農(nóng)桿菌的活化培養(yǎng)及介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

1、一、目的要求通過實(shí)驗(yàn)掌握農(nóng)桿菌的活化與培養(yǎng)技術(shù)與農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得目的基因的轉(zhuǎn)化植株。二、基本原理農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法最早是由Marton 等（1979 年）以原生質(zhì)體為受體建立起來的，經(jīng)過一系列改進(jìn)后，目前已經(jīng)成為最常用的轉(zhuǎn)化方法。共培養(yǎng)法是利用Ti 質(zhì)粒系統(tǒng)，將農(nóng)桿菌與植物原生質(zhì)體、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、葉盤、莖段等共同培養(yǎng)的一種轉(zhuǎn)化方法（圖61）三、材料及方法1含目的基因共整合載體或雙元載體的根癌農(nóng)桿菌。2植物幼苗。（一）細(xì)菌培養(yǎng)液直接浸染法操作：（1）無菌受體材料的準(zhǔn)備：葉片、莖段、胚軸、子葉等均可做受體材料，有兩種來源。 取自無菌試管苗。 取自田間或溫室栽培植株：葉片、莖尖、莖段用蒸餾水沖冼1 遍后，

2、70乙醇洗45 秒，0.1升汞消毒68 分鐘，無菌水沖洗三遍，無菌濾紙吸干水分。（2）受體材料預(yù)培養(yǎng)：將無菌葉片剪成0.5cm×0.5cm 的小塊或用6mm 打孔器鑿成圓盤，無菌胚軸、莖切成約0.81cm 長(zhǎng)的切段，接種在愈傷組織誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，注意葉片近軸面向下：預(yù)培養(yǎng)23 天，材料切口處剛剛開始膨大時(shí)即可進(jìn)行侵染。（3）農(nóng)桿菌培養(yǎng)： 從平板上挑取單菌落，接種到20mL 附加相應(yīng)抗生素的細(xì)菌培養(yǎng)液體培養(yǎng)基（pH7.0）中，在恒溫?fù)u床上，于27, 180r/ min 培養(yǎng)至OD600 為0.60.8。 取OD600 為0.60.8 的菌液，按12的比例，轉(zhuǎn)入新配制的無抗

3、生素的細(xì)菌培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，可在與上相同的條件下培養(yǎng)6 小時(shí)左右，OD600為0.20.5 時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化；或同時(shí)加入100500mol/的AS；（4）侵染：于超凈工作臺(tái)上，將菌液倒入無菌小培養(yǎng)皿中（可根據(jù)材料對(duì)菌液的敏感情況進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋）。從培養(yǎng)瓶中取出預(yù)培養(yǎng)過的外植體，放入菌液中，浸泡適當(dāng)時(shí)間（一般15 分鐘，不同材料處理時(shí)間不同）。取出外植體置于無菌濾紙上吸去附著的菌液。（5）共培養(yǎng)：將侵染過的外植體接種在愈傷組織誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基上（煙草為MS 十IAA0.5mg/L BA2.0mg/L) ，在28暗培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)24 天（光對(duì)某些植物的轉(zhuǎn)化有抑制作用，故需暗培養(yǎng)，共培養(yǎng)時(shí)間因不

4、同植物而異）。（6）選擇培養(yǎng)：將經(jīng)過共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到加有選擇壓（以NPT為標(biāo)記基因時(shí)一般使用卡那霉素，煙草以100mg/L 的選擇濃度為宜，其它植物需通過敏感實(shí)驗(yàn)確定）的脫菌（附加250500mg/L 的羧芐青霉素或頭孢霉素，抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)）分化或愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在光照為200010000lx、25條件下進(jìn)行選擇培養(yǎng)。（7）繼代選擇培養(yǎng)：選擇培養(yǎng)23 周后，外植體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞將分化出抗性不定芽或產(chǎn)生抗性愈傷組織，將這些抗性材料轉(zhuǎn)入相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代擴(kuò)繁培養(yǎng)，或轉(zhuǎn)入附加選擇壓的生長(zhǎng)或分化培養(yǎng)基中令其生長(zhǎng)或誘導(dǎo)分化。（8）生根培養(yǎng)：待不定芽長(zhǎng)到1cm 以上時(shí)，切下并插入含有選擇壓的

5、生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，兩周左右長(zhǎng)出不定根。（二）細(xì)菌的植物組織培養(yǎng)基懸浮液浸染法此方法與上述的細(xì)菌培養(yǎng)液直接侵染法不同之處是用于侵染的農(nóng)桿菌被懸浮在植物組織培養(yǎng)液（如1 / 2MS 、MS 或其它培養(yǎng)液中），而不是細(xì)菌培養(yǎng)液（如YEB 或LB 等）中。具體做法有兩種：（1）在超凈工作臺(tái)上，將按上述方法培養(yǎng)的OD600 為0.60.8 的菌液，轉(zhuǎn)入無菌離心管中，于室溫條件下，4000r/min 離心5 分鐘，去掉上清液菌體用MS 液體培養(yǎng)基（pH5.45.8）重懸，稀釋至OD600為0.2 左右，用于轉(zhuǎn)化。（2）另一方法是取適量的OD600為0.60.8 的菌液加入到3050 倍體積無激素的

6、組織培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中（pH5.8)，（同時(shí)可加入100mol/L 的AS ) ，在上述條件下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2 4 小時(shí)，至OD600為0.2 左右時(shí)用于侵染。說明：（1）上述的各種做法包括加入AS 及不加AS ，都能獲得一定的轉(zhuǎn)化率。侵染時(shí)采用哪種做法，除要根據(jù)受位材料及菌株情況選定外，也有個(gè)人的習(xí)慣。（2）如果共培養(yǎng)后，外植體周圍菌體很多，轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)時(shí)，可先用液體MS 培養(yǎng)基沖洗材料吸干液體后再轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基。但這種作法常常引起材料損傷，應(yīng)盡量避免。（3）為提高轉(zhuǎn)化細(xì)胞成活率，可采用哺育細(xì)胞看護(hù)培養(yǎng)及延遲篩選的方法。哺育細(xì)胞看護(hù)培羌是以迅速生長(zhǎng)的植物細(xì)胞懸浮系（常用胡蘿卜懸浮細(xì)胞系）為哺育細(xì)

7、胞。共培養(yǎng)對(duì)在共培養(yǎng)的培養(yǎng)基表面鋪上一層哺育細(xì)胞層，然后覆蓋一張無菌濾紙，將侵染后的材料成在濾紙上面進(jìn)行共培養(yǎng)，哺育細(xì)胞的滋養(yǎng)有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞成活。所謂延遲篩選是指共培養(yǎng)后的材料不馬上轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中，而是先轉(zhuǎn)入只含有抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抗生素（如羧芐青霉素或頭孢霉素），不含選擇壓（如卡那霉素）的分化或愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 10 天（稱脫菌培養(yǎng)），然后再轉(zhuǎn)入具有選擇壓的篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性篩選。延遲篩選的好處是轉(zhuǎn)化細(xì)胞受非轉(zhuǎn)化細(xì)胞滋養(yǎng)有利于成活，缺點(diǎn)是常造成“逃逸”（假轉(zhuǎn)化）現(xiàn)象及嵌合體出現(xiàn)。 （三）CpTI 基因葉盤法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)材料：（1）農(nóng)桿菌LBA4404 ( pRCL27 ）。（2）甘藍(lán)

8、種子。操作：1 受體材料準(zhǔn)備：甘藍(lán)種子用水漂洗，70 乙醇消毒1 分鐘，0.1 的升汞消毒2030 分鐘，無菌水沖洗5 遍。播種于無菌0.7固體瓊脂培養(yǎng)基上，陽光下培養(yǎng)67 天。2 配制培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS IAA0.2 BA2.0共培養(yǎng)培養(yǎng)基：同上脫菌培養(yǎng)基：MS IAA0.2 BA2.0Cef 500mg / L篩選培養(yǎng)基：MS IAA0.2 BA2.0 Cef 500mg / L 十Km 25mg / L生根培養(yǎng)基：1 / 2 MS IBA 0.5 十Km 25mg / L抗生素用無菌濾膜過濾，添加在高壓滅菌后冷至50 左右的培養(yǎng)基中，用力搖勻（可將磁棒與培養(yǎng)基一起滅菌，加入抗生素后

9、，置磁力攪拌器上攪勻）后分裝于無菌培養(yǎng)皿中，生根培養(yǎng)基分裝于三角瓶中。3農(nóng)桿菌培養(yǎng)（1）挑取單菌落，接種于20mL YEB Km 25mg / L Rif 50mg / L 液體培養(yǎng)基中，27、180r/min培養(yǎng)過夜。（2）取400l 菌液轉(zhuǎn)接入20mL 無抗生素的YEB 液體培養(yǎng)中，繼續(xù)培養(yǎng)46 小時(shí)。（3）在超凈工作臺(tái)上，將菌液倒入無菌帶蓋離心管內(nèi)，蓋上管蓋，用石蠟?zāi)し饪冢?000r/min離心5 分鐘。（4）取出離心管，在超凈工作臺(tái)上棄去上清。向離心管內(nèi)加入適量無菌MS 液體培養(yǎng)基，懸浮起菌體，轉(zhuǎn)入無菌容器中，用MS 液體培養(yǎng)基稀釋至OD6000.2 。4 葉盤法轉(zhuǎn)化（1）取培養(yǎng)67

10、天的甘藍(lán)無菌幼苗，將胚軸剪成58mm 長(zhǎng)的小段，子葉帶子葉柄剪下，轉(zhuǎn)入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，于25，光照條件下預(yù)培養(yǎng)2 天。（2）將預(yù)培養(yǎng)的材料取出，放在無菌的小培養(yǎng)皿中，保留培養(yǎng)基。（3）向皿中倒入稀釋好的菌液，輕輕搖晃23 下，立即取出胚軸切段及子葉，置無菌濾紙上吸去多余菌液。（4）將子葉及胚軸切段放回到原預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，蓋上培養(yǎng)皿蓋，用石蠟?zāi)し饪冢?7，黑暗中共培養(yǎng)2 天。（5）將材料轉(zhuǎn)入到脫菌培養(yǎng)基中，于26 ，光照條件下培養(yǎng)67 天。（6）將脫菌培養(yǎng)基中的材料轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)。23 周有綠芽分化。（7）將綠芽轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基，2 周更換一次新鮮的篩選培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)34

11、代，淘汰白化的及畸型苗（8）選擇形態(tài)正常，生長(zhǎng)旺盛的抗性綠苗，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，15 天后可見幼根生成。待根系形成后取出小苗，自來水洗凈根上的瓊脂，移入珍珠巖與草炭土1 ：1 混合的基質(zhì)中，于溫室中培養(yǎng)。（9）取生長(zhǎng)良好的植株葉片提取DNA ，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及Southern 雜交鑒定。說明：LBA4404 (pRCL27）為雙元載體，所含pRCL27 質(zhì)粒的TDNA 中有NPT 一l 基因和以CaMV35S 啟動(dòng)子調(diào)控的CpTI 基因。由中科院遺傳所朱禎實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。（四）懸浮細(xì)胞與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化目的：以懸浮培養(yǎng)的單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)為受體，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)化，并通過再生獲得轉(zhuǎn)基因植

12、株。材料：（1）煙草愈傷組織。（2）含NPT-基因質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌菌株。（3）懸浮培養(yǎng)液：愈傷組織培養(yǎng)基成分中增加2,4D 濃度，可至2mg/L；VB1、VB6 濃度可增至10mg/L；煙酸濃度可增至5mg/L，并加入水解酪蛋白1g/L。操作：1. 懸浮細(xì)胞系的建立(1) 在150mL 的三角瓶中加入約50mL 的懸浮培養(yǎng)液。(2) 取生長(zhǎng)快，松散的愈傷組織轉(zhuǎn)入懸浮培養(yǎng)液中，24、100r/min 振蕩培養(yǎng)。(3) 每隔3 天轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)液中繼代一次。2. 農(nóng)桿菌培養(yǎng)（1）將農(nóng)桿菌接種在YEB 液體培養(yǎng)基中，于28、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600為0.60.8。（2）取20mL 菌液置

13、無菌離心管中，4000r/min 離心5 分鐘，收集菌體。（3）用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液重懸菌體，并稀釋至OD6000.25 左右，置冰上待用。（4）另一種做法是取lmL 菌液加入到50100mL 新鮮的YEB ( pH7.0）或細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中（pH5.8) ，同時(shí)加入l000mol/LAS 繼續(xù)培養(yǎng)至OD6000.25 左右，約46 小時(shí)，放置冰上待用。3 共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化（1）將農(nóng)桿菌液置20平衡幾分鐘。（2）取4mL 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的植物細(xì)胞懸浮液放入直徑為10cm 的培養(yǎng)皿中。（3）再加入4mL 平衡好的農(nóng)桿菌液混勻，于28靜止培養(yǎng)2 天。4 轉(zhuǎn)化體篩選（1）將共培養(yǎng)物低速離心（700r/min

14、) ，棄上清。（2）加入細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞沉淀3 次。（3）最后用含500ug/mL 羧芐青霉素或頭孢霉素及100 ug/mL 卡那霉素的選擇細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，于24100r/min 條件下進(jìn)行選擇培養(yǎng)。（4）當(dāng)出現(xiàn)微小愈傷組織后轉(zhuǎn)入固體選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織繼代選擇培養(yǎng)。 5 愈傷組織分化及生根培養(yǎng)：愈傷組織轉(zhuǎn)入附加卡那霉素的固體分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化，將分化出的幼苗轉(zhuǎn)入附加卡那霉素的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。說明：共培養(yǎng)時(shí)不要振蕩，培養(yǎng)條件必須有利于細(xì)胞旺盛分裂，才能得到較好效果。（五）原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化目的：以原生質(zhì)體為受體細(xì)胞，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的目的基因轉(zhuǎn)化。材料：煙草，帶

15、目的基因的根癌農(nóng)桿菌。試劑 ：（1）原生質(zhì)體分離緩沖液：0.07 % MES 2 , ( N嗎琳)乙基磺酸 ，0.07 % CaC12 , 0.11%NaH2PO4 , 0.5mol/L 甘露醇（pH5.8）。（2）原生質(zhì)體分離酶液：l%2蝜llase onozuka R10（纖維素酶R10) , 0.1% MacerozymeR10（果膠酶R10)，溶于原生質(zhì)體分離緩沖液（pH5.8）。（3）16 蔗糖溶液。操作：1煙草葉肉原生質(zhì)體制備：(1) 以12 周齡煙草植株為試材，選取已伸展開的幼嫩葉片按下面程序進(jìn)行表面消毒：浸于70乙醇30 秒，無菌水沖洗1 次。浸入5次氯酸鈉溶液（其中可加入少許

16、Tween20) 30 分鐘，無菌水沖洗3 遍。浸入1次氯酸鈉溶液10 分鐘，無菌水沖洗3 次。(2) 無菌操作剪碎葉片，放入培養(yǎng)皿中，加入25mL 左右的原生質(zhì)體分離酶液，于28、2030min 輕搖46 小時(shí)。(3) 用倒置顯微鏡觀察原生質(zhì)體分離情況。(4) 將分離良好的原生質(zhì)體懸液，用608m 孔徑的濾網(wǎng)過濾，原生質(zhì)體進(jìn)入濾液。(5) 濾液經(jīng)600r/min 離心5 分鐘，原生質(zhì)體沉于管底，除去上清酶液。(6) 離心管內(nèi)加入2mL 原生質(zhì)體分離緩沖液重懸沉淀，然后在管底緩緩加人16蔗糖溶液800r/min 離心10 分鐘，原生質(zhì)體漂浮在蔗糖溶液與分離緩沖液中間界面上。（7）吸取原生質(zhì)體，

17、用分離緩沖液洗滌，600r/min 離心3 分鐘，去上清液。（8）反復(fù)洗滌23 次后供轉(zhuǎn)化使用。原生質(zhì)體預(yù)培養(yǎng)：(1) 用含0.4mol/L 蔗糖的K3 NAA0.1 KT0.2 的液體培養(yǎng)基重懸原生質(zhì)體，使終濃度為12×105/mL。(2) 將原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基懸液分裝于9cm 的培養(yǎng)皿中，每皿5mL 左右，在弱光照（400 lx）下培養(yǎng)至原生質(zhì)體第一次分裂前。3. 農(nóng)桿菌培養(yǎng)：(1) 將農(nóng)桿菌接種于YEB 液體培養(yǎng)基中，在27、200r/min 條件下振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5 左右。(2) 將菌液轉(zhuǎn)入無菌離心管中，5000 r/min 離心5 分鐘收集菌體。(3) 用原生質(zhì)體

18、液體培養(yǎng)基懸浮、稀釋至細(xì)胞濃度為1×109 放置冰上待用。農(nóng)桿菌培養(yǎng)的另一種做法是經(jīng)步驟(1)后，取lmL 菌液加入到50100mL 新鮮的YEB ( pH7.0)或原生質(zhì)體培養(yǎng)液（pH5.8）中，同時(shí)添加入AS100mol/ L，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 為0.2 左右時(shí)即可直接使用。4 共培養(yǎng)：取5l 農(nóng)桿菌加入到盛有原生質(zhì)體的培養(yǎng)皿中輕輕地混勻，使農(nóng)桿菌：原生質(zhì)體約為100 : 1 ，農(nóng)桿菌終濃度約為107個(gè)細(xì)胞mL 。于室溫下共培養(yǎng)2 天。5 脫菌培養(yǎng)：將共培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入無菌離心管中，700r/min 離心5 分鐘，棄上清。用原生質(zhì)體培養(yǎng)基輕輕懸浮，再次離心，用含有500ug/mL 的羧芐青霉素的原生質(zhì)體再生液體培養(yǎng)基懸浮，使細(xì)胞濃度約為36×104，于室溫脫菌培養(yǎng)并誘導(dǎo)分裂。原生質(zhì)體細(xì)胞分裂至10 個(gè)細(xì)胞期時(shí)，逐漸降低培養(yǎng)基中的滲透壓至原始培養(yǎng)基的一半。6 選擇培養(yǎng)：離心收集小細(xì)胞團(tuán)及微小的愈傷組織，轉(zhuǎn)至含有100200ug/mL 卡那霉素和500ug/mL 的羧芐青霉素的誘導(dǎo)愈傷組織或芽再生選擇培養(yǎng)基上，進(jìn)一步培養(yǎng)。說明：