Annexin_PI流式細(xì)胞分析法和TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡的對(duì)比研究_圖文

1、文章編號(hào):1007-6611(200805-0476-04Annexin/PI流式細(xì)胞分析法和TUNE L法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡的對(duì)比研究郭曉紅,劉立新3(山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心,太原030001;3通訊作者,E2mail:lixinliu6 摘要:目的通過Annexin/PI流式細(xì)胞分析法和TUN EL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡,比較兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。方法以體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞株HL27702為研究對(duì)象,分別設(shè)立TGF21組(加入TGF21至終濃度為20ng/ml,作用72h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和正常對(duì)照組(加入等量PBS,采用Annexin/PI流式細(xì)胞分析法和TUN EL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡。結(jié)果

2、Annexin/ PI流式細(xì)胞分析顯示,TGF21組與正常對(duì)照組相比肝細(xì)胞的早期凋亡率和總凋亡率均顯著增加(10.55±4.71%vs(5.98±2.97%,P<0.01;(19.94±3.68%vs(13.27±4.62%,P<0.05。TUN EL法檢測(cè)顯示,細(xì)胞核中有棕黃色著染者為陽性細(xì)胞,細(xì)胞呈典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變,即表現(xiàn)為變小、變圓、核固縮;而正常細(xì)胞的胞核不著染。經(jīng)Iimage2Pro Plus圖像分析軟件處理,顯示TGF21組與正常對(duì)照組相比肝細(xì)胞凋亡率顯著增加(30.25±6.43%vs(4.75±0.96

3、%,P<0.01。結(jié)論Annexin/PI流式細(xì)胞分析法特異性高,TUN EL法靈敏度高,兩種方法相結(jié)合檢測(cè)細(xì)胞凋亡更準(zhǔn)確。關(guān)鍵詞:肝細(xì)胞凋亡;Annexin/PI;流式細(xì)胞術(shù);TUN EL中圖分類號(hào):Q503文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:AComparative study on Annexin/PI and TUNE L in detecting hepatocyte apoptosisGUO Xiao2hong,L IU Li2xin3(Ex perimental Center of Science and Research,First Clinical Medical College,S hanx

4、i Medical U ni2 versity,Taiyuan030001,China;3Corresponding author,E2m ail:lixinliu6hot m Abstract:ObjectiveTo compare the advantages and disadvantages of Annexin/PI with flow cytometry and TUN EL in detect2 ing hepatocyte apoptosis.MethodsCultured human hepatocyte line HL27702was divided into TGF21g

5、roup(treated with TGF21 20ng/ml for72hand normal control group(incubated with equal PBS.Hepatocyte apoptosis was detected by Annexin/PI with flow cytometry and TUN EL.ResultsCompared with normal control group,the percentages of early and total apoptosis signifi2 cantly increased in TGF21group by Ann

6、exin/PI(10.55±4.71%vs(5.98±2.97%,P<0.01;(19.94±3.68%vs(13.27±4.62%,P<0.05.By TUN EL assay,nuclei stained buffy were detected as positive cells.Meanwhile the cells changed into smaller, rounder and nuclear condensation.But normal nuclei were not stained.The percentage of hep

7、atocyte apoptosis in TGF21group was much higher than in normal control group(30.25±6.43%vs(4.75±0.96%,P<0.01.ConclusionAnnexin/PI with flow cytometry is more specific,while TUN EL assay is more sensitive.It is more precise to combine Annexin/PI with TUN EL. K ey w ords:hepatocyte apopto

8、sis;Annexin/PI;flow cytometry;TUN EL參考文獻(xiàn):1Nisolle M,Donnez J.Peritoneal endometriosis,ovarian endometri2osis,and adenomyotic nodules of the rectovaginal septum are three different entitiesJ.Fertil Steril,1997,68:585-596.2戈一峰,黃宇峰,胡毓安,等.人子宮內(nèi)膜細(xì)胞的純化和培養(yǎng)J.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2005,18(6:496-498.3譚先杰,劉東遠(yuǎn),郎景和,等.子宮內(nèi)膜腺上皮及基

9、質(zhì)細(xì)胞分離、培養(yǎng)作為子宮內(nèi)膜異位癥體外細(xì)胞模型的探索J.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2002,11(1:30-32.4Casey ML,MacDonald PC,Mitchell MD,et al.Maintenance andcharacterization of human myometrial smooth muscle cell in mono2 layer cultureJ.In vit ro,1984,20(5:396-403.5ZHU Xue2Qing,SHI Y i2Fu,CHEN G Xiao2Duan,et al.Immuno2histochemical markers in diff

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11、d,2004,19(10:2192-2199.作者簡介:韓妍,女,1975-02生,在讀碩士,主治醫(yī)師,現(xiàn)在長治市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科工作.收稿日期:2007-12-20基金項(xiàng)目:國家人事部留學(xué)回國人員擇優(yōu)基金資助項(xiàng)目(200499;山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20051092;太原市科技明星專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(070204004細(xì)胞凋亡,即程序性細(xì)胞死亡,在許多生理和病理調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用,其定性和定量檢測(cè)無論對(duì)于基礎(chǔ)研究還是臨床用藥,都有指導(dǎo)意義。隨著對(duì)細(xì)胞凋亡研究和認(rèn)識(shí)的不斷深入,已有多種檢測(cè)方法得到廣泛應(yīng)用。然而如何選擇適當(dāng)?shù)姆椒ú?duì)檢測(cè)結(jié)果作出正確的判斷及恰如其分的解釋仍是值得探討的問

12、題。本研究擬通過磷脂結(jié)合蛋白/碘化丙啶(Annexin /PI 流式細(xì)胞分析法和原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT 標(biāo)記法(TUN EL 法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長因子1(transforminggrowth factor 1,TGF 21誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞株凋亡,以比較兩種方法在測(cè)定細(xì)胞凋亡時(shí)的優(yōu)缺點(diǎn)。1材料與方法1.1材料人肝細(xì)胞株(HL 27702(購于上海生命科學(xué)院細(xì)胞研究所;TGF 21(英國Peprotech 公司;Annexin 2FITC 試劑盒(美國BECK MAN COUL TER 公司;TUNE L 檢測(cè)凋亡試劑盒(美國R &D 公司。流式細(xì)胞儀(FACSCalibur ,美國BD

13、 公司。1.2方法含10%胎牛血清的RPM I1640培養(yǎng)液中,37、5%CO 2條件下培養(yǎng),隔天換液,待細(xì)胞長至90%密度時(shí),0.25%的胰蛋白酶消化傳代。ng/ml 的TGF 21作用于培養(yǎng)細(xì)胞,72h 后收集細(xì)胞及其上清液進(jìn)行500×g 、4離心5min ,棄上清;冰PBS 洗細(xì)胞一次,重懸400目篩網(wǎng)過濾,計(jì)數(shù),再次離心,棄上清;冰1×binding buffer (一種緩沖液將細(xì)胞調(diào)為1×106/ml ,取100l 細(xì)胞懸液加入5l Annexin 和2.5l PI 染液(終濃度250g/ml ,輕輕振蕩混勻,冰上避光10min ;加入400l 冰1&#

14、215;binding buffer 輕輕振蕩,30min 內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞定量分析。TGF 21,72h 后將細(xì)胞用3.7%中性福爾馬林室溫固定10min ;經(jīng)100%、95%、70%梯度酒精室溫各5min 水化,PBS 室溫洗10min ;每張切片滴加50l Cytonin (一種非蛋白水解的破膜劑,室溫30min ,DNase 2free 水洗2min ×2次;新鮮配置的3%H 2O 2溶液,室溫5min ,PBS 洗1min ;TdT 標(biāo)記緩沖液室溫孵育5min ;每張切片滴加50l 標(biāo)記反應(yīng)混和液,371h 后用TdT 終止緩沖液室溫作用5min ,PBS 洗2min 

15、15;2次;50l Streptavidin 2HRP Detection Solution 室溫20min ,PBS 洗2min ×2次;DAB 顯色。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以 x ±s 表示,采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,組間比較用SN K 2q檢驗(yàn),以P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1Annexin /PI 流式細(xì)胞分析法檢測(cè)TGF 21誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡正?；罴?xì)胞Annexin 及PI均低染(Annexin -PI -,分布在流式細(xì)胞分析圖的左下區(qū)(LL ;早期凋亡細(xì)胞Annexin 高染而PI 低染(Annexin +PI -,分布在圖

16、的右下區(qū)(RL ;晚期凋亡或死亡細(xì)胞Annexin 及PI 均高染(An 2nexin +PI +,分布在圖的右上區(qū)(RU (見圖1。將早期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(RL 和晚期凋亡細(xì)胞百分圖1Annexin /PI 流式細(xì)胞分析檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡Fig 1Hepatocyte apoptosis detected by Annexin /PI with flow cytometry數(shù)(RU 之和稱為總凋亡率。結(jié)果顯示TGF 21組與正常對(duì)照組相比肝細(xì)胞早期凋亡率顯著增加(P <0.01,總凋亡率亦顯著增加(P <0.05,見表1。表1Annexin /PI 流式細(xì)胞分析檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡的結(jié)果T

17、ab 1The results of hepatocyte apoptosis by Annexin /PIwith flow cytometryn總凋亡率(%早期凋亡率(%正常對(duì)照組413.27±4.62 5.98±2.97TGF 21組819.94±3.68310.55±4.7133與正常對(duì)照組相比,3P <0.05,33P <0.012.2TUN EL 法檢測(cè)TGF 21誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡細(xì)胞核中有棕黃色著染者為凋亡細(xì)胞,被染上棕色的細(xì)胞呈典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,肝細(xì)胞變小、變圓、核固縮;而正常細(xì)胞的胞核不著染(見圖2。每張切片在高倍視

18、野下(×200取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)5個(gè)視野中每100個(gè)細(xì)胞中染色陽性的細(xì)胞數(shù)(%,取其平均數(shù)。經(jīng)Image 2Pro Plus 圖像分析軟件處理,顯示TGF 21組與正常對(duì)照組相比肝細(xì)胞凋亡率顯著增加(P <0.01,見表2。 圖2TUN EL 染色檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡(×200 Fig 2Hepatocyte apoptosis detected with TUN EL (×200表2TUNE L 法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡的結(jié)果T ab 2The results of hepatocyte apoptosis with TUNE Ln凋亡率(%正常對(duì)照組4 4.75

19、7;0.96TGF 21組830.25±6.43#與正常對(duì)照組相比,#P <0.013討論細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)首先出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)濃集,細(xì)胞體變圓皺縮等形態(tài)學(xué)改變,在胞質(zhì)內(nèi)形成多個(gè)膜結(jié)構(gòu)尚完整的“小泡”及“凋亡小體”1。同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞膜的特異性改變,原位于胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(PS 遷移至脂雙層外側(cè)2,暴露于細(xì)胞外環(huán)境中,但細(xì)胞膜仍保持完整。另外,核酸內(nèi)切酶被激活,將DNA 降解,形成長度為180-200bp 的DNA 片斷。而壞死細(xì)胞DNA 斷裂無規(guī)律性。1995年Vermes 等3首先利用對(duì)PS 有高度親和力的Annexin 檢測(cè)細(xì)胞凋亡。由于壞死細(xì)胞PS 亦暴露于細(xì)胞膜外

20、表,使Annexin 結(jié)合陽性,因此單獨(dú)用Annexin 不能區(qū)分細(xì)胞壞死或凋亡,必須同時(shí)采用PI 這一壞死細(xì)胞染色陽性的染料將壞死細(xì)胞區(qū)分出來。所以,用熒光標(biāo)記Annexin 與PI ,通過流式細(xì)胞儀可同時(shí)區(qū)分活細(xì)胞、凋亡早期和凋亡晚期或壞死細(xì)胞4。本研究用該法檢測(cè)TGF 21誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示:終濃度為20ng/ml 的TGF 21作用于培養(yǎng)細(xì)胞72h 后,無論是肝細(xì)胞的早期凋亡率還是總凋亡率均較正常對(duì)照組顯著升高(P <0.01,P <0.05。細(xì)胞凋亡中染色體DNA 的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段過程,染色體DNA 首先在內(nèi)源性核酸水解酶的作用下降解為50-300kb 的大

21、片段。然后大約30%的染色體DNA 在Ca 2+和Mg 2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下,在核小體單位之間被隨機(jī)切斷,形成180-200bp 的寡聚核苷酸。DNA 雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口即產(chǎn)生一系列的DNA 3-OH 末端,可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(Td T 的作用下,將脫氧核糖核苷酸和辣根過氧化物酶形成的衍生物標(biāo)記到DNA 的3-末端,而正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA 的斷裂,沒有3-OH 形成,很少能夠被染色。因此可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè),即TUN EL 法5。本研究據(jù)此檢測(cè)TGF 21誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示終濃度為20ng/ml 的TGF 21作用于培養(yǎng)細(xì)胞72h 后,肝細(xì)胞

22、凋亡率亦顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01。Annexin/PI流式細(xì)胞分析法和TUN EL法是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的兩種常用方法。TUN EL法是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法,對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色,能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征,廣泛應(yīng)用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)細(xì)胞以及組織分離細(xì)胞的凋亡測(cè)定,可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞,靈敏度高。它利用DNA的斷裂來標(biāo)記凋亡細(xì)胞,不需要特殊儀器,方法簡單易行。但TUN EL法亦有它的局限性6-8:只能標(biāo)記中期及晚期的凋亡細(xì)胞;細(xì)胞壞死時(shí)也會(huì)發(fā)生DNA 斷裂而被dU TP標(biāo)記,因此不能區(qū)別凋亡和壞死細(xì)胞,并

23、會(huì)將壞死細(xì)胞計(jì)入凋亡細(xì)胞,特異性較差;標(biāo)記過程中需固定細(xì)胞,易導(dǎo)致細(xì)胞碎片過多或DNA片段丟失;凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)易受主觀因素的影響。我們用TUN EL法檢測(cè)處理組的肝細(xì)胞凋亡遠(yuǎn)高于Annexin/PI流式細(xì)胞分析法的檢測(cè)結(jié)果(30.25±6.43%vs(19.94±3.68%,可能也提示它的特異性差。細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的PS外露,使細(xì)胞膜喪失不對(duì)稱性是細(xì)胞凋亡的早期事件2,9,早于DNA 斷裂3,且通過Annexin與PS特異性結(jié)合、PI與壞死細(xì)胞結(jié)合可將凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞區(qū)分開來,因此用Annexin/PI流式細(xì)胞分析法能更靈敏、特異地檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞。此法進(jìn)行熒光標(biāo)記后直

24、接上機(jī)檢測(cè),不需固定細(xì)胞,避免了TUN EL法因固定出現(xiàn)的DNA片段丟失,并且不受主觀因素影響,簡單、快速,結(jié)果更可靠。但晚期凋亡和壞死細(xì)胞的胞膜均已破壞,PS也暴露于胞膜外側(cè),不能區(qū)分晚期凋亡與壞死細(xì)胞。試劑盒價(jià)格昂貴也限制了它的廣泛應(yīng)用。盡管有透射電鏡或熒光顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察、DNA凝膠電泳、EL ISA法、PI單染色法以及cas2 pase23活性檢測(cè)等多種方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,但每種方法各具特點(diǎn),均有其局限性,目前尚無一種完美的檢測(cè)手段。因此在凋亡檢測(cè)中應(yīng)避免使用單一方法,需考慮實(shí)驗(yàn)室條件、樣本來源和研究目的,選擇兩種或兩種以上的方法,檢測(cè)細(xì)胞在凋亡發(fā)生過程中的不同事件,才能更準(zhǔn)確、客觀、全

25、面地反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果。參考文獻(xiàn):1Hacker G.The morphology of apoptosisJ.Cell Tissue Res,2000,301(1:5-17.2Fadok VA,Voelker DR,Campbell PA,et al.Exposure of phos2phatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophagesJ.J Immunol, 1992,148(7:2207-2216.3Vermes I,Haanen C,Steffens2Nakken H,et al.A novel assay forapoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expres2 sion on early apoptotic cells using