選擇性環(huán)氧合酶-抑制劑尼美舒利對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑尼美舒利對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響姓名：沈亦斌申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：外科學(xué)（胃腸外科）指導(dǎo)教師：于吉人20060401浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文選擇性環(huán)氧合酶一抑制劑尼美舒利對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院級(jí)七年制導(dǎo)師胃腸外科沈亦斌于吉人中文摘要近來研究表明在胃癌組織和癌前病變的腺瘤或增生性組織中，均發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶一（一）的高表達(dá)。體外研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧化酶抑制劑能抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，改變胃癌細(xì)胞周期，從而誘導(dǎo)其調(diào)亡。尼美舒利（），是新型的非甾體抗炎藥，化學(xué)名為一硝基一一苯氧基甲磺酰苯胺，是一種選擇性一抑制劑。本研究觀察選擇性環(huán)氧合酶一（一）抑制劑尼美舒利對(duì)人胃癌

2、細(xì)胞株一增殖的影響，并探討其可能的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞一，在不同的時(shí)間（，）予以不同劑量（，“）的尼美舒利，采用啪汀比色法測(cè)試細(xì)胞活性，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分析胃癌細(xì)胞周期變化及凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同劑量（，幾）的尼美舒利對(duì)人胃癌細(xì)胞株一的增殖均有抑制作用。的尼美舒利抑制率最浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文低，作用不同時(shí)間（，）后的抑制率分別是：、：弘兒的尼美舒利抑制率最高，作用不同時(shí)間（，）后的抑制率分別是：、。同時(shí)尼美舒利改變了胃癌細(xì)胞一的細(xì)胞周期分布，不同濃度尼美舒利（，“幾）作用小時(shí)后，期細(xì)胞所占比例分別是：、。流式圖譜顯示胃癌細(xì)胞一經(jīng)、斗扎的尼美舒利作用后出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡峰，調(diào)亡

3、率分別為：、。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：尼美舒利能顯著抑制人胃癌細(xì)胞株一的增殖，其可能楓制與誘導(dǎo)細(xì)胞攝亡阻止細(xì)胞周期進(jìn)展有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】：尼美舒利；胃癌細(xì)胞株；凋亡浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文選擇性環(huán)氧合酶一抑制劑尼美舒利對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院級(jí)七年制導(dǎo)師胃腸外科沈亦斌于吉人序言流行病學(xué)資料顯示：在很多胃癌組織中環(huán)氧合酶一（一，一）呈高表達(dá)狀態(tài)，與胃癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系?！?。長(zhǎng)期服用一抑制劑可降低胃癌的發(fā)病危險(xiǎn)性，具有一定的化學(xué)預(yù)防作用嗍。近年來，選擇性環(huán)氧化酶一抑制劑的抗腫瘤作用日益引起重視。尼美舒利是一種人工合成的環(huán)氧化酶一特異性抑制劑，為磺酰胺類消炎鎮(zhèn)痛藥，能抑制炎癥組織內(nèi)前列腺素的合

4、成，而不抑制胃黏膜內(nèi)前列腺索的合成，因而能緩解炎癥癥狀，對(duì)胃及十二指腸等的不良反應(yīng)則較輕【】。本研究通過、流式細(xì)胞儀、電鏡等檢查，觀察體外尼美舒利對(duì)人胃癌細(xì)胞株一的作用，并探討其可能的作用機(jī)制，為臨床上開辟新的抗癌途徑提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文材料和方法主要試劑、尼美舒利（公司），培養(yǎng)基、胰蛋白酶（公司）、小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）。主要儀器：恒溫。培養(yǎng)箱（美國公司）倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）；透射電鏡（日立型）；流式細(xì)胞儀（，美國公司）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（國營華東電子管廠）一冰箱購于美國衄 塒公司。細(xì)胞培養(yǎng)：人胃癌細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞以培養(yǎng)基，加入小牛

5、血清和 青霉素及血鏈霉素，于、孵箱內(nèi)培養(yǎng)，天傳代一次。法檢測(cè)尼美舒利對(duì)細(xì)胞抑制率的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以每孑×個(gè)細(xì)胞接種于孔板。培養(yǎng)后分別加入不同濃度的尼美舒利（，¨兒），每種濃度設(shè)個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)、后，每孔分別加人（咖），繼續(xù)孵育后棄上清，加入二甲基亞砜（）¨，振蕩分鐘，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)處的吸光值（塒 時(shí)，值）。浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文結(jié)果倒置顯微鏡觀察尼美舒利作用后，胃腺癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化透射電鏡檢測(cè)可見未加藥的對(duì)照組細(xì)胞核仁清楚，細(xì)胞外布滿絲狀微絨毛，經(jīng)尼美舒利處理后，不貼壁的細(xì)胞數(shù)增多，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變小、變圓、細(xì)胞器腫脹、染色質(zhì)聚集于核膜下、

6、細(xì)胞內(nèi)顆粒狀物增多等變化，胞漿內(nèi)可見凋亡小體形成。檢測(cè)尼美舒利對(duì)細(xì)胞增殖的影響不同濃度尼美舒利加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)一細(xì)胞、，用法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)。如圖所示：不同濃度的尼美舒利對(duì)胃腺癌細(xì)胞一的增殖均有抑制作用，呈時(shí)間一劑量依賴性抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。兒的尼美舒利抑制率最低，作用不同時(shí)間（，）后的抑制率分別是：、；“的尼美舒利抑制率最高，作用不同時(shí)間（，）后的抑制率分別是：、。浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文表尼美舒利對(duì)細(xì)胞周期的影響浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文圖（無尼美舒利作用后的細(xì)胞周期分析）圖（“尼美舒利作用后的細(xì)胞周期分析）浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文圖（尼美舒利作用后的細(xì)胞周期分析）圖（兒尼美舒利作用后的細(xì)胞周期分析）浙江大

7、學(xué)屆碩士學(xué)位論文圖（尼美舒利作用后的細(xì)胞周期分析）圖（尼美舒利作用后的細(xì)胞周期分析）浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文討論是一種誘導(dǎo)型酶，在正常生理狀態(tài)下多數(shù)組織內(nèi)檢測(cè)不到。而在許多腫瘤組織和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中存在著的高表達(dá)。有研究表明，在胃癌組織、癌前病變的腺瘤或增生性組織中，發(fā)現(xiàn)的表達(dá)明顯增高【】脅曲等【研究發(fā)現(xiàn)的賁門癌及的胃體癌呈陽性表達(dá)。等研究也同樣證實(shí)在胃癌組織中表達(dá)明顯升高。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)一具有過氧化物酶活性，可使致癌劑發(fā)生氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致致癌劑激活導(dǎo)致腫瘤發(fā)生【】；它的過度表達(dá)與腫瘤新生血管形成有關(guān)¨】：它還會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制其凋亡【】以及提高腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的潛能，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力

8、【】等。因此，一有望成為成為腫瘤防治的一個(gè)新靶點(diǎn)。尼美舒利，是新一代選擇性一抑制劑。有研究【】認(rèn)為尼美舒利通過選擇性抑制環(huán)氧化酶一的活性，導(dǎo)致生成減少，削弱其對(duì)細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞活性的抑制，起動(dòng)細(xì)胞免疫監(jiān)視作用，幫助清除新生細(xì)胞。在體外研究¨】中發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧化酶抑制劑能抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其調(diào)亡，存在劑量和時(shí)間的依賴關(guān)系，對(duì)細(xì)胞周期無影響。但有研究【”認(rèn)為：體外尼美舒利對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用不是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而是通過阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)展，使細(xì)胞在期或期堆積，在高濃度時(shí)直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并認(rèn)為這與腫瘤細(xì)胞體外長(zhǎng)時(shí)間接觸環(huán)氧化酶抑制劑有關(guān)。本研究經(jīng)試驗(yàn)，證實(shí)體外尼美舒利對(duì)一的增殖有明顯的抑制作用

9、，其抑制率與尼美舒利的濃度和作用時(shí)間有相關(guān)性。結(jié)果顯示，不同濃度的尼美舒利作用后一均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，“尼美舒利作用天后抑制率可達(dá)。抑制率與尼美舒利的濃度和作用時(shí)間呈依賴浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文方式。這為臨床上使用選擇性一抑制劑作為抗癌藥物提供了實(shí)驗(yàn)室的依據(jù)，從而避免長(zhǎng)期使用非選擇性抑制劑所導(dǎo)的胃腸道副作用。流式細(xì)胞儀顯示，經(jīng)尼美舒利作用后，的細(xì)胞周期發(fā)生了明顯的變化，期細(xì)胞相對(duì)減少，期細(xì)胞明顯增多，提示尼美舒利對(duì)胃腺癌細(xì)胞一增殖的抑制主要作用于期、阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程，從而誘導(dǎo)其凋亡。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡具有很高的靈敏性，并能進(jìn)行凋亡細(xì)胞的定量分析。本研究結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)細(xì)胞周期和凋

10、亡的分析：發(fā)現(xiàn)尼美舒利能誘導(dǎo)一細(xì)胞凋亡，其可能機(jī)制與改變胃癌細(xì)胞周期有關(guān)，使細(xì)胞堆積在期，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，尼美舒利在體外能有效抑制胃癌細(xì)胞株增殖，這無疑將開拓選擇性一抑制劑的應(yīng)用前景。因而深入研究其作用機(jī)理和體內(nèi)抗癌理想劑量，以求提高療效，減少藥物的副作用，將有重大的臨床意義。浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文，：】，眥 ， 印衄砒 鋤 ，：】吳開春，吳漢平，韓英，等一在胃癌細(xì)胞中的相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)胃腸病學(xué)，（增刊）：【】， 丘趾一、曲 鋤 印 。 ，：【】聰皿， ，孤 ，趾 鋸 加；（）：【】）（， ，枷 芏 帆缸 們讎 ；（）：浙江大學(xué)帥屆碩士學(xué)位論文環(huán)氧合酶一（一）與胃癌（綜述）環(huán)氧合酶

11、一（一）是炎癥過程中的一個(gè)重要的誘導(dǎo)酶，炎癥過程中前列腺素的產(chǎn)生主要由它來催化合成。但近年來，國內(nèi)外諸多研究表明，一參與了腫瘤的發(fā)生，是腫瘤防治的一個(gè)新靶點(diǎn)“?，F(xiàn)將一與胃癌的關(guān)系做綜述。，環(huán)氧合酶一（一）在胃癌中的表達(dá)國外有學(xué)者報(bào)道胃癌組織中蛋白陽性表達(dá)率在。等“檢測(cè)了賁門腺癌例，胃體腺癌例及鄰近的正常上皮組織中一的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)的賁門癌及的胃體癌呈陽性表達(dá)。 的過度表達(dá)主要見于大部分胃體腺癌和少部分賁門腺癌組織中。等“用法研究了例胃腺癌（例早期胃癌，例進(jìn)展期胃癌）鄰近正常胃粘膜組織中一一表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有，（）病例胃癌組織中表達(dá)水平明顯升高。但例早期胃癌和例中的例進(jìn)展期胃癌呈弱表達(dá)水平或

12、與癌旁組織有相同表達(dá)水平。胃癌組織一過表達(dá)與癌細(xì)胞中淋巴管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期密切相關(guān)，但與組織病理分級(jí)、腫瘤大小、靜脈瘤栓不相關(guān)。提示一過表達(dá)可能增強(qiáng)胃癌的淋巴浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移潛能，且預(yù)后不佳。一在胃癌及癌旁組織中表達(dá)無明顯差異。國內(nèi)對(duì)食管癌的研究也得到類似的結(jié)果。皿等“采用免疫印記方法分析了例胃癌組織和個(gè)胃癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)與淋巴管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)。微衛(wèi)星不穩(wěn)定（）陽性胃癌組織中一明顯低于陰性的病例，同時(shí)無表達(dá)的一些胃癌細(xì)胞陽性胃癌組織中一明顯低于陰性的病例，同時(shí)無表達(dá)的一些胃癌細(xì)胞浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文系中可見不同程度的一表達(dá)，而有表達(dá)的胃癌細(xì)胞系中無一表達(dá)。以上說明一在

13、胃癌的發(fā)展過程中起重要作用，而陽性與陰性病例可能具有不完全相同的癌變機(jī)制。等采用 法檢測(cè)了例胃腺癌新鮮標(biāo)本的和一，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織一 水平明顯高于正常胃粘膜，而一水平在胃癌組織中未升高。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)一蛋白局限于細(xì)胞質(zhì)和過度增殖的腺體，但在周圍間質(zhì)細(xì)胞及胃粘膜的正常腺管未見表達(dá)。等“報(bào)道不同胃癌細(xì)胞系一表達(dá)水平不同，如（細(xì)胞系（高分化腺癌）和（細(xì)胞系（印戒細(xì)胞癌）一表達(dá)較弱，而姬 細(xì)胞系（分化差的腺癌）表達(dá)增強(qiáng)。因一過度表達(dá)與胃炎程度無關(guān)，推測(cè)炎細(xì)胞刺激不大可能增強(qiáng)癌組織一的過表達(dá)。，環(huán)氧合酶一（一）致腫瘤的機(jī)制一的過表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制其凋亡一的活性增高可提高凋亡抑制基因卜的表達(dá)

14、水平，降低介導(dǎo)凋亡的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子一（）型受體水平，降低介導(dǎo)細(xì)胞間粘附的一鈣粘蛋白（）活性，從而抵抗各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且能提高細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的粘附能力，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力。前列腺素作為一種血管滲透性因子在腫瘤生長(zhǎng)增殖及腫瘤組織血管滲透性中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，一高水平表達(dá)，合成大量，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增生“。另外，一表達(dá)上調(diào)可通過對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體的誘導(dǎo)使細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)的敏感性增加從而發(fā)揮促使細(xì)胞增殖作用“。浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文促進(jìn)腫瘤血管生成資料表明一的過度表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的新生血管生成，為腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供必需的營養(yǎng)“。等“通過對(duì)例原發(fā)性胃腺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，例（）有卜蛋白的過度表達(dá)

15、，且一過度表達(dá)的患者微血管密度（）較一表達(dá)不增加者明顯增加。將轉(zhuǎn)染一基因的結(jié)腸癌細(xì)胞株一和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（）聯(lián)合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)一細(xì)胞在過度表達(dá)的同時(shí)，促血管生成因子、和等均明顯上調(diào)，并能促進(jìn)在型膠原凝膠中增殖、變形，向腫瘤細(xì)胞遷移以及形成網(wǎng)狀的內(nèi)皮細(xì)胞索。抑制機(jī)體免疫功能有關(guān)一對(duì)腫瘤免疫影響的文獻(xiàn)報(bào)道不多。等發(fā)現(xiàn)，人胃癌細(xì)胞一呈過表達(dá)時(shí)，可增強(qiáng)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。發(fā)現(xiàn)”，結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)的一可抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和巨噬細(xì)胞活化，從而導(dǎo)致抗腫瘤免疫監(jiān)視機(jī)能抑制。等將淋巴細(xì)胞與高表達(dá)一的人結(jié)腸癌細(xì)胞株共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞的增生指數(shù)較對(duì)照組顯著降低，選擇性一抑制劑可抑制這一作用，同時(shí)使的濃度降低。因而

16、，一在結(jié)腸癌的過度表達(dá)可引起局部免疫抑制。一也可通過在腫瘤免疫中發(fā)揮作用：如可抑制具有免疫調(diào)節(jié)功能的淋巴因子產(chǎn)生，抑制細(xì)胞和細(xì)胞增殖，細(xì)胞母細(xì)胞化及抑制細(xì)胞、細(xì)胞和的細(xì)胞毒活性。同時(shí)，。還可抑制的產(chǎn)生，誘導(dǎo)一產(chǎn)生。一與腫瘤的轉(zhuǎn)移臨床資料表明一的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。一促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制除通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和新生血管形成等間接因素外，還與其直浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文參考文獻(xiàn) ， ：、【】 ，（）：】 【 ）售 】加 ，（）：【】婦曲，浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文【】戤 ，址，（ 擎加 ，：【】，：舢 ，眄 ， ）（ ，：【 】 ，酗， ， 。 而 ，：】劃 ， ，洲【 ， ，；：【 ， ，：；【】 ， ， ；：浙江大學(xué)屆碩士學(xué)位論文致謝畢業(yè)在即，首先感謝我的導(dǎo)師于吉人老師，三年來在他的悉心指導(dǎo)、辛勤培養(yǎng)和親切關(guān)懷下，使我能順利完成學(xué)習(xí)任務(wù)。他在胃腸外科學(xué)領(lǐng)域中開闊的