實驗設計大綱范例--肺水腫

1、機能學實驗設計大綱實驗名稱：外源性PS和內(nèi)源性PS在肺水腫療效中的比較課題來源：自選設計班級：2004級臨床本科甲班設計人員：林靜 余英 羅萍 葉娟 胡明娟設計日期：2006年10月8日指導老師：張曉 梁楠成都醫(yī)學院實驗技術教研室2006年制一、實驗設計的目的意義：實驗設計的目的意義，國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，存在的問題，解決問題的思路。目的與意義:復制肺水腫模型，利用直接使用外源性表面活性物質(zhì)和藥物促進內(nèi)源性表面活性物質(zhì)釋放的方法，比較研究外源性PS和內(nèi)源性PS在肺水腫中的治療作用。本實驗的目的即在于探討外源性PS能否在肺水腫的防治中作為一種較為理想的內(nèi)源性PS不足的替代藥物，為臨床上治療肺水腫的聯(lián)合

2、用藥提供一種新思路，具有十分重要的意義。國內(nèi)外研究現(xiàn)狀：任何原因引起肺泡表面活性物質(zhì)（PS）減少或滅活，均可使肺泡表面張力增加，肺泡過度縮小甚至萎陷，間質(zhì)負壓加大，繼而誘發(fā)或加重間質(zhì)及肺泡水腫，臨床體外循環(huán)后發(fā)現(xiàn)，肺含水量的明顯增加與內(nèi)源性PS活性降低有顯著的相關性1。肺泡表面活性物質(zhì)（PS）具有降低肺泡表面張力，維持肺泡穩(wěn)定性，防止肺胞萎縮，調(diào)節(jié)肺順應性，阻止肺毛細血管內(nèi)液體滲入肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)，促進肺水的清除等重要生理功能。據(jù)相關文獻報道，外源性PS能夠在一定程度上抑制肺水腫的發(fā)生2。張更榮等觀察了氣管內(nèi)滴注外源性PS治療家兔急性肺水腫的療效，發(fā)現(xiàn)傷肺肺含水量明顯減少、存活時間顯著延長 3

3、。同樣應用外源性PS治療大鼠肺水腫、肺出血實驗中也發(fā)現(xiàn)肺泡內(nèi)蛋白質(zhì)滲出顯著減少，肺體指數(shù)降低，肺含水量顯著降低，肺水腫程度減輕 4.5。諸多資料顯示，外源性PS療法可能成為有效治療肺水腫的綜合措施之一。外源性PS治療可減輕肺水腫程度，抑制肺水腫形成。目前，內(nèi)源性PS的產(chǎn)生機制國內(nèi)已經(jīng)研究的很透徹了，PS與肺泡型上皮細胞共同構成了PS系統(tǒng)，該系統(tǒng)異常與肺部損傷密不可分，它既是肺損傷的結果，同時也是肺損傷過程中的重要內(nèi)在因素。肺泡型上皮細胞是合成表面活性物質(zhì)的主要場所，細支氣管非纖毛上皮細胞（Clara細胞）也能分泌少量的PS物質(zhì)。PS在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，通過某種機制轉運到高爾基復合體和多囊泡體，

4、然后轉運到板層體儲存，板層體通過胞吐作用分泌入肺泡腔。肺水腫可導致表面活性物質(zhì)減少、功能缺陷 6。那么，就目前，一部分藥物具有直接恢復肺泡型上皮細胞的生理功能，使其分泌肺泡表面活性物質(zhì)增多，以達到輔助治療肺水腫的作用，如：腎上腺糖皮質(zhì)激素，內(nèi)皮素-1，鹽酸氨溴索等，而其中鹽酸氨溴索具有可促進肺表面活性物質(zhì)的分泌的作用，而對肺水腫沒有其他干擾的治療作用。結合本實驗的目的，即探討外源性PS能否在肺水腫的防治中作為一種較為理想的內(nèi)源性PS不足的替代藥物。利用直接使用外源性表面活性物質(zhì)和藥物促進內(nèi)源性表面活性物質(zhì)釋放的方法，看那種更具有臨床使用價值。存在的問題：目前市場上已有外源性的PS使用，主要用于

5、新生兒呼吸窘迫綜合征的治療。外源性PS目前只局限在實驗室證明有治療肺水腫的作用，還未查見廣泛用于臨床。解決問題的思路：用快速滴注生理鹽水制作動物試驗性肺水腫模型。對肺水腫動物分別行外源性PS灌入氣管治療和促內(nèi)源性表面活性物質(zhì)釋放藥，灌入氣管治療，并作實驗對照和空白對照。參考文獻：1 邢泉生，張善通，陳張根，等.體外循環(huán)影響內(nèi)源性表面活性物質(zhì)的機制上海醫(yī)科大學學報，1999，26(1)：132徐建洪 周繼紅 楊軍民.表面活性物質(zhì)在創(chuàng)傷性肺水腫的作用.中華現(xiàn)代臨床醫(yī)學雜志 2004年5月 第2卷 第5B期3張更榮 王雁 曹勇. 肺表面活性物質(zhì)防治急性肺水腫作用的實驗.江西醫(yī)學院

6、學報1996；36(1)：17204 金IIb立，徐錦，孫家娥，等應用不同配方磷脂預防大鼠肺出血和肺水腫的研究中華兒科雜志，1997，35(2)：71735 鄭珊，張文穎，孫波，等一氧化氮治療小腸缺血再灌注所致肺損傷的實驗研究中華小兒外科雜志，2001，22(3)：1771796 Nitta K，Kobay,hi TIII aim lt of sttrfactant activity and ventilationby protein in lung edemafluidRespirPhysiol，1994，95(1)：43517丁延楷，唐亦奇肺血管外肺水量的重量分析法及其應用中國病理生理學雜

7、志，1987，4：254-255二、實驗設計方案（實驗設計目標,擬解決的主要問題, 實驗動物設計,實驗專業(yè)設計，實驗統(tǒng)計設計,實驗方法設計，可行性分析,預期結果，實驗設計工作時間安排）。（一）實驗設計目標，擬解決的關鍵問題設計目標：探討外源性肺表面活性物質(zhì)和內(nèi)源性肺表面活性物質(zhì)對實驗性肺水腫治療作用上所存在的區(qū)別，從而探討外源性PS能否在肺水腫的防治中作為一種較為理想的內(nèi)源性PS不足的替代藥物。擬解決的關鍵問題：實驗模型的制備。對試驗性肺水腫的模型進行分組與實驗結果分析。（二）實驗設計1、實驗動物設計我們選用家兔作為實驗動物，有以下幾點理由：1）、家兔易得到，容易飼養(yǎng)，在科研工作中被廣泛利用。

8、2）、家兔肺相對較大，易于得到樣品，能在稱重過程中減少實驗誤差。2、實驗專業(yè)設計選用家兔作為實驗動物，給予外源性肺表面活性物質(zhì)和內(nèi)源性肺表面活性物質(zhì)，觀察對實驗性肺水腫治療作用，觀察兔子死亡時間（min），肺系數(shù)（gkg），肺濕干重比（gg），血管外肺水（g）等實驗指標。3、實驗統(tǒng)計設計實驗統(tǒng)計設計中應始終貫徹隨機、對照、重復三大原則。（1）隨機：選正常成年健康重相近的家兔80只，將80只家兔按體重由小變大編號后，從隨機數(shù)字表中查取隨機數(shù)字，依次抄錄于家兔編號下。具體方法：動物編號為180號，隨機數(shù)字從11行第一個數(shù)字開始接著抄寫80個，按照能被4除的規(guī)律：不余到A組，余1到B1組，余2到B2

9、組，余3到B3組，每組20只。（2）對照：本組實驗做了空白對照和實驗對照，在前面的專業(yè)設計里已經(jīng)提及。（3）重復：本實驗采用的是每實驗小組有20只家兔，具有一定的重復性。（4）統(tǒng)計數(shù)據(jù)收集：本實驗搜集計量資料，初步確定對各組實驗數(shù)據(jù)的比較分為實驗值和基礎值比較。表1 實驗數(shù)據(jù)收集記錄表編號肺系數(shù)（gkg）肺濕干重比（gg）血管外肺水（g）兔子死亡時間（min）AB1B2B3AB1B2B3AB1B2B3AB1B2B3表2四組動物體重及模型形成時間比較（±s）組別模型形成時間（min）兔子死亡時間（min）A （n20）B1（n20）B2（n20）B3（n20）注：基礎值比較表3四組動物

10、肺組織含水量測定比較（±s）組別肺系數(shù)（gkg）肺濕干重比（gg）血管外肺水（g）A （n20）B1（n20）B2（n20）B3（n20）注：實驗值比較（5）統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析本實驗采用計量資料來測定各種指標的數(shù)值，所有數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標準差（±s）表示，四組間實驗數(shù)據(jù)比較行完全隨機單因素方差分析，組間兩兩比較行q檢驗，B1、B2、B3組模型形成時間行兩樣本比較t檢驗，均以0.05作為顯著性檢驗水準。實驗數(shù)據(jù)記錄如表3。四組間實驗數(shù)據(jù)比較行完全隨機單因素方差分析，如各組肺系數(shù)總體均值的比較，其方法如下：（1）建立檢驗假設H0：=（各組肺系數(shù)總體均值相等）。H1：、不等

11、或不全相等，0.05。（2）計算統(tǒng)計量 利用統(tǒng)計學專業(yè)軟件SPSS做One-way ANOVA 。( 3 ) 查F值表，確定P值，得出結論。 B1、B2、B3組模型形成時間行兩樣本比較t檢驗，如B1與B2組之間模型形成時間的比較，其方法如下：（1）建立檢驗假設H0：=（兩組肺模型形成時間總體均值相等）。H1：、不等或不全相等，0.05。（2）計算統(tǒng)計量 X=(X1+X2+X3+Xn)/nµ=(Xi-X)2/(n-1) t=（x-u）/Sx( 3 ) 查t值表，確定P值，得出結論。4、實驗方法設計實驗技術路線家兔 A組假手術組B組 實驗組注入生理鹽水B3組 注入生理鹽水B2組 注入鹽酸

12、氨溴索，促內(nèi)源性ps釋放解救B1組 直接注入外源性PS解救肺組織含水量測定肺組織含水量測定肺組織含水量測定肺組織含水量測定實驗技術方法（1）隨機抽樣：隨機80只正常的家兔，并分別編號，再隨機平分成四組，并稱重（實驗室共8組同學，1、2組做A組實驗，3、4組做B1組實驗，5、6組做B2組實驗,7、8組做B3組實驗。（2）實驗分組：（3）實驗手術：AB組同時取兔，稱重（嬰兒秤）后固定于兔臺上，剪去頸部長毛（換藥碗裝水）。用1%普魯卡因局麻（大約三公分長，不同點局麻），切開頸部皮膚（*輕點，不要損傷氣管和血管），呈鈍形分離出氣管（分離干凈），做倒T形切口，插入氣管插管并結扎固定，分離頸外靜脈，靜脈插

13、管。（4）模型復制：B組制造家兔試驗性肺水腫模型，從頸外靜脈輸入37生理鹽水，輸入量按150ml/kg，輸入速度按200滴/min計算，待輸液量為總量的2/3時（兔子該輸?shù)目偭浚?，向管?nèi)加入腎上腺素0.5g。輸液過程中密切觀察家兔的呼吸是否急促和困難，氣管插管管口是否有粉紅色泡沫樣液體溢出。（5）處理措施：1）外源性肺表面活性物質(zhì)（PS）的提?。喝∪饴?lián)廠新鮮豬肺，洗凈肺表面血液，用生理鹽水自氣管灌入肺內(nèi)，直到完全膨脹，輕輕拍打后自氣管內(nèi)自然流出灌洗液，若灌洗液呈紅色棄掉。每只肺反復灌洗8次，灌洗液回收率85，共6批，每批6個，共36個豬肺。灌洗液合并后在4、1 000×g離心10mi

14、n，去除細胞和組織碎片等沉淀物，取上清液在4 ，10000×g離心40min，得白色沉淀即為Ps粗品，將收集的PS粗品用生理鹽水溶解后在4 ，20000 g·0.68、0.25mol/l蔗糖梯度離心30min，取兩蔗糖之間的沉淀物，用蒸餾水溶解后同法離心1次，所得沉淀根據(jù)F。Ich 方法，用生理鹽水溶解后加2倍體積的氯仿甲醇(2/1，V/V)旋渦混勻2min，置4冰箱過夜。然后用7O0 ×g，4離心1 Omin取下相液，N 吹干， 再加冷丙酮于4 ，2000 × g離心10min沉淀，獲乳白色物質(zhì)即為PS純品。所有操作均在常溫下進行，所得PS在4 冰箱保

15、存，Ps加入含005mmol CaCl2的0.1mol生理鹽水超聲乳化后制成混懸渡，濃度為50gL。2）滴注藥品：當家兔出現(xiàn)肺水腫時（有粉紅色泡沫樣液體時），B1組為外源性PS治療組，迅速實行氣管內(nèi)注入37PS100mgkg藥物解救，B2組為內(nèi)源性PS治療組, 同時迅速實行氣管內(nèi)注入3715mgkg鹽酸氨溴索葡萄糖注射液，B3組為治療對照組，同時迅速實行氣管內(nèi)注入同等體積的生理鹽水（NS）2.0mlkg。A組為假手術組，在模型復制及治療相應時間注入同等體積NS作為PS療效的對照。（6）取材：等家兔自然死亡，并記錄其死亡的時間。解剖家兔胸腔，支氣管分叉處用線結扎，防止水腫液溢出。結扎處上方切斷氣

16、管，將肺清理出（把心臟等清除），切勿擠壓。（7）肺組織含水量測定：采用重量分析法7肺系數(shù)：準確稱肺重量，并計算肺系數(shù)，肺系數(shù)肺重量（g）/體重（kg）肺濕干重比：取左上肺葉稱濕重,然后放入烤箱(80 ,48 h) 中烘烤至恒重,再秤干重,計算肺W/D 以評估肺組織的水腫程度血管外肺水：取下右下肺并剪成兩半(用2 把止血鉗夾住切口,避免肺內(nèi)液體流出) ,各稱濕質(zhì)量;一半肺即刻剪碎,按1 ml/ 100 mg組織加入生理鹽水勻漿,分別測血液和勻漿中Hb的含量,剩余組織勻漿迅速置于- 70 保存?zhèn)溆?另一半肺置于80 烘箱內(nèi)干燥72 h 至恒質(zhì)量,稱肺干質(zhì)量;計算公式為:總肺水量指數(shù)( TLW) =

17、 (肺濕質(zhì)量- 肺干質(zhì)量) / 肺濕質(zhì)量,每克濕肺含殘血量= (勻漿液Hb/ 血液Hb) ×勻漿總樣本量×1.055/勻漿肺質(zhì)量,濕肺含殘血量= 肺濕質(zhì)量×每克濕肺含殘血量,EVLWI = (肺濕質(zhì)量- 肺干質(zhì)量- 濕肺含殘血量) / 肺濕質(zhì)量。（三）可行性分析:1、家兔易得到，容易侍養(yǎng)，在科研工作中被廣泛利用。2、ps提取方法已具備，我們事先自己提取，鹽酸氨溴索葡萄糖注射液市場有買，價格不高。3、手術器材和設備均為實驗室常用，手術方法我們也相對熟練。（四）預期效果:1、外源性PS能夠在肺水腫的防治更具優(yōu)勢，作為一種較為理想的內(nèi)源性PS不足的替代藥物。2、為臨床上進一步研制有關外源性表面活性物質(zhì)的藥物提供可靠依據(jù)。3、外源性ps可以考慮作為臨床上一種聯(lián)合用藥治療肺水腫。（五）實驗設計工作時間安排:1、共計1D 完成