乙肝病毒生活史侵入肝細(xì)胞與病毒組裝

1、乙肝病毒生活史：侵入肝細(xì)胞與病毒組裝HBV Life Cycle: Entry and Morphogenesis摘要：乙型肝炎病毒（HBV）是導(dǎo)致肝病的主要原因。乙型肝炎病毒主要以一種尚未明確的機(jī)制感染肝細(xì)胞。在經(jīng)歷吞飲過(guò)程之后，核衣殼釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，開(kāi)環(huán)DNA（rcDNA）基因組向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)，并在其中轉(zhuǎn)變?yōu)楣矁r(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。病毒基因組通過(guò)與HBV多聚酶結(jié)合的前基因組RNA進(jìn)行復(fù)制。多聚酶觸發(fā)衣殼內(nèi)前基因組的殼體化和內(nèi)轉(zhuǎn)錄。包含有開(kāi)環(huán)DNA的成熟核衣殼能夠?qū)㈤_(kāi)環(huán)DNA再次輸運(yùn)至細(xì)胞核，或者通過(guò)與包膜蛋白的相互作用得以分泌成為子代病毒顆粒。關(guān)鍵詞：乙型肝炎病毒；侵入；形態(tài)發(fā)生

2、病毒組裝；肝病1. 前言人類乙型肝炎病毒屬于嗜肝DNA病毒科。嗜肝DNA病毒科分為2個(gè)種屬：哺乳動(dòng)物病毒屬和禽病毒屬。前者包含人類乙型肝炎病毒（HBV，以下簡(jiǎn)稱乙肝病毒），旱獺肝炎病毒（WHV）以及地松鼠乙型肝炎病毒（GSHV）。鴨乙型肝炎病毒（DHBV）和蒼鷺乙型肝炎病毒（HHBV）屬于禽病毒屬1。嗜肝DNA病毒科具有以下共同特點(diǎn)：¨ 由一段完整的編碼鏈（負(fù)鏈）和一段不完整的非編碼鏈（正鏈）構(gòu)成的部分雙鏈基因組DNA；¨ RNA依賴性DNA多聚酶；¨ 通過(guò)前基因組RNA模板進(jìn)行復(fù)制；¨ 高度的種屬和組織特異性； 乙肝病毒的部分雙鏈DNA基因組長(zhǎng)度約為3

3、.2kb。病毒基因組使用全部三種讀碼框，并包含至少四種不同的開(kāi)放閱讀框，分別編碼病毒多聚酶、核心抗原（HBcAg）、e抗原（HBeAg）、HBX調(diào)節(jié)蛋白以及對(duì)三種表面抗原（包括乙肝病毒表面大蛋白LHBs、表面中蛋白MHBs、表面小蛋白SHBs）進(jìn)行編碼的前S基因/S基因（圖1）。乙肝表面抗原大蛋白圖1. 乙肝病毒顆粒和亞病毒顆粒的結(jié)構(gòu)示意圖。乙肝病毒是一種包膜病毒，直徑約為42nm（42n顆粒）。包膜由包裹病毒核衣殼的三種表面蛋白（乙肝病毒表面大蛋白、乙肝病毒表面中蛋白、乙肝病毒表面小蛋白）形成。核心抗原形成核衣殼，核衣殼中包含與病毒多聚酶共價(jià)連接的部分雙鏈環(huán)形DNA基因組。在乙肝病毒陽(yáng)性病人

4、的血清中可發(fā)現(xiàn)大量無(wú)傳染性的絲狀(管狀)或球狀亞病毒顆粒（20nm顆粒），這些病毒顆粒由病毒表面蛋白構(gòu)成，但缺乏病毒核酸。感染乙肝病毒可引起急性或慢性肝炎。乙肝病毒也是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌（HCC）的主要病原體2，3。鑒于上述原因，許多研究關(guān)注于潛在的病毒致癌物的鑒定。除此之外，有關(guān)病毒生命周期的許多方面的問(wèn)題仍未明確。本文對(duì)病毒生命周期進(jìn)行了概述，著重介紹了新合成病毒顆粒的粘附、侵入以及病毒組裝。2. 乙肝病毒的結(jié)構(gòu)蛋白2.1 包膜蛋白乙肝病毒表面蛋白由一個(gè)開(kāi)放閱讀框進(jìn)行編碼，此閱讀框被三個(gè)框內(nèi)AUG起始密碼子分為下列區(qū)域：前S1區(qū)、前S2區(qū)和S區(qū)。乙肝病毒大蛋白包括前S1區(qū)（108或109個(gè)氨基酸

5、，依賴于基因型不同而有所不同）、前S2區(qū)（55個(gè)氨基酸）和S區(qū)（226個(gè)氨基酸）；表面中蛋白包括前S2區(qū)和S區(qū)；表面小蛋白由S區(qū)構(gòu)成4。所有三種表面蛋白均具有的S區(qū)在第146位的天門冬酰胺處存在一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。所有三種表面蛋白均部分使用此位點(diǎn)1,5,6。在前S2區(qū)的第4位天門冬酰胺處也存在一個(gè)糖基化位點(diǎn)，僅表面中蛋白使用此位點(diǎn)（圖2）。此外，有證據(jù)表明，C、D基因型乙肝病毒的表面中蛋白和表面大蛋白，其前S2區(qū)在第37位的蘇氨酸處均發(fā)生了部分O-糖基化，其中表面大蛋白程度較輕。A基因型乙肝病毒不包含第37位或第38位的蘇氨酸，因而無(wú)O-糖基化發(fā)生7。乙肝病毒包膜蛋白屬于膜內(nèi)在蛋白，其S區(qū)錨定

6、于膜內(nèi)8，9。N末端信號(hào)序列（第8位至第22位氨基酸）啟動(dòng)了S蛋白的膜嵌入，此序列并未發(fā)生剪切而是形成了首個(gè)跨膜區(qū)（TM1）。在成熟的蛋白質(zhì)中，第23位至第79位氨基酸面向細(xì)胞質(zhì)。在第80位至第98位氨基酸處，形成第二個(gè)跨膜區(qū)（TM2）的第二信號(hào)引導(dǎo)著生長(zhǎng)鏈經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（ER）易位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔，直至位于第170位氨基酸處的S區(qū)域疏水性C末端位點(diǎn)（位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)）啟動(dòng)。C末端區(qū)域（為第170位至第226位氨基酸）的具體結(jié)構(gòu)還不是十分明確，一般將其看作一個(gè)或兩個(gè)跨膜區(qū)（TM3/TM4）9，10。在完整的S蛋白中，N末端（第1位至第7位氨基酸）以及處于第99位至第169位氨基酸之間的回路（loop環(huán)

7、）面向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔，而第23位至第79位氨基酸之間的區(qū)域則面向細(xì)胞質(zhì)。由于位于第99位至第169位氨基酸之間的回路（loop環(huán)）定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔中，這就使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔中的N-糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)第146位天冬門酰胺位點(diǎn)進(jìn)行N-糖基化成為可能。除此之外，這個(gè)回路（loop環(huán)）包含乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的主要構(gòu)象表位。在成熟病毒顆粒出芽之后，這些管狀區(qū)域暴露于病毒顆粒的外表面上11-13。就乙肝病毒表面中蛋白而言，它與乙肝病毒表面小蛋白在S區(qū)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)方面沒(méi)有差異。表面中蛋白的N末端前S2區(qū)域（PreS2）翻譯后移位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔，從而使得第四位天冬門酰胺位點(diǎn)可接觸到N-糖基轉(zhuǎn)移酶（圖2）。因此，

8、表面中蛋白以三種形式存在：非糖基化（p30）、單糖基化（gp33）和雙糖基化（gp36）5, 11。乙肝病毒大蛋白采取了一種奇特的生物合成方式。由于S區(qū)的跨膜區(qū)（TM1）沒(méi)有被用作翻譯信號(hào)序列，因此它的親水性preS區(qū)（PreS1-PreS2）沒(méi)有發(fā)生翻譯移位。結(jié)果，preS區(qū)和S區(qū)的一部分（即上游區(qū)域的79個(gè)氨基酸），均保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞溶質(zhì)表面?？缒^(qū)（TM2）將增長(zhǎng)中的表面大蛋白錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，從而使得下游序列移位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔，最終造成了仍面向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔的S區(qū)第146位天門冬酰胺的糖基化14-16。由于這種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，與表面中蛋白相反，表面大蛋白前S2區(qū)第4位的天門冬酰胺不能發(fā)生N-糖基

9、化14, 17。位于表面大蛋白前S1區(qū)的第二個(gè)位點(diǎn)的甘氨酸殘基發(fā)生豆蔻?；饔?8，19。這里有一個(gè)有趣的現(xiàn)象，大約50%的大蛋白發(fā)生了翻譯后易位20，并最終形成了成熟表面大蛋白的雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。這種翻譯后易位的結(jié)果就是“未使用過(guò)的”跨膜區(qū)（TM1）整合入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，而使得前S1-前S2區(qū)面向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔。在表面蛋白的二元拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)之間好像存在著一種平衡，最近的報(bào)道提示翻譯后拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)再定位的控制與侶伴蛋白有關(guān)21-23。就病毒生命周期而言，表面大蛋白的不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)形式具有不同的功能。在成熟的分泌病毒顆粒中，最初面向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔的preS區(qū)暴露于病毒顆粒的外表面，并且對(duì)于病毒-細(xì)胞的相互作用很重要（圖1

10、）。另一部分preS區(qū)面向細(xì)胞質(zhì)的表面大蛋白通過(guò)與核衣殼的相互作用在病毒的病毒組裝中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用24。乙肝病毒表面大蛋白圖2. 乙肝病毒表面蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。三種乙肝病毒表面蛋白均存在S區(qū)。就乙肝病毒表面大蛋白而言，跨膜區(qū)（TM1）不作為起始穿膜信號(hào)，導(dǎo)致大蛋白preS區(qū)面向細(xì)胞質(zhì)。在一小部分表面大蛋白中，大蛋白preS區(qū)發(fā)生了翻譯后易位，穿過(guò)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。在這種情況下，大蛋白preS區(qū)面向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔。兩種形式的表面大蛋白實(shí)現(xiàn)了不同的功能。preS區(qū)面向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔的這部分表面大蛋白暴露于成熟病毒顆粒的病毒表面，與吸附過(guò)程有關(guān)。其preS區(qū)面向細(xì)胞質(zhì)的另一部分表面大蛋白調(diào)節(jié)與核衣殼的接觸，并

11、且通過(guò)前S2區(qū)與蛋白激酶C（PKC）的相互作用啟動(dòng)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。除了這些病毒組裝功能之外，大蛋白前S2區(qū)的細(xì)胞質(zhì)定向能力與其作為調(diào)節(jié)蛋白的額外功能有聯(lián)系。面向細(xì)胞質(zhì)的前S2區(qū)存在于表面大蛋白和C末端截?cái)嗟谋砻嬷械鞍字?, 17, 25-27，后者由3末端截?cái)嗲癝/S序列（pres/S）進(jìn)行編碼，此序列是從與乙肝病毒有關(guān)的肝癌中分離獲得的。在這種構(gòu)象中，大蛋白的前S2區(qū)結(jié)合并激活蛋白激酶C。依賴于前S2區(qū)的蛋白激酶C的激活導(dǎo)致c-Raf/MEK信號(hào)級(jí)聯(lián)放大通路的激活，而后者控制許多種細(xì)胞和病毒啟動(dòng)子的表達(dá)28。依賴于大蛋白前S2區(qū)的激活和依賴于HBx調(diào)節(jié)蛋白的激活具有許多共同的特點(diǎn)2，

12、29。有證據(jù)顯示依賴于HBx調(diào)節(jié)蛋白或大蛋白前S2區(qū)的激活對(duì)于乙肝病毒的復(fù)制至關(guān)重要。關(guān)于乙肝病毒的表達(dá)，大蛋白前S2或HBx的選擇性基因剔除可由其它未受影響的乙肝病毒調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行補(bǔ)償29, 30。然而，同時(shí)發(fā)生的大蛋白前S2和HBx的基因剔除中止了乙肝病毒的復(fù)制29。乙肝病毒表面蛋白不僅僅是病毒顆粒的一部分。它們來(lái)源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后/高爾基體前的膜31，未經(jīng)核衣殼的包裹，進(jìn)入囊狀結(jié)構(gòu)的管腔，最后以分泌方式得以釋放。這些亞病毒顆粒直徑為20nm，呈八面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)32。此外，亞病毒顆粒還可形成長(zhǎng)度不等的絲（管）狀結(jié)構(gòu)（圖1）。與病毒顆粒相比較，亞病毒顆粒過(guò)度增殖。在感染乙肝病毒的病人血清中，可發(fā)現(xiàn)亞病

13、毒顆粒與病毒顆粒之比超過(guò)10000。亞病毒顆粒與病毒生命周期的關(guān)聯(lián)性還不清楚。這些顆?？赡芨蓴_宿主的免疫系統(tǒng)或者促進(jìn)感染過(guò)程33。詳細(xì)分析顯示乙肝病毒亞病毒顆粒是通過(guò)S蛋白的自我裝配形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔內(nèi)的分枝絲狀體而生成的。接下來(lái)，這些長(zhǎng)的絲狀體折疊交聯(lián)打包形成晶體狀結(jié)構(gòu)，然后由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的小囊泡運(yùn)送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基中間腔（ERGIC）。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基中間腔中，這些絲狀體得以拆解和釋放。由于它們的尺寸問(wèn)題，通過(guò)分泌通路的進(jìn)一步運(yùn)輸或許會(huì)受到限制。因此，這些絲狀體需要轉(zhuǎn)換成為球形顆粒。小的分枝絲狀體可由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔中的乙肝病毒大蛋白生成，但這些絲狀體沒(méi)有打包進(jìn)入運(yùn)輸小囊泡，這可以解釋細(xì)胞內(nèi)大蛋白駐留

14、的現(xiàn)象34。2.2 核衣殼乙肝病毒核衣殼由核心抗原構(gòu)成，而核心抗原在不同基因型之間相對(duì)保守35。核心抗原根據(jù)基因型不同包含183個(gè)或185個(gè)氨基酸，核心抗原的基本序列可分為兩部分：1）N末端的149個(gè)或151個(gè)氨基酸（取決于基因型的不同）足夠完成衣殼的自我裝配，這部分稱為裝配區(qū)域；2）C末端的34個(gè)氨基酸被標(biāo)定為魚精蛋白區(qū)，其富含精氨酸殘基，而這些殘基使此區(qū)域帶一個(gè)單位的正電荷，這一區(qū)域?qū)τ谇盎蚪M/乙肝病毒-多聚酶復(fù)合物的包裝至關(guān)重要36, 37。核心抗原可在原核與真核表達(dá)系統(tǒng)中過(guò)度增值，并在這些系統(tǒng)中裝配成為衣殼顆粒38。衣殼裝配的起始伴隨著核心抗原二聚體的形成，二聚體之間通過(guò)第61位的半

15、胱氨酸之間的二硫鍵連接39-41。衣殼的裝配可不依賴于細(xì)胞因子在體外進(jìn)行42, 43?？刂萍兓蟮暮诵目乖垠w裝配的關(guān)鍵因素是核心抗原二聚體的濃度和緩沖液的成分42。在病毒生命周期過(guò)程中，多聚酶與病毒前基因組的結(jié)合起始了衣殼的形成，但這一過(guò)程受控于一些細(xì)胞因子，如：侶伴蛋白和激酶44-49。除此之外，有些報(bào)道描述了蛋白激酶C結(jié)合進(jìn)入乙肝病毒衣殼中的現(xiàn)象50。最近的一篇報(bào)道揭示了裝配區(qū)域中第106位絲氨酸的蛋白激酶C依賴性磷酸化與裝配核增多之間的聯(lián)系。此外，盡管衣殼中螺旋含量的比例有所降低，但發(fā)生在第106位絲氨酸處的磷酸化作用不僅促進(jìn)了衣殼裝配，似乎也提高了裝配核的穩(wěn)定性51。這些因素或許可

16、降低衣殼生成所需的閾值濃度。原則上，核心抗原二聚體可裝配成為兩種不同類型的顆粒：一方面，直徑為30nm的顆粒由90個(gè)核心抗原二聚體構(gòu)成，呈現(xiàn)出T=3對(duì)稱性；另一方面，直徑為34nm的較大顆粒由120個(gè)二聚體裝配，呈現(xiàn)出T=4對(duì)稱性52。盡管兩種形式的顆粒在核心抗原生成系統(tǒng)中均存在，但在傳染性的病毒顆粒中主要是T=4衣殼，T=3衣殼僅存在于10%的病毒顆粒中12。根據(jù)冷凍電子顯微鏡技術(shù)53, 54和衣殼的結(jié)晶化分析43, 55，可以詳細(xì)剖析衣殼的結(jié)構(gòu)。衣殼最顯著的特點(diǎn)就是兩側(cè)有小孔分布的表面刺突。每一刺突可分布于兩種不同的環(huán)境中，這兩個(gè)環(huán)境既可以是兩個(gè)六邊形的一部分，也可以是一個(gè)六邊形和一個(gè)五邊

17、形的一部分。刺突由核心二聚體構(gòu)成。來(lái)自每一個(gè)亞單位的兩個(gè)逆平行螺旋，由第78位至第83位氨基酸之間的短回路連接，聯(lián)合成為四螺旋束43, 53-55。連接螺旋的環(huán)形成了刺突尖端，代表著衣殼抗原主要表位。裝配的衣殼既不是一個(gè)致密外殼，也不是一個(gè)堅(jiān)硬不可彎曲的顆粒。RNA前基因組轉(zhuǎn)化為DNA基因組需要將核衣殼輸送進(jìn)入衣殼腔。衣殼外殼上分布有小孔，直徑位于12埃-15埃（2 Å - 15 Å）之間。這些小孔可以使小分子自由擴(kuò)散進(jìn)出衣殼腔56-58。外部序列可嵌入位于第78位至第81位氨基酸之間的刺突尖端，而且不會(huì)影響形成衣殼的能力59-60。上述觀察現(xiàn)象表明衣殼結(jié)構(gòu)既具有高度的穩(wěn)定

18、性，又具有極佳的柔韌性56, 61。來(lái)自外部的對(duì)構(gòu)象變化的誘導(dǎo)，伴隨著內(nèi)部衣殼組織結(jié)構(gòu)的變化56。衣殼腔與表面之間的這種構(gòu)象聯(lián)系，或許與在RNA前基因組轉(zhuǎn)化為成熟DNA基因組的過(guò)程中對(duì)衣殼成熟的控制有關(guān)57, 58, 62。影響核衣殼的形成可能是控制乙肝病毒感染的一種替代性治療方法。最近發(fā)現(xiàn)異芳基二氫嘧啶（heteraryldihydropyrimidine, HAP）Bay 41-4109以一種針對(duì)核心抗原的方式發(fā)揮作用，因此可抑制病毒復(fù)制63。一份更詳細(xì)的分析顯示Bay 41-4109可加速并錯(cuò)誤指導(dǎo)衣殼裝配64。依據(jù)Bay 41-4109與二聚體的比例不同，Bay 41-4109可發(fā)揮穩(wěn)

19、定效應(yīng)（Bay 41-4109與二聚體的比值達(dá)到1：2），也可發(fā)揮破壞穩(wěn)定作用，生成大的非衣殼HBcAg凝聚物（Bay41-4109與二聚體之比達(dá)1：1或更大）64-66。從這些數(shù)據(jù)可以得到以下結(jié)論：濃度較低時(shí)，Bay41-4109通過(guò)誘導(dǎo)不恰當(dāng)?shù)囊職ぱb配影響病毒復(fù)制，而在濃度較高時(shí)，通過(guò)錯(cuò)誤指導(dǎo)從衣殼形成到大HBcAg凝聚物形成過(guò)程中的裝配影響病毒復(fù)制。3. 感染過(guò)程3.1 粘附根據(jù)病毒感染的一般概念，第一步是病毒顆粒以能量非依賴型的方式粘附到宿主細(xì)胞表面的某一結(jié)構(gòu)上。首次粘附的特點(diǎn)是親合性和可逆性較低。首次粘附之后，病毒顆粒轉(zhuǎn)移到一個(gè)更特殊的受體。就有包膜病毒而言，與受體結(jié)合之后通常是融合

20、步驟，可發(fā)生在細(xì)胞膜，也可發(fā)生在內(nèi)涵體間隔67。目前，乙肝病毒生命周期中最初步驟的許多方面仍不為人所知。然而，近年來(lái)，基于不同體外感染系統(tǒng)的建立，在這方面已取得了顯著進(jìn)展。3.2 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)人類原代肝細(xì)胞（PHH）是研究乙肝病毒感染的經(jīng)典體外感染系統(tǒng)68, 69。這些細(xì)胞的主要缺陷在于不易獲得且不同供體之間差異較大。除此之外，感染效率較低導(dǎo)致獲得的感染細(xì)胞極少70，71。樹(shù)鼩（Tupaia belangeri）原代肝細(xì)胞（PTH）是另一種可供選擇的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)72。樹(shù)鼩原代肝細(xì)胞更易獲得且不同制備品之間的差異較小。樹(shù)鼩原代肝細(xì)胞的可感染性與人類原代肝細(xì)胞相當(dāng)。然而，與人類原代肝細(xì)胞不同的是，樹(shù)鼩

21、原代肝細(xì)胞除能被人類乙肝病毒感染外，還可被羊毛猴乙肝病毒感染73，74。使用樹(shù)鼩原代肝細(xì)胞作為感染模型，不足之處在于這種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)缺乏特征性，許多鼠類或人類靶標(biāo)特異性的抗血清與相應(yīng)樹(shù)鼩蛋白之間的交叉反應(yīng)情況目前尚不明確。基于這個(gè)原因，還是希望獲得能夠感染乙肝病毒的人類肝細(xì)胞系。就人類肝細(xì)胞系HepG2而言，盡管已有許多報(bào)道描述了乙肝病毒的特異性結(jié)合和提呈75-78。然而，僅有兩篇文獻(xiàn)報(bào)道了成功的HepG2感染，且在實(shí)驗(yàn)中均在細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入了二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide, DMSO，譯者注一種有機(jī)液體試劑，可增加細(xì)胞膜的通透性。）和脫氧氮胞苷（5-aza-2deox

22、ycytidine，譯者注一種抗腫瘤藥）76，79。有報(bào)道稱，從一例女性丙肝陽(yáng)性的肝癌患者身上提取并建立了的一種新型肝細(xì)胞系HepaRG，這種細(xì)胞系經(jīng)二甲基亞砜和皮質(zhì)醇（hydrocortisone，譯者注副腎荷爾蒙中的一種；）分化后易感染乙肝病毒80，并使乙肝病毒感染的穩(wěn)定重現(xiàn)成為可能。在活動(dòng)性感染（譯者注productive infection，也稱產(chǎn)毒型感染，是指病毒可在宿主體內(nèi)完成復(fù)制，并擴(kuò)散；與其對(duì)應(yīng)的是潛伏型感染latent infection或非產(chǎn)毒性感染，是指病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，沒(méi)有子代病毒產(chǎn)生，也不引起宿主細(xì)胞病變，但受感染的細(xì)胞內(nèi)有病毒 DNA存在。）分析中面臨的一個(gè)普遍問(wèn)

23、題是區(qū)分輸入與重新合成的病毒或亞病毒顆粒。乙肝病毒活動(dòng)性感染的一個(gè)明確標(biāo)志物是共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的形成（參見(jiàn)最近的一篇綜述文獻(xiàn)81）。共價(jià)閉合環(huán)狀DNA可通過(guò)DNA印跡法（譯者注Southern blotting索瑟恩印跡：由E.M. Southern發(fā)明并以其名字命名的用于檢測(cè)DNA混合片段中特殊順序的技術(shù)，亦稱為DNA印跡法；）或?qū)崟r(shí)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，其中實(shí)時(shí)PCR僅對(duì)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，而對(duì)其它病毒DNA則不進(jìn)行擴(kuò)增82。在感染的樹(shù)鼩原代肝細(xì)胞和人類原代肝細(xì)胞中可檢測(cè)到共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，而對(duì)于HepaRG細(xì)胞而言卻似乎檢測(cè)不到共價(jià)閉合環(huán)狀DNA83。病毒

24、mRNA檢測(cè)方法的出現(xiàn)為區(qū)分是輸入還是重新合成的病毒提供了新的選擇。由于經(jīng)歷濃縮過(guò)程之后病毒接種物中已經(jīng)不存在HBeAg了，因而接種濃縮或純化的病毒時(shí)，乙肝病毒e抗原是酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)的一種很好的靶標(biāo)。乙肝病毒表面抗原的檢測(cè)靈敏度高于e抗原，但必需進(jìn)行反復(fù)的細(xì)胞清洗84。3.3 病毒-細(xì)胞相互作用一般認(rèn)為乙肝病毒感染是一個(gè)多級(jí)的過(guò)程。盡管對(duì)鴨乙肝病毒系統(tǒng)而言，肝素或硫酸葡聚糖對(duì)感染過(guò)程沒(méi)有影響85，但對(duì)乙肝病毒來(lái)說(shuō)，有報(bào)道稱乙肝病毒感染中最初的粘附過(guò)程與粘附受體之間存在相關(guān)性，此受體正是與肝細(xì)胞相關(guān)的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulphate proteoglycan）的碳水化合

25、物側(cè)鏈86，87。這種相互作用啟動(dòng)了乙肝病毒的多級(jí)侵入過(guò)程，隨后是介導(dǎo)乙肝病毒提呈的的高親合性步驟，但其具體機(jī)理還不為人知。“乙肝病毒受體”或乙肝病毒結(jié)合配體的鑒定是乙肝病毒生物學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的開(kāi)放性問(wèn)題。可與乙肝病毒結(jié)合的蛋白數(shù)量越來(lái)越多，但沒(méi)有令人信服的證據(jù)表明這些潛在的結(jié)合因子在感染過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用（參見(jiàn)文獻(xiàn)88）。盡管人們對(duì)于介導(dǎo)病毒結(jié)合和侵入的細(xì)胞結(jié)構(gòu)了解不多，但對(duì)于與結(jié)合和侵入有關(guān)的病毒結(jié)構(gòu)了解較多。有關(guān)病毒與肝細(xì)胞結(jié)合先決條件的描述中具有里程碑意義的是1986年Neurath等人的觀察結(jié)果75。Neurath及其同事報(bào)道的觀察結(jié)果如下：一個(gè)短的包含前S1區(qū)第21位

26、至第47位氨基酸（對(duì)應(yīng)于基因型D，E，G的第10位至第36位氨基酸）的表面蛋白片段與HepG2細(xì)胞結(jié)合，并最終完成乙肝病毒與這些細(xì)胞的結(jié)合。與此研究結(jié)果相一致的是，已發(fā)現(xiàn)乙肝病毒前S1區(qū)第3位至第77位氨基酸對(duì)于病毒的感染性至關(guān)重要89。Paran等人鑒定了一種QLDAPF基序（對(duì)應(yīng)于第18位至第25位氨基酸），此基序是乙肝病毒結(jié)合的重要區(qū)域76。乙肝病毒感染的又一個(gè)結(jié)構(gòu)性先決條件是發(fā)生在前S1區(qū)第二位甘氨酸上的豆蔻酰基化18，19。已觀察到一個(gè)豆蔻?；那癝1區(qū)肽段較之無(wú)豆蔻?；那癝1區(qū)，對(duì)以HepG2細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞膜具有更強(qiáng)的結(jié)合性90。詳細(xì)的研究表明，包含前S1區(qū)N末端部分的酰化肽

27、段可有效地抑制了乙肝病毒和丁肝病毒的感染91-94。一個(gè)重要參數(shù)是N末端?；鶜埢氖杷浴Ｒ种颇芰Φ奶岣吲c脂肪酸鏈長(zhǎng)的增加有關(guān)。戊基（C5）不如癸基（C10）有效，而癸基又不如豆蔻?；?十四酰基（C14）有效。就肽段序列而言，第1位至第8位殘基與第19位至第28位殘基對(duì)于抑制作用并不重要；但是，第9位至第18位氨基酸殘基卻發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。與此相對(duì)應(yīng)，在前S1區(qū)第9位至第18位氨基酸之間發(fā)生突變的重組體乙肝病毒不具有傳染性91。這些肽段發(fā)揮抑制作用的機(jī)制目前尚不明了。8nM為極低的半抑制濃度（IC50），但即使是這種低濃度的肽段，而且是在病毒粘附已經(jīng)發(fā)生后再加入，仍然發(fā)揮了有效的抑制作用。

28、這完全不同于簡(jiǎn)單的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。除此之外，在肽段結(jié)合的特異性以及各個(gè)細(xì)胞對(duì)乙肝病毒感染的易感性之間不存在明顯的相關(guān)性。在尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）免疫缺陷型小鼠身上注入人類原代肝細(xì)胞和樹(shù)鼩原代肝細(xì)胞后，分析這些肽段的生物分布。結(jié)果顯示，大蛋白乙酰化肽段在肝臟中發(fā)生積累，但并未優(yōu)先結(jié)合輸入的人類原代肝細(xì)胞或樹(shù)鼩原代肝細(xì)胞 95。由此可以推斷，這些大蛋白的肽段通過(guò)干擾調(diào)節(jié)乙肝病毒感染的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)或早期階段的侵入后步驟抑制病毒感染。盡管前S1區(qū)包含主要的細(xì)胞粘附抗原表位，但有報(bào)道稱在前S1區(qū)外也有抗原表位，它們也參與乙肝病毒-細(xì)胞粘附過(guò)程。Paran等人描述了在S區(qū)存在次級(jí)粘附位點(diǎn)7

29、6。此外，識(shí)別前S2區(qū)或S區(qū)內(nèi)抗原表位的抗體對(duì)感染具有抑制作用96。但是，這些抗體是通過(guò)直接遮蓋乙肝病毒-細(xì)胞粘附的重要序列發(fā)揮作用，還是它們的結(jié)合可發(fā)揮間隔物作用，從而阻礙病毒和細(xì)胞表面之間的緊密接觸，目前還不清楚。另外，可能存在對(duì)侵入后步驟的干擾。來(lái)自鴨乙肝病毒系統(tǒng)的數(shù)據(jù)顯示，嗜肝DNA病毒科病毒的吞入由細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程實(shí)現(xiàn)97-99。并觀察到鴨乙肝病毒顆粒與熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白一起進(jìn)入了內(nèi)涵體間隔100。此外，有證據(jù)顯示，抑制空泡質(zhì)子三磷酸腺苷酶的巴弗洛霉素A1（譯者注bafilomycin A1屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有抗革蘭陽(yáng)性細(xì)菌和真菌的活性；有免疫抑制活性，并且是空泡質(zhì)子三磷酸腺苷酶的

30、第一個(gè)有效的特異性抑制劑。）對(duì)感染有消弱作用。3.4侵入與將核衣殼釋放入細(xì)胞質(zhì)乙肝病毒的活動(dòng)性感染需要將基因組輸送至細(xì)胞核81。由此而引發(fā)的問(wèn)題涉及病毒/核衣殼侵入細(xì)胞以及隨后的基因組向細(xì)胞核內(nèi)的輸送。與表面包含I型融合蛋白的病毒不同，乙肝病毒不具備經(jīng)典的融合肽序列67, 101, 102。最近的一篇報(bào)道把融合因子的功能歸因于乙肝病毒的前S1區(qū)103。在序列分析基礎(chǔ)之上，Rodriguez-Crespo等人認(rèn)為，S區(qū)（第1位至第23位氨基酸）的N末端，包括跨膜區(qū)1（TM1），或許發(fā)揮融合因子序列的作用104。這種假說(shuō)得到下述觀察現(xiàn)象的支持，具有S區(qū)序列第7位氨基酸至第18位氨基酸的流感病毒嵌合

31、體融合蛋白（血凝素），顯示了明顯的半融合活性101。此外，經(jīng)低pH處理的鴨乙肝病毒亞病毒顆粒在表面暴露出疏水區(qū)域，而這一疏水區(qū)域可以介導(dǎo)細(xì)胞膜接觸105。進(jìn)一步的分析顯示鴨乙肝病毒大蛋白（而非S蛋白）中跨膜區(qū)1疏水性的降低導(dǎo)致感染性的消失。此外，對(duì)應(yīng)于跨膜區(qū)1的合成肽的體外實(shí)驗(yàn)表明，磷脂小囊泡的積聚和脂質(zhì)混合離不開(kāi)跨膜區(qū)1的疏水特性100, 105。盡管這些數(shù)據(jù)顯示跨膜區(qū)1可發(fā)揮融合因子序列的作用，但迄今為止，沒(méi)有直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明乙肝病毒侵入過(guò)程中跨膜區(qū)1與宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合。對(duì)于ayw基因型的乙肝病毒而言，其前S2區(qū)在第41位與第52位氨基酸之間包含一個(gè)膜透過(guò)性肽段，這個(gè)肽段被稱為易位基序

32、（TLM）。易位基序在所有嗜肝DNA病毒科中保守存在106。易位基序?qū)儆谀ね高^(guò)性肽家族。易位基序與其它肽段或蛋白的融合使得穿經(jīng)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的易位得以實(shí)現(xiàn)，而且此易位過(guò)程與能量和受體無(wú)關(guān)30, 106-109。易位基序作為一種膜透過(guò)性肽段，其功能取決于親水性與疏水性氨基酸的特定構(gòu)成模式，不同的構(gòu)成模式使得易位基序可形成性質(zhì)異變的兼性螺旋17，106。（譯者注相同序列的肽段，構(gòu)象不同時(shí)可表現(xiàn)為完全不同的親水性或疏水性，這與親水性或疏水性氨基酸的暴露有關(guān)。）易位基序與乙肝病毒核心抗原的融合表明，裝配完全且在表面得到易位基序-肽段修飾的核衣殼能夠穿過(guò)細(xì)胞膜并把包裝好的核酸輸送至細(xì)胞核108。這些數(shù)

33、據(jù)顯示，即使其他種類的顆粒只要其表面具有易位基序肽段，便也可穿過(guò)細(xì)胞膜。在此基礎(chǔ)之上，可進(jìn)一步分析易位基序肽段是否在應(yīng)用鴨乙肝病毒系統(tǒng)的乙肝病毒侵入過(guò)程中也發(fā)揮作用。與乙肝病毒不同，鴨乙肝病毒在preS區(qū)包含兩個(gè)易位基序。感染實(shí)驗(yàn)表明，只要其中一個(gè)易位基序被破壞，病毒的感染性便會(huì)消失99。更詳細(xì)的分析顯示，易位基序缺陷型鴨乙肝病毒顆粒仍然能與細(xì)胞結(jié)合，并能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)吞路徑，但最終易位基序缺陷型突變體只能在內(nèi)涵體間隔中積聚（而無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核）。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究顯示，在內(nèi)涵體間隔中發(fā)生了針對(duì)內(nèi)吞病毒顆粒的蛋白水解過(guò)程，并最終導(dǎo)致易位基序肽段的暴露?？梢缘贸鲆韵陆Y(jié)論，由于胞內(nèi)蛋白水解過(guò)程，裸露的易

34、位基序使得穿經(jīng)胞內(nèi)膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)成為可能。在細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)蛋白水解過(guò)程處理的被膜從核衣殼中分離出來(lái)。通過(guò)與胞內(nèi)溶菌產(chǎn)物預(yù)孵育，已經(jīng)被蛋白水解處理過(guò)的乙肝病毒與鴨乙肝病毒顆粒，顯示出了穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)行易位的能力。將HepG2細(xì)胞與經(jīng)蛋白水解處理的乙肝病毒或LMH同孵育，可使HepG2細(xì)胞發(fā)生活動(dòng)性感染，而未經(jīng)處理的病毒無(wú)法感染這些細(xì)胞99。根據(jù)這些數(shù)據(jù)可以推論，嗜肝DNA病毒科不是通過(guò)融合過(guò)程運(yùn)送核衣殼進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而是依賴于一種全新的建立在膜易位基礎(chǔ)上的機(jī)制99。但是，已有文獻(xiàn)對(duì)此模型提出異議，認(rèn)為：丁肝病毒的侵入就不依賴與易位基序的作用110，111，而乙肝病毒中易位基序的突變或缺失似乎不影響它的感

35、染性110, 112。然而，最近的數(shù)據(jù)對(duì)丁肝病毒是否是研究乙肝病毒侵入的合適模型系統(tǒng)提出了疑問(wèn)。盡管包含旱獺包膜蛋白的嵌合體顆粒不能感染人類原代肝細(xì)胞，但由旱獺肝炎病毒包膜蛋白裝配的重組體丁肝病毒可感染人類原代肝細(xì)胞，這表明丁肝病毒和乙肝病毒的侵入過(guò)程之間存在顯著差異113。對(duì)易位基序突變的乙肝病毒進(jìn)行的詳細(xì)分析112顯示，由于易位基序C末端或N末端部分的局部缺失，一種新功能的易位基序得以生成。然而，這種點(diǎn)突變將易位基序的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的折疊片，由此造成的對(duì)易位基序的破壞導(dǎo)致對(duì)人類原代肝細(xì)胞的感染性完全消失（E.Hildt未發(fā)的表研究結(jié)果）。3.5 基因組輸入細(xì)胞核成熟核衣殼114的脂轉(zhuǎn)染或膜

36、滲透性核衣殼對(duì)人類原代肝細(xì)胞以及肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染108顯示，核衣殼通過(guò)定向轉(zhuǎn)運(yùn)朝細(xì)胞核移動(dòng)。這一點(diǎn)可由細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸動(dòng)力學(xué)推斷獲得115。核衣殼進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)之后的核周積聚可在15分鐘內(nèi)觀察到，而一個(gè)基于擴(kuò)散的過(guò)程將耗時(shí)超過(guò)1小時(shí)116。在核衣殼的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮主要作用的是微管系統(tǒng)114。關(guān)于肌動(dòng)蛋白絲與核衣殼胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)性的問(wèn)題，以引發(fā)了一些的爭(zhēng)論 108, 117。有效病毒感染需要將乙肝病毒基因組輸送進(jìn)細(xì)胞核，并在其中轉(zhuǎn)換為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（參見(jiàn)文獻(xiàn)81）。對(duì)于病毒基因組輸入細(xì)胞核是否與乙肝病毒核心抗原之間存在關(guān)聯(lián)尚存在疑問(wèn)。由于可獲得的感染系統(tǒng)的感染效率有限，且最終釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的核衣殼數(shù)量較

37、少，因而對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行探討較為困難。研究此問(wèn)題的一個(gè)方法是借助經(jīng)洋地黃皂苷透化處理的細(xì)胞，將透化處理后的細(xì)胞立即與核衣殼混合118?；谶@種實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，可觀察到核心顆粒與核膜孔復(fù)合體的磷酸化依賴型結(jié)合 119。作者在先前的研究中觀察到，蛋白激酶C通過(guò)殼體化作用可進(jìn)入核心顆粒50，因此作者假定殼體化的蛋白激酶C可使核心蛋白中C末端絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化，并產(chǎn)生成熟的磷酸化的子代核心顆粒。但是，這種假設(shè)似乎與最近的觀察到得現(xiàn)象相反，最近研究發(fā)現(xiàn)乙肝病毒衣殼成熟與分步脫磷酸化作用有關(guān)聯(lián)58, 62。這個(gè)課題組的深入研究發(fā)現(xiàn)，不成熟的衣殼到達(dá)核膜孔復(fù)合體的籃狀細(xì)胞，但并不釋放衣殼蛋白或不成熟基因組進(jìn)入核原生

38、質(zhì)。就成熟衣殼而言，可觀察到乙肝病毒核心抗原的核內(nèi)染色120。然而，洋地黃皂苷透化過(guò)程影響了細(xì)胞的完整性。透化作用殺死了細(xì)胞并造成細(xì)胞蛋白的丟失。痕量的洋地黃皂苷或許會(huì)影響核衣殼的穩(wěn)定性。此外，經(jīng)篩選的抗血清（Dako HBcAg，譯者注該抗血清是使用丹麥Dako公司的乙肝病毒核心抗原制備而成的。）可檢測(cè)到核心抗原二聚體和完全裝配的顆粒。因此，無(wú)法承認(rèn)裝配顆粒已易位進(jìn)入細(xì)胞核的結(jié)論。顯微注射核衣殼進(jìn)入非洲爪蛙卵母細(xì)胞后的電子顯微鏡數(shù)據(jù)顯示，在此系統(tǒng)中，衣殼通過(guò)核膜孔進(jìn)入核籃狀細(xì)胞。但是，已發(fā)現(xiàn)即便是不成熟的核衣殼也可進(jìn)入核籃狀細(xì)胞121。因此推測(cè)僅能發(fā)生成熟核衣殼的解聚，并最終導(dǎo)致與多聚酶連接

39、的病毒基因組釋放進(jìn)入核籃狀細(xì)胞。 最近的一篇報(bào)道描述了一種可將基因轉(zhuǎn)入肝細(xì)胞的有效系統(tǒng)，該系統(tǒng)是基于細(xì)胞透過(guò)型核衣殼108。易位基序肽段106與乙肝病毒核心抗原的融合使得核衣殼具有了細(xì)胞滲透性。易位基序肽段-乙肝病毒核心抗原二聚體裝配成為二十面體結(jié)構(gòu)的衣殼。這一肽段可以使一些物質(zhì)（與易位基序融合的蛋白或或肽段）的受體非依賴型易位得以穿過(guò)細(xì)胞膜，同時(shí)又不影響細(xì)胞的完整性30,107,122。這些易位基序-核衣殼作為完全裝配的顆粒穿過(guò)細(xì)胞膜，且不影響細(xì)胞完整性。最終，乙肝病毒基因組或其包裝后進(jìn)入易位基序-核衣殼的衍生物得到有效表達(dá)，這表明發(fā)生了有效的輸送，并以包裝基因組的表達(dá)為終點(diǎn)108。采用這種

40、系統(tǒng)與一種可選擇性識(shí)別完全裝配的核衣殼的抗體（mab 3120），雖然無(wú)法獲得核衣殼核酸輸入的證據(jù)，但可觀察到核周積聚。如果核衣殼的分解不在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生，與多聚酶連接的病毒基因組則會(huì)由于太大以至于無(wú)法自由擴(kuò)散通過(guò)核膜孔復(fù)合體，此時(shí)必須經(jīng)主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞核。其中一種可能（的主動(dòng)運(yùn)輸方式）與擁有核酸結(jié)合區(qū)和核定位信號(hào)（NLS）序列的乙肝病毒核心抗原二聚體有關(guān)53。另一種可能（的主動(dòng)運(yùn)輸方式）是多聚酶調(diào)節(jié)病毒基因組的最終輸入。多聚酶-DNA復(fù)合體有效輸送進(jìn)入細(xì)胞核的觀察結(jié)果可支持這一觀點(diǎn)。然而，病毒基因組的去蛋白作用造成細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的滯留118。最近，有研究顯示乙肝病毒多聚酶的6-硫代嘌呤（TP）區(qū)包含

41、對(duì)乙肝病毒感染至關(guān)重要的功能性二連核定位信號(hào)124。3.6 復(fù)制 開(kāi)環(huán)DNA到cccDNA的轉(zhuǎn)換病毒侵入過(guò)程結(jié)束時(shí)，病毒基因組被輸送進(jìn)入細(xì)胞核。在這一階段病毒基因組作為松環(huán)DNA存在。開(kāi)環(huán)DNA由一條完整的負(fù)DNA鏈和一條不完整的正DNA鏈構(gòu)成，負(fù)DNA鏈在5末端與病毒多聚酶P共價(jià)連接，正DNA鏈在其5末端有一個(gè)RNA寡核苷酸，這個(gè)RNA寡核苷酸可作為正鏈合成的引發(fā)劑。要實(shí)現(xiàn)病毒感染，病毒基因組必須在感染細(xì)胞內(nèi)以一種穩(wěn)定的形式存在。就乙肝病毒而言，病毒開(kāi)環(huán)DNA轉(zhuǎn)換為一種核游離基因型的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，它在病毒復(fù)制中代表重要的胞內(nèi)中間體，同時(shí)也作為成功實(shí)現(xiàn)感染的實(shí)驗(yàn)標(biāo)志物125,126。就基

42、因組擴(kuò)征以及共價(jià)閉合環(huán)狀DNA形成而言，較短的正DNA鏈必須完整，兩條鏈需要共價(jià)連接，而且必須清除阻礙性的末端修飾。關(guān)于病毒多聚酶和RNA引物是如何分別從負(fù)DNA鏈與正DNA鏈上得到清除，目前尚不完全明了。兩項(xiàng)獨(dú)立研究發(fā)現(xiàn)了一種無(wú)蛋白的開(kāi)環(huán)DNA，它包含作為殼體化開(kāi)環(huán)DNA的相同的核苷酸序列，但多聚酶不再與負(fù)DNA鏈結(jié)合，或許多聚酶只是在共價(jià)閉合環(huán)狀DNA形成過(guò)程中擔(dān)當(dāng)中間產(chǎn)物127,128。使用樹(shù)鼩原代肝細(xì)胞進(jìn)行的感染實(shí)驗(yàn)表明，阻斷病毒多聚酶的逆轉(zhuǎn)錄酶活性，將大大減少共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的形成73,74。此外，最近的體外實(shí)驗(yàn)顯示，DDX3 DEAD-Box RNA解螺旋酶結(jié)合進(jìn)入核衣殼將抑制逆

43、轉(zhuǎn)錄作用，并進(jìn)一步導(dǎo)致雙線性化DNA水平的下降129。將這些研究結(jié)果予以匯總可以發(fā)現(xiàn)，P蛋白在正DNA鏈完整化中發(fā)揮作用。然而，共價(jià)閉合環(huán)狀DNA生成的詳細(xì)過(guò)程仍不清楚，需要進(jìn)一步的研究。 cccDNA 轉(zhuǎn)錄成為前基因組RNA轉(zhuǎn)錄核共價(jià)閉合環(huán)狀DNA作為前基因組RNA合成的模板。前基因組RNA是指病毒復(fù)制的RNA中間體或其它一些亞基因組RNA。雙順?lè)醋忧盎蚪MRNA在病毒生命周期中有兩個(gè)主要作用：首先，它是翻譯和逆轉(zhuǎn)錄模板，前基因組RNA是一種超長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物，包含正向重復(fù)序列1的二次拷貝、信號(hào)以及聚腺苷酸尾巴，可作為一種90kDa病毒多聚酶、21kDa核心蛋白以及一種24kDa前體早期抗原翻譯的轉(zhuǎn)

44、錄物；其次，它是病毒負(fù)DNA鏈逆轉(zhuǎn)錄模板，因此與病毒復(fù)制無(wú)關(guān)。除了前基因組RNA外還有三種額外的亞基因組RNA，分別編碼表面蛋白（2.4kb RNA和2.1kb RNA）和HBx蛋白(0.7kb RNA）81,130。所有嗜肝DNA病毒科的RNA轉(zhuǎn)錄均由宿主細(xì)胞多聚酶II處理。除野生型RNA以外，剪接變體RNA被翻譯成為乙肝病毒剪接生成蛋白，并通過(guò)殼體化成為缺陷型病毒顆粒131。 逆轉(zhuǎn)錄乙型肝炎病毒和其它嗜肝DNA病毒科成員均使用前基因組RNA作為逆轉(zhuǎn)錄時(shí)的復(fù)制中間產(chǎn)物。首先，前基因組RNA-多聚酶復(fù)合體在裝配衣殼的管腔內(nèi)包裝，而病毒多聚酶與殼體化信號(hào)結(jié)合，此信號(hào)是前基因組RNA上的順式元件。

45、然而，信號(hào)和多聚酶是如何發(fā)生相互作用的目前還不十分清楚，但推測(cè)認(rèn)為它在核心蛋白同型二聚體的招募過(guò)程中發(fā)揮作用，并最終通過(guò)自我裝配導(dǎo)致衣殼形成。除了啟動(dòng)前基因組RNA多聚酶的殼體化外，信號(hào)與多聚酶相互作用也誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄，借此首先合成負(fù)DNA鏈，繼而生成正DNA鏈，最終形成開(kāi)環(huán)DNA。蛋白質(zhì)引發(fā)機(jī)制對(duì)DNA合成的啟動(dòng)至關(guān)重要。與多聚酶共價(jià)連接的較短DNA寡核苷酸與信號(hào)結(jié)合并啟動(dòng)負(fù)DNA鏈合成。除這兩個(gè)因素之外，幾篇報(bào)道均認(rèn)為核心蛋白對(duì)逆轉(zhuǎn)錄也是至關(guān)重要的，這幾篇報(bào)道還明確指出，核心蛋白C末端裝配區(qū)域的缺失或修飾將導(dǎo)致缺損DNA合成39,132-134。成熟后被分泌的乙肝病毒顆粒已經(jīng)完成逆轉(zhuǎn)錄，此過(guò)程

46、在完整的核衣殼內(nèi)發(fā)生且僅涉及DNA。在DNA基因組合成之后，核衣殼可繼續(xù)病毒生命周期并與包膜蛋白發(fā)生相互作用135,136并作為感染性病毒顆粒分泌出去137，此外也可將開(kāi)環(huán)DNA再次輸送至細(xì)胞核并在其內(nèi)建立共價(jià)閉合環(huán)狀DNA池138。4. 病毒顆粒組裝4.1 衣殼成熟RNA前基因組、乙肝病毒多聚酶和乙肝病毒核心抗原二聚體復(fù)合物形成之后，乙肝病毒核衣殼開(kāi)始形成44,47。核衣殼裝配完成后，RNA轉(zhuǎn)換為單鏈DNA，接著轉(zhuǎn)換為部分雙鏈DNA（詳見(jiàn)文獻(xiàn)81）。與從被分泌的病毒中分離出來(lái)且僅包含成熟的部分雙鏈DNA的核衣殼不同，細(xì)胞內(nèi)核衣殼顯示了病毒DNA合成的所有不同階段。根據(jù)這些觀察結(jié)果，可以斷定早

47、期的包含RNA的衣殼（未成熟的核衣殼）沒(méi)有合并進(jìn)入病毒顆粒139。由此引出的問(wèn)題是，與衣殼成熟作用有關(guān)聯(lián)的衣殼結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化，是否可以根據(jù)這種變化區(qū)分未成熟和成熟核衣殼。就鴨乙肝病毒和乙肝病毒而言，有報(bào)道稱多聚酶的突變破壞了逆轉(zhuǎn)錄酶活性，導(dǎo)致未經(jīng)包裝的不成熟核衣殼積聚140, 141。根據(jù)鴨乙肝病毒系統(tǒng)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，核衣殼的包裝發(fā)生在復(fù)制周期的晚期階段140。詳細(xì)分析顯示衣殼成熟與核衣殼脫磷酸化有關(guān)（圖3）。有效的RNA包裝需要發(fā)生磷酸化作用。就乙肝病毒而言，已有證據(jù)顯示位于C末端區(qū)域的三個(gè)絲氨酸-脯氨酸-殘基（第155位、第162位、第170位的絲氨酸）可發(fā)生磷酸化142。基于HepG

48、2細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步分析顯示，乙肝病毒核心蛋白中的第162位絲氨酸是乙肝病毒RNA殼體化的充分必要條件。但是，乙肝病毒DNA復(fù)制中間體的生成既需要第162位的絲氨酸，也需要第170位的絲氨酸。核心的第155位絲氨酸對(duì)于開(kāi)環(huán)DNA中間體的形成至關(guān)重要。絲氨酸轉(zhuǎn)化為丙氨酸造成了對(duì)這些磷酸化位點(diǎn)的破壞，并最終導(dǎo)致這些未含有效數(shù)量DNA的核衣殼的核積聚。有研究推測(cè)，HBx在不同程度上支持在這些殘基上發(fā)生的核心磷酸化作用，因而，對(duì)HBV復(fù)制有調(diào)節(jié)作用62。圖3. 基因組包裝和核衣殼成熟。RNA前基因組、乙肝病毒多聚酶和乙肝病毒核心抗原二聚體復(fù)合物形成之后，乙肝病毒核衣殼開(kāi)始形成。有效的RNA前基因組包

49、裝需要在核心蛋白C末端部分發(fā)生磷酸化。包含RNA的未成熟核衣殼轉(zhuǎn)化為包含DNA的成熟核衣殼，與脫磷酸化作用和構(gòu)象變化有關(guān)。包含RNA的未成熟核衣殼與成熟核衣殼之間的這些明顯差異引起成熟核衣殼的包裝。與這些殘基磷酸化作用有關(guān)的激酶身份還不十分清楚。在體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上，有人認(rèn)為蛋白激酶C119或SPRK激酶家族成員可能參與其中143。通過(guò)詳細(xì)質(zhì)譜檢驗(yàn)對(duì)鴨乙肝病毒衣殼磷酸化作用進(jìn)行的分析顯示，來(lái)自未成熟核衣殼的核心蛋白在至少6個(gè)區(qū)域發(fā)生了磷酸化， 而成熟的核衣殼則被完全脫去了磷酸化57。與此相一致，已觀察到當(dāng)這個(gè)鴨乙肝病毒核心磷酸化位點(diǎn)突變?yōu)楸彼岷?，將在最初期完全阻斷逆轉(zhuǎn)錄。然而，天冬氨酸突變可使

50、得首鏈DNA完全合成，但在聚積成熟雙鏈DNA方面存在缺陷。這一現(xiàn)象，一方面反映了天冬氨酸-核心突變體的不穩(wěn)定性，而另一方面反映了對(duì)成熟次級(jí)鏈DNA合成的阻斷作用144。基于來(lái)自乙肝病毒 58和鴨乙肝病毒144系統(tǒng)的數(shù)據(jù)斷定，核衣殼成素的過(guò)程可描述為連續(xù)的磷酸化作用（未成熟核衣殼）和脫磷酸作用（成熟核衣殼）58。衣殼成熟過(guò)程中的這種脫磷酸作用，與包含RNA的核心和包含DNA的核心在結(jié)構(gòu)方面的顯著差異有關(guān)(圖 3)。尤其是一個(gè)顯著的變化影響了靠近刺突的疏水口袋，而這一疏水口袋為前S1區(qū)與核衣殼之間的相互作用所必需 12,145。這種口袋主要由殘基構(gòu)成，這些殘基在突變后導(dǎo)致了異常的病毒分泌 146。

51、4.2 包裝和出芽就C型逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒屬而言，具有損壞包膜蛋白結(jié)構(gòu)的突變體仍能釋放，并覆蓋脂質(zhì)雙層。與此不同，就乙肝病毒而言，成熟核衣殼的包裝嚴(yán)格依賴于病毒表面蛋白的存在。然而，已顯示乙肝病毒表面中蛋白與病毒復(fù)制無(wú)關(guān)89,147。表面大蛋白與表面小蛋白的形成則是必需的11,148。除此之外，病毒顆粒形成需要部分表面大蛋白的preS區(qū)面向細(xì)胞質(zhì) 14。分泌信號(hào)與表面大蛋白N末端的融合導(dǎo)致表面大蛋白分子的專一性形成，合成的表面大蛋白分子將preS區(qū)暴露于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔。這樣可形成亞病毒顆粒16，但阻礙了病毒顆粒的分泌24,149。來(lái)自鴨乙肝病毒系統(tǒng)的研究結(jié)果支持這種觀察現(xiàn)象 150,151。有研究

52、發(fā)現(xiàn)核衣殼的包裝需要乙肝病毒大蛋白。大蛋白的缺失造成衣殼被輸送至細(xì)胞核，以及病毒基因組的再次輸入與擴(kuò)增。就鴨乙肝病毒而言，有人認(rèn)為大蛋白preS區(qū)的第116位至第137位氨基酸對(duì)于病毒病毒組裝至關(guān)重要152；而就乙肝病毒而言，大蛋白preS區(qū)的第103位至第124位氨基酸對(duì)于病毒組裝至關(guān)重要（基因型不同時(shí)也可能是第92位至第113位氨基酸） 24。有研究推測(cè)這部分前S1區(qū)與衣殼在包裝過(guò)程中發(fā)生相互作用。這種推測(cè)得到以下觀察現(xiàn)象的支持，即發(fā)生在這部分前S1區(qū)內(nèi)的突變消弱了衣殼包裝。除此之外，HBV前S1區(qū)衍生肽段與重組肽段的體外結(jié)合分析可支持這一觀點(diǎn)153 (E. Hildt未發(fā)表的結(jié)果)。除面

53、向細(xì)胞質(zhì)的大蛋白preS區(qū)以外，在S區(qū)的跨膜區(qū)1和跨膜區(qū)2之間有一個(gè)短的回路（loop環(huán)），這一回路面向細(xì)胞質(zhì)并能與核衣殼發(fā)生相互作用 12,13,153,154。此區(qū)域內(nèi)的缺失抑制了病毒顆粒形成，而亞病毒顆粒的生成不受影響。為了鑒別對(duì)病毒包裝至關(guān)重要的核衣殼殘基，一些研究中對(duì)大量天然和人工突變體進(jìn)行了分析。在這些實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，可斷定刺突尖端似乎對(duì)衣殼包裝沒(méi)有影響 146。與此相反，已觀察到與刺突尖端結(jié)合的肽段可阻礙成熟病毒顆粒分泌 155。由蔗糖密度梯度離心作用純化的乙肝病毒顆粒，經(jīng)冷凍電子顯微鏡觀察支持如下結(jié)論，即刺突尖端通過(guò)靜電相互作用與乙肝病毒表面抗原發(fā)生相互作用13。 乙肝病毒核心

54、抗原的突變進(jìn)一步顯示，在刺突底端周圍和刺突之間叢林中聚集的氨基酸殘基對(duì)于核衣殼與包膜間的相互作用至關(guān)重要146。來(lái)自經(jīng)氯化銫純化的乙肝病毒顆粒電子顯微鏡結(jié)果支持這種假說(shuō)12，而經(jīng)蔗糖梯度純化的病毒顆粒13電子顯微鏡結(jié)果無(wú)法表明在這些位置發(fā)生了穩(wěn)定的包膜接觸。成熟肝DNA病毒科核衣殼在細(xì)胞質(zhì)中形成。就鴨乙肝病毒而言，已有研究顯示，成熟的核衣殼可粘附至胞內(nèi)膜。這種粘附不需要包膜蛋白的存在。未成熟核衣殼不發(fā)生結(jié)合作用156。目前還不了解調(diào)節(jié)成熟核衣殼輸送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后、高爾基體腔前的確切機(jī)制31，而包裝就是發(fā)生在這一階段。就逆轉(zhuǎn)錄病毒和一些包膜RNA病毒而言，有研究顯示來(lái)自質(zhì)膜的出芽依賴于宿主功能，這些

55、功能與蛋白質(zhì)分選成為晚期胞內(nèi)多泡體（MVBs）有關(guān)157。 通過(guò)顯性負(fù)性突變體AIP1/ALIX與VPS4B的共表達(dá)對(duì)不同種類多泡體蛋白進(jìn)行抑制，研究結(jié)果顯示包膜乙肝病毒顆粒的有效出芽和釋放需要多泡體的功能。除此之外，乙肝病毒顆粒和亞病毒顆粒均通過(guò)具有獨(dú)立宿主因素需求的特殊途徑得以釋放136。References and Notes1. Locarnini, S. Molecular virology of hepatitis B virus. Semin. Liver Dis. 2004, 24, 3-10.2. Lupberger, J.; Hildt, E. Hepatitis B vi

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