受阻，蛋白量增多，HIF-1與靶基因中的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合啟動(dòng)了靶基因的轉(zhuǎn)錄9。HIF-1可通過(guò)調(diào)控這些靶基因來(lái)影響腫瘤淋巴管的生成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移 。Katsuta等10在食管癌組織中用免疫組織化學(xué)的方法證明：HIF-1的表達(dá)能促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-C的表達(dá)，且HIF-1的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)淋巴管有關(guān)，提示HIF-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF-C的表達(dá)在腫瘤淋巴管的轉(zhuǎn)移中起一定的作用。Schoppmann等2也用同樣的方法在乳腺癌組織中研究認(rèn)為HIF-1與VEGF-C的表達(dá)和淋巴管的生成有關(guān)。另外在胰腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤中也有報(bào)道HIF-1能促進(jìn)淋巴管生成3，11。我

17、們研究也發(fā)現(xiàn)HIF-1過(guò)表達(dá)增加大腸癌旁淋巴管密度LVD，可見(jiàn)HIF-1可通過(guò)促進(jìn)腫瘤淋巴管的生成而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。3.2 大腸癌中MTA1和HIF-1表達(dá)的相關(guān)性關(guān)于MTA1和HIF-1的相關(guān)性目前研究尚不多見(jiàn)。MTA1可參與組成NuRD復(fù)合物，與HDAC1、HDAC2相互作用使組蛋白去乙酰基、核小體重塑從而抑制基因的表達(dá)12。最近有報(bào)道HDAC1/MTA1復(fù)合物能使HIF-1去乙?；€(wěn)定，同時(shí)也增強(qiáng)了HIF-1轉(zhuǎn)錄活性而使血管生成增加，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供了有利條件13。朱曉霞等14報(bào)道在肺癌組織中MTA1的表達(dá)與HIF-1的表達(dá)有顯著相關(guān)性。我們研究發(fā)現(xiàn)大腸癌中MTA1和HI

18、F-1的表達(dá)呈正相關(guān)，且促進(jìn)了大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這再次提示MTA1可能通過(guò)穩(wěn)定HIF-1蛋白促進(jìn)了大腸癌轉(zhuǎn)移。特別是，我們還發(fā)現(xiàn)MTA1過(guò)表達(dá)的病例，大腸癌旁淋巴管密度增多，提示MTA1可能通過(guò)HIF-1的表達(dá)誘導(dǎo)淋巴管生成。綜上所述，MTA1和HIF-1的過(guò)表達(dá)與大腸癌淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，兩者都是判斷大腸癌預(yù)后的重要指標(biāo)。而且MTA1很可能通過(guò)穩(wěn)定HIF-1蛋白來(lái)促進(jìn)大腸癌旁淋巴管的生成，從而有利于大腸癌轉(zhuǎn)移。【參考文獻(xiàn)】 Toh Y， Oki E， Oda S， et al. Overexpression of the MTA1 gene in gastrointestinal carci

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