包被細胞培養(yǎng)板的相關(guān)問題

1、培養(yǎng)板的包被及相關(guān)問題：為了適應(yīng)不同的實驗需要，可對培養(yǎng)板用不同的物質(zhì)進行包被后使用，這其中有促進細胞黏附的，也有用于一些特殊檢測需要的。不同的實驗?zāi)康目赡芫唧w的方案亦不同，根據(jù)需要靈活掌握。(一)多聚賴氨酸包被：問：我要培養(yǎng)原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)，要用多聚賴氨酸鋪細胞培養(yǎng)板，請問賴氨酸液怎么配，怎樣鋪扳子答：配制0.01%的多聚賴氨酸: 首先買來sigma 公司的多聚賴氨酸，如是25mg，就需要250ml三蒸水，用移液管將少量三蒸水加到多聚賴氨酸的小塑料瓶中，然后將溶解的多聚賴氨酸加到200ml左右三蒸水中，(已置燒杯中)。最后加三蒸水達250ml，過濾除菌分裝與小瓶中即可。保存于-20度，近期用

2、的話可放于4度冰箱內(nèi)保存。注意每一小瓶的量不要太滿，若20ml的瓶子，只裝15ml可，若太滿，放于-2度有可能會將瓶子弄碎，因凍后體積增加。(我就有這個教訓(xùn)) 另外燒杯，小瓶、移液管都要滅菌處理的，泡酸高壓什么的。我們用的是一種用注射器過濾的過濾器，一次性的。一個能最多有效過濾200ml。鋪板的操作:首先要在消毒實驗室，包括超凈臺，紫外消度20-30分鐘。消毒后30分鐘進入實驗室。事先準備100ml三蒸水，經(jīng)高壓滅菌處理。具體細節(jié)就不多說了。首先打開板子，用消毒好的試管將0.01%的多聚賴氨酸加入每一孔中，大概每孔3-4滴吧。將板子蓋好放到培養(yǎng)箱中(37度 5%CO2)30分鐘。取出板子，用吸

3、管將多聚賴氨酸吸出。換吸管，加入三蒸水，沖洗三次，即將每孔內(nèi)加入三蒸水，沒過底，多點也行。再將水吸出來。反復(fù)三次。注意換吸管，要無菌操作的。最后將鋪好的板子放于培養(yǎng)箱待用。如果你做免疫組化，需要放小的玻片到孔內(nèi)，就在加多聚賴氨酸之前用無菌的鑷子將無菌的玻片夾到孔內(nèi)即可。問：PLL的分子量有3-5萬，7-15萬，15-30萬幾種，應(yīng)怎樣選擇？謝謝：）答：我們養(yǎng)神經(jīng)細胞，用的是分子量3萬到7萬的pll 。以PBS配成1mg/ml的母液，20度保存。使用時，用高純度的蒸餾水稀釋成0.11mg/ml的使用濃度，過濾除菌，以50微升每平方厘米的量均勻涂于培養(yǎng)底物的表面，室溫下靜置5min，吸除多余液體，

4、股風(fēng)吹干即可。問：多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板后看上去應(yīng)該是什么樣的？要做原代培養(yǎng)，為了促進細胞貼壁，擬用PLL包被培養(yǎng)板。1.我買的是博士德分裝Sigma的10ml的那種，可是院子里搜了一下，有人說沒有做過細胞培養(yǎng)試驗，不確定能否用于細胞培養(yǎng)！這怎么辦，不能用么？2.我的方法是這樣的，取了0。5ml，加入5毫升滅菌去離子水后，分成6份0.9ml，6孔板里放上玻片（準備以后做免疫組化直接取片子的），一個孔一份，室溫5分鐘后吸掉液體，超凈臺內(nèi)吹干過夜。第二天D-Hank's液洗3遍，晾干，紫外線照一會兒再用。請問這樣做有沒有硬傷？3.包被好后的板底及玻片應(yīng)該是什么樣的呢？我發(fā)現(xiàn)板子干了以后，上面

5、有些白點點，一開始以為是水滴，后來發(fā)現(xiàn)不是。莫非是PLL，那也是不是太夸張了？請問這種現(xiàn)象正常否？PDL有用于組化玻片包被的不能用于細胞培養(yǎng)，你在用前需先確定是細胞培養(yǎng)級的，細胞培養(yǎng)板用PDL包被完后是看不出什么的，如果有顆粒是PDL在配制是未完全溶解，可看一下說明書。我包被完用無菌水洗板子23次，吹干后很干凈，以前用PBS洗，吹干后也發(fā)現(xiàn)有白點，考慮是PBS中的鹽沉淀。(二)明膠包被：問：在細胞原代培養(yǎng)時，在培養(yǎng)瓶里鋪明膠，國產(chǎn)的明膠也以可用嗎？它是用什么配置呢？還有怎么消毒明膠呢？請多指教，謝謝！答：國產(chǎn)明膠不太好用，明膠可以用PBS溶液溶解，一般在100度煮15分鐘，趁熱分裝，分裝后放在

6、4度，不要冰凍。問：明膠消毒之后可以放置多長時間？還是現(xiàn)配現(xiàn)用呢？你說的分裝是指直接鋪在培養(yǎng)瓶嗎？如果不是的話，放在4度冰箱不是已經(jīng)固定了嗎？固定之后有怎么鋪在培養(yǎng)瓶呢？因為是沒做過實驗所以很不明白。答：sigma 有現(xiàn)成的終濃度是2%的明膠，已消毒，買來即可使用，方便而且不貴，僅100多塊錢。4度時明膠是膠凍狀，室溫下放置20-30分鐘就可變成液態(tài)，說明書上建議使用的包被密度是5-10ug/cm2。國產(chǎn)明膠就可以的，用去離子水配成1%即可?？梢砸淮闻?0ml或100ml。使用時取你所需量高壓滅菌即可。滅菌結(jié)束取出稍涼就可以鋪在培養(yǎng)瓶中。問：明膠包板完畢后，培養(yǎng)皿要干燥呢還是保持濕潤？答：明膠

7、包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶24小時后， 將明膠倒掉，用培養(yǎng)基沖洗，就可以接種細胞了。問：在園里搜索了一下關(guān)于明膠在細胞培養(yǎng)中的使用問題，還是有很多問題大家沒有詳細和標準的說明，現(xiàn)有幾個具體問題，請教各位戰(zhàn)友，1.明膠溶液配置的問題:用無菌PBS配還是用去離子水配?我們實驗室有國產(chǎn)的明膠，很大一瓶的那種，能不能用于細胞培養(yǎng)?難道一定要用GIBCO 20ML即用型的?2.明膠使用濃度的問題:有說0.1%，1%和2%的，我養(yǎng)的是內(nèi)皮細胞，應(yīng)該用哪種濃度呢?3.明膠消毒的問題:有人說可以高溫高壓滅菌，有人說應(yīng)該要過濾。還有人說要先高壓再乘熱過濾?不會吧，到底要怎樣?暈啊4.明膠包被培養(yǎng)瓶的問題:有人說包被后置

8、培養(yǎng)箱過夜，用時在棄溶掉的，加PBS和培養(yǎng)液沖洗。也有人說包被后吹干30min-60min 。再加培養(yǎng)液沖洗即可用，到底怎么個做法啊5.明膠包被后的培養(yǎng)瓶使用期的問題:包被后的培養(yǎng)瓶能夠用多久呢?有文獻說包被7天，干2-3天后放4度保存可以在兩周內(nèi)使用。答：Q1.明膠溶液配置的問題A1: 用去離子水來配即可。國產(chǎn)的行不行要去試驗，保險的就是買進口的。其實通常是買Sigma的gelatin粉末來配就好了，不用買配好現(xiàn)成的。配好的濃縮液可分裝放-20度長期保存，即將要用的濃縮液可放4度來備用。Q2.明膠使用濃度的問題A2:1%是濃縮母液的濃度，使用前才取適量稀釋成0.1%來包被。Q3.明膠消毒的問

9、題:A3: Gelatin是用高溫高壓滅菌的， 其他你所說的方法也不是不能用， 只是沒必要。Q4.明膠包被培養(yǎng)瓶的問題A4:通常是包被1小時就夠了，然后吸干，不需要清洗。因為你配gelatin溶液中并沒含其他有害的物質(zhì)，沖洗只是多了一道沒必要的工作。包被完要清洗是Collagen才需要的。Q5.明膠包被后的培養(yǎng)瓶使用期的問題A5.這個我不知道，但基本上是越快使用越好。由於包被的過程很快，所以我都是當(dāng)天包被，在等的過程中可以去做其他的事，包被即將完成的前20分鐘就開始處理細胞，等細胞收下來包被也就做好了， 馬上就用。0.1%的明膠適合大多數(shù)細胞培養(yǎng)時的包被，在四度放置不會出現(xiàn)凝膠狀。我參考的文獻

10、說內(nèi)皮細胞用1的明膠包被，也就是母液，它在四度放置時會適度凝結(jié)。我的內(nèi)皮細胞用1的明膠包被效果我覺得還不錯。不管你用包被1小時的方法還是包被4小時的方法，都最好從包被開始到使用的間隔不超過一天，包被的容器放置時間越長越不好。(三)纖連蛋白（(Fibronectin， FN）包被：因為課題需要，我要養(yǎng)人外周血來源內(nèi)皮細胞，得先用human fibronectin包被培養(yǎng)板。但是昨晚我看了個通宵，把園子里關(guān)于FN包被培養(yǎng)板的帖子大致瀏覽了一遍，反而越看越糊涂了幾乎就是百家爭鳴的局面：從稀釋融解開始，有人說不能用三蒸水，要用制藥用的純水，否則PH值不對會影響活力；有人說用PBS，有人說用加了尿素的P

11、BS；母液的濃度一般說是1mg/ml，但是買來的FN一般就是1mg，按這個濃度配置母液只能得到1ml，這么小的量如何分裝??？至于包被的濃度，差異更是很大，有人說各個公司的產(chǎn)品不一樣，還是以說明書上說的為準，是不是這樣啊？另外，包被的方法，有4度過夜的，有37度過夜的，有37度2至3個小時的，還有四度過夜或37度2至3個小時的我買的是ROCHE的1mg裝human fibronectin，用的是corning的24孔板，最后對各種方案進行了摸索，結(jié)果見下面的帖子。剛剛又再看了一下濃度的問題，大致歸結(jié)為以下三種方案：1.園子里大部分戰(zhàn)友用的還是50微克/毫升的濃度，室溫或37度下放置30至40分鐘

12、。2.我請教了有的人用的是10微克/毫升，4度過夜。3.還有我見一篇文獻成人外周血內(nèi)皮祖細胞分離和誘導(dǎo)分化中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)J Cent South Univ (M ed Sci) 2005， 30 (5)上面寫的是1微克/毫升，37度過夜。至此產(chǎn)生一個疑問：是不是這幾種方案都可行？濃度越高的，需要的溫度就越低，時間就越短，而最后達到的效果是一樣的？如果真是這樣，那么以上3個方案是一個比一個便宜啊，那我干脆用第3方案得了？第1方案比第3方案貴了五十倍??！比第2方案也貴了五倍。非得花那么多錢嗎？FN不便宜??！各位戰(zhàn)友，我摸索了好幾次，總共試驗了以下方案：1.50ug/ml，4度過夜；2.10

13、ug/ml，4度過夜；3.50ug/ml，室溫下放置45分鐘至一小時；4.10ug/ml，37度過夜；5.1ug/ml，37度過夜?，F(xiàn)在養(yǎng)到了第四天，自我感覺貼壁效果最好的是方案4，而且該方案所用的FN還是方案2用過一次的，我把它回收了又重復(fù)利用，已經(jīng)經(jīng)過了一次凍融，按理說效果應(yīng)該下降了不少了，但是它的貼壁時間早，細胞多而且形態(tài)比較接近長梭形，還聚集形成了很多集落樣的結(jié)構(gòu)，如下圖：至于溶解分裝，我是用滅菌注射用水1ml將其溶解為1mg/ml，然后分裝為八支EP管，負二十度保存。我要用人纖連蛋白包被培養(yǎng)板養(yǎng)細胞，請問自己如何包被，有無其他方法可替代？以10g/l的纖連蛋白(Fibronectin

14、)于4包被培養(yǎng)板過夜，接種細胞就可以了。我用羅氏的Fibronectin 1mg/瓶，說明書推薦：配成50ug/ml，包被用量5ug/平方厘米。室溫下包被40分鐘，然后吸掉多余溶液，注意培養(yǎng)板不能干掉，包被后立即使用，可用PBS沖洗，但沒必要。具體濃度可根據(jù)實際需要調(diào)整(15ug/cm2)(四)刀豆蛋白A包被：問：我現(xiàn)在進行胰腺細胞培養(yǎng)，需要用刀豆蛋白A（Concanavalin A）包被細胞培養(yǎng)板。卻不知如何使用。想請教各位：Con A用什麼溶液溶解、多大濃度、包被需要多長時間。答：包被液：Buffer A 碳酸鹽緩沖液（PH 9.5 0.05M），Na2CO3.10H2O 0.107g ，

15、NaHCO3  0.073g ，二蒸H2O 25ml包被液：10 ml+100ul2%NaN3+50ug抗原（5ug/ml）每孔100ul 。(五)肝素化：問：如何肝素化培養(yǎng)皿或細胞培養(yǎng)板，用于細胞與全血的共同培養(yǎng) ？答：用1250-2500 u/ml的肝素，濕潤培養(yǎng)皿或板，然后傾去既可。(六)病毒包被：問：我要做間接ELISA檢測抗體。要先把病毒包培養(yǎng)板，不知道怎么做！答：我也沒做過，但我覺得病毒事實上也是蛋白顆粒，在物理性質(zhì)上與普通蛋白無異，因此我覺得就是一個普通蛋白的包板而已。用碳酸鹽緩沖溶液。4度過夜就行。，。首先將病毒用包被緩沖液稀釋成最佳濃度包被，四度冰箱過夜。次日用洗滌液洗滌3 次。再將一抗加入其中。最后加入酶標抗體。最重要的一點，為防止病毒的擴散傳播，一般事先都滅活才包被。(七)anti-CD3單抗包被：問：soluble anti-CD3單抗包被培養(yǎng)板時用PH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋，請問PH9.6的碳酸鹽緩沖液的配方是什么。另外IL-2在培養(yǎng)體系中用U/ml和ng/ml，請問這如何換算。答：包被液（pH9.6碳酸鹽緩沖液）：精密稱取碳酸鈉 0.32g ，碳酸氫鈉 0.586g ，加水溶解，定容至200ml。U/m是細胞因子的活性單位，細胞因子作用于特定的靶細胞，影響靶細胞的生物活性或細胞增殖動力學(xué)，通過檢測靶細胞的生物學(xué)活性或