宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織Smad4表達(dá)及臨床意義

1、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織Smad4表達(dá)及臨床意義 作者：江忠清, 連成瑛, 林岷, 陳林鶯, 張彬, 吳桂珠, 曾賽凡 【摘要】 目的 探討宮頸鱗狀細(xì)胞癌（SCC）組織Smad4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。 方法 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)28例正常宮頸上皮(NCE)、36例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和68例SCC組織中Smad4的表達(dá)情況,檢測(cè)Ki-67增殖指數(shù)(PI)和CD34微血管密度(MVD)。 結(jié)果 Smad4在NCE，CIN及SCC組的陽性表達(dá)率分別為75.00%,41.67%和45.59%。從NCE到CIN及SCC,Smad4陽性表達(dá)率顯著降低(P<0.05)。在SCC組,隨

2、Smad4表達(dá)降低,盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著升高(2=4.446,P=0.035);隨Smad4表達(dá)增強(qiáng),PI和MVD均有升高趨勢(shì),均未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SCC組Smad4表達(dá)與年齡、FIGO分期、組織學(xué)分級(jí)、浸潤(rùn)深度、脈管浸潤(rùn)與否及預(yù)后無顯著相關(guān)性(P>0.05)。 結(jié)論 Smad4蛋白表達(dá)降低可能參與SCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程。 【關(guān)鍵詞】 宮頸腫瘤; 基因,腫瘤抑制; 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子; 腫瘤轉(zhuǎn)移; 預(yù)后; 免疫組織化學(xué) ABSTRACT: Objective To investigate expression of Smad4 and their corre

3、lation with clinic-pathologic characteristics in cervical squamous cell carcinoma. Methods The expression of Smad4, proliferation index(PI) of cancer cells labeled by Ki-67 and microvessel density(MVD) labeled by CD34 in 28 cases of normal cervical epithelium(NCE), 36 cases of cervical intraepitheli

4、al neoplasm(CIN) and 68 cases of squamous carcinoma of cervix(SCC) were detected by immunohistochemistry SP method. Results The positive rates of expression of Smad4 in NCE, CIN and SCC group were 75.00%, 41.67% and 45.59%, respectively. The positive expression of Smad4 decreased remarkably from a s

5、equence of NCE to CIN and SCC(P<0.05). The rate of pelvic lymph node metastasis in SCC was significantly increased following Smad4 lower expression(2=4.446, P=0.035). The PI and MVD in SCC were increased following Smad4 higher expression, but it was not significant(P>0.05). The express

6、ion of Smad4 in SCC was not correlated with patients age, FIGO staging, histological grading, stroma involvement, intravascular infiltration or prognosis(P>0.05). Conclusion The loss expression of Smad4 protein may participate in pathogenesis and metastasis in cervical squamous cell carcinoma

7、. KEY WORDS: cervical neoplasm; genes,tumor suppressor; transforming growth factor beta; neoplasm metastasis; prognosis; immunohistochemistry 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-,TGF-)控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、胚胎發(fā)育,激活細(xì)胞膜上的型受體(TGF-R),再激活Smad家族蛋白而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá),在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用1。在Smad家族中,DPC4(deleted in pancreatic cancer,l

8、ocus 4)/Smad4與腫瘤的關(guān)系尤為密切1。有報(bào)道宮頸癌中Smad4表達(dá)缺失2-3。筆者采用免疫組織化學(xué)(SP法)檢測(cè)Smad4在宮頸鱗狀細(xì)胞癌（SCC）組織的表達(dá)情況,探討其表達(dá)與局部腫瘤血管生成、癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。1 對(duì)象與方法1.1 對(duì)象臨床資料見文獻(xiàn)4。1.2 試劑鼠抗人Smad4單克隆抗體(產(chǎn)品編號(hào)BA1397,武漢博士德生物工程有限公司),鼠抗人Ki-67單克隆抗體(克隆號(hào)MIB1)、鼠抗人CD34單克隆抗體(克隆號(hào)QBEnd/10)、超敏免疫組織化學(xué)染色試劑盒和DAB染色劑(福州邁新生物技術(shù)有限公司)。1.3 方法所有新鮮標(biāo)本均經(jīng)4甲醛溶液固定,48 h內(nèi)取

9、材,石蠟包埋,連續(xù)35 m切片。采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)CIN和SCC組織中Smad4的表達(dá)情況。步驟按說明書操作。Smad4采用EDTA(pH 9.0)水煮高溫修復(fù)抗原DAB顯色,蘇木精對(duì)比染色。用已知陽性片作為陽性對(duì)照,用PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照。1.4 結(jié)果判斷Smad4主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),部分表達(dá)于細(xì)胞核。Smad4表達(dá)根據(jù)文獻(xiàn)5的標(biāo)準(zhǔn)判定:彌漫陽性():細(xì)胞質(zhì)中染色深且比較一致,細(xì)胞核中有灶狀染色;局灶陽性(+):部分區(qū)域細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核陽性;陰性():細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核均無棕黃色顆粒。在光鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野(×400),每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞,計(jì)算總陽性

10、標(biāo)記細(xì)胞數(shù)。Ki-67標(biāo)記的增殖指數(shù)(PI):CD34標(biāo)記的微血管密度（MVD）見文獻(xiàn)4。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包分析,半定量資料比較采用2檢驗(yàn)或精確概率法檢驗(yàn),定量資料比較采用t檢驗(yàn),變量間的關(guān)系采用相關(guān)分析,生存情況采用Kaplan-Meier曲線表示,Log rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05,以P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 Smad4在NCE，CIN及SCC組的表達(dá)從NCECINSCC,Smad4表達(dá)顯著降低(P<0.01,表1)。Smad4在CIN，的陽性表達(dá)率分別為41.67%(5/12),54.55%(6/1

11、1)及30.77%(4/13),各組之間比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Smad4在NCE，CIN及SCC組的表達(dá)見圖1。表1 NCE、CIN及SCC組Smad4的表達(dá)（略）2.2 Smad4在NCE，CIN及SCC組的表達(dá)與PI的關(guān)系在NCE中,Ki-67標(biāo)記的PI隨Smad4表達(dá)增強(qiáng)而顯著升高(P<0.05)。相關(guān)分析顯示,Smad4在NCE中表達(dá)與PI顯著正相關(guān)(r=0.469,P=0.012)。Smad4在CIN和SCC中表達(dá)與PI均無顯著相關(guān)性(前者r=0.061,P=0.726;后者r=0.077,P=0.534,表2)。表2 NCE，CIN及SC

12、C組Smad4表達(dá)與PI及MVD的關(guān)系（略）2.3 Smad4在NCE，CIN及SCC組的表達(dá)與MVD的關(guān)系Smad4在NCE，CIN及SCC組中表達(dá)與CD34標(biāo)記的MVD均無顯著相關(guān)性(NCE:r=0.106,P=0.591;CIN:r=-0.281,P=0.102;SCC:r=0.197,P=0.107,表2)。2.4 Smad4 在SCC組的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Smad4在SCC組的表達(dá)與盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(2=4.446,P=0.035),而與年齡、FIGO分期、組織學(xué)分級(jí)、間質(zhì)浸潤(rùn)深度及脈管浸潤(rùn)無關(guān)(P>0.05,表3)。表3 宮頸鱗狀細(xì)胞癌組Smad4的表達(dá)與

13、臨床病理特征的關(guān)系（略）2.5 Smad4在SCC組的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系將Smad4在SCC組的表達(dá)分為陰性和陽性組,兩組Kaplan-Meier生存曲線見圖2。兩組患者的生存率比較差別無顯著性,Log rank檢驗(yàn),P=0.379。3 討 論 有報(bào)道,Smad4表達(dá)降低或缺失參與宮頸上皮癌變2-3。本研究顯示,Smad4在NCE、CIN及SCC中的陽性表達(dá)率分別為75.00%,41.67%及45.59%。Smad4在NCE組表達(dá)與CIN及SCC組比較,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),Smad4蛋白在CIN和SCC組表達(dá)顯著降低,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。1996年,Hahn等發(fā)現(xiàn)并克隆出

14、抑癌基因DPC4/Smad46。DPC4/Smad4基因位于人染色體18q21.1,cDNA全長(zhǎng)1 656 bp,編碼552個(gè)氨基酸序列,編碼產(chǎn)物為64 kD蛋白質(zhì)Smad4。TGF-從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需要Smads蛋白介導(dǎo)。TGF-與其受體結(jié)合后,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與受體調(diào)節(jié)型Smad結(jié)合,后者與Smad4形成三聚體,進(jìn)入細(xì)胞核與特異的DNA結(jié)合,抑制細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)蛋白CDK4-CyclinD以及下游CDK2-CyclinE復(fù)合體活性,阻礙細(xì)胞從G1向S期轉(zhuǎn)化,抑制細(xì)胞增殖7。Smad4是TGF-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信使,其在TGF-誘導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控和隨后的生長(zhǎng)抑制中是必不可少的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子8。T

15、GF-信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的任一因子失活均可導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)途徑中斷,而在該通路中最常改變的是DPC4/Smad49。Smad4突變使其與途徑限制性Smads不能形成復(fù)合物,不能進(jìn)入細(xì)胞核,從而使TGF-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中斷,細(xì)胞逃脫TGF-的生長(zhǎng)抑制作用而失控,誘發(fā)癌癥。筆者認(rèn)為,在CIN和SCC組Smad4表達(dá)降低可使TGF-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱或中斷而不能介導(dǎo)TGF-的生長(zhǎng)抑制效應(yīng),使細(xì)胞生長(zhǎng)失控而誘發(fā)CIN及癌變。 劉景波等報(bào)道,前列腺增生組織Smad4蛋白及mRNA表達(dá)顯著增高,并與PI顯著正相關(guān),Smad4可能促進(jìn)細(xì)胞增殖而參與前列腺增生,Smad4雖為一種腫瘤抑制基因,但可能具有促進(jìn)增殖作用10。本研究顯

16、示,Smad4在NCE中表達(dá)與PI顯著正相關(guān),隨Smad4表達(dá)增強(qiáng),PI顯著增加,提示Smad4表達(dá)增強(qiáng)也可能促進(jìn)宮頸上皮細(xì)胞增殖瘤變。Smad4基因突變與癌癥進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),往往提示預(yù)后不良11。吳慧麗等報(bào)道,Smad4低表達(dá)與結(jié)腸癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及MVD密切相關(guān),提示Smad4低表達(dá)可增加腫瘤血管生成12。筆者研究顯示,在SCC中,隨Smad4表達(dá)降低,盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著升高,隨Smad4表達(dá)增強(qiáng),PI和MVD均有升高趨勢(shì),但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。筆者認(rèn)為,SCC組織Smad4表達(dá)降低可能使癌細(xì)胞逃脫TGF-的生長(zhǎng)抑制作用而促進(jìn)增殖,同時(shí)也可能增加腫

17、瘤血管生成為癌細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)而加速轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果還顯示,Smad4在SCC組表達(dá)與年齡、FIGO分期、組織學(xué)分級(jí)、間質(zhì)浸潤(rùn)深度及脈管浸潤(rùn)均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。 胃癌Smad4陽性表達(dá)者腫瘤細(xì)胞分化好,生長(zhǎng)速度慢,侵襲和轉(zhuǎn)移能力弱,預(yù)后較好13。在本研究中,將Smad4在SCC組表達(dá)分為陰性和陽性組,描繪兩組患者Kaplan-Meier生存曲線,陰性組生存率與陽性組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Smad4表達(dá)與SCC預(yù)后關(guān)系的研究剛剛開始,可能有不同結(jié)果,有待深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Moustakas A,Souchelnytskyi S,Heldin C H. Smad regu

18、lation in TGF- signal transductionJ. J Cell Science, 2001,114(Pt24):4359-4369.2Baldus S E,Schwarz E,Lohrey C,et al. Smad4 deficiency in cervical carcinoma cellsJ. Oncogene, 2005,24(5):810-819.3Maliekal T T,Antony M L,Nair A,et al. Loss of expression,and mutation of Smad 2 and Smad 4 in human cervica

19、l cancerJ. Oncogene, 2003,22(31):4889-4897.4林 岷，江忠清，連成瑛，等. 宮頸鱗狀細(xì)胞癌局部淋巴管生成與浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系J. 福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008,42（2）：116-120.5Wilentz R E,Su G H,Dai J L,et al. Immunohistochemical labeling for dpc4 mirrors genetic status in pancreatic adenocarcinomas:a new marker of DPC4 inactivation J. Am J Pathol, 2000,156

20、(1):37-43.6Hahn S A,Schutte M,Hoque A T,et al. DPC4,a candidate tumor suppressor gene at human chromosome 18q21.1J. Science, 1996,271(5247):350-353.7Kjellman C,Olofsson S P,Hansson O,et al. Expression of TGF-beta isoforms,TGF-beta receptors,and Smad molecules at different stages of human gliomaJ. Int J Cancer, 2000,89(3):251-258.8