初探可能與珠蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)相關(guān)的兩個(gè)新基因

1、初探可能與珠蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)相關(guān)的兩個(gè)新基因    1.引言人-珠蛋白基因簇位于第11 號(hào)染色體上，由、G、A、 和 五個(gè)功能基因按照發(fā)育階段順序依次排列組成，基因的表達(dá)限制在紅細(xì)胞鏈系內(nèi)并且由發(fā)育程序精確控制。在人的正常個(gè)體發(fā)育過程中，紅細(xì)胞中珠蛋白的表達(dá)存在著明顯的發(fā)育階段特異性，存在著胚胎型（）到胎兒型（）、胎兒型（）到成人型（）兩個(gè)開關(guān)過程。鐮刀形細(xì)胞貧血癥（SCD）及重型-地中海貧血是兩種最為常見的單基因遺傳病，在包括中國(guó)在內(nèi)的世界范圍有著很高的發(fā)病率。該病是由于-珠蛋白基因缺失或突變使蛋白合成受阻或結(jié)構(gòu)異常而引起的慢性溶血性貧血。已有證據(jù)表明，如

2、果在成人期已經(jīng)關(guān)閉的-珠蛋白基因能夠重新活化，表達(dá)的-珠蛋白能夠代償-地中海貧血患者中-珠蛋白的不足，貧血癥狀會(huì)明顯改善。目前用藥物活化成人-珠蛋白基因表達(dá)的方法已被廣泛研究，但僅對(duì)部分病例有效，而且有較多負(fù)作用，長(zhǎng)期治療效果差。因此尋找內(nèi)在的-珠蛋白基因活化因子并運(yùn)用于臨床成為研究熱點(diǎn)。如果-珠蛋白基因特異活化子能被確定，則可能為發(fā)展通過轉(zhuǎn)移-珠蛋白活化因子基因重新活化成人紅細(xì)胞中-珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，治療鐮刀形細(xì)胞貧血癥和重型-地中海貧血癥的新方法奠定基礎(chǔ)。人-珠蛋白基因作為最早克隆的基因之一，人們對(duì)于-珠蛋白基因簇的珠蛋白基因的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及位于基因簇上游的位點(diǎn)控制區(qū)（LCR）等順式調(diào)控

3、元件已經(jīng)研究得相對(duì)清楚。關(guān)于-珠蛋白基因在胎兒期被競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)閉，而 -珠蛋白基因則在成人期自主沉默的機(jī)制也已被廣泛接受。特異活化 -珠蛋白基因的重要反式作用因子如EKLF 也已經(jīng)確認(rèn)，并有進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明其存在轉(zhuǎn)錄后修飾和從胞質(zhì)到胞核的定位轉(zhuǎn)移是其參與激活 -珠蛋白的關(guān)鍵。關(guān)于特異活化 -珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄活化因子，陸續(xù)報(bào)告了NF-E4、FKLF、FKLF2、NF-Y、SAR等潛在的活化子，研究結(jié)果顯示其過量表達(dá)可顯著提高紅細(xì)胞中-珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平，但對(duì)于其在正常個(gè)體發(fā)育過程中對(duì) -珠蛋白基因的活化作用以及作用的特異性仍不能確定。也有很多參與成人紅細(xì)胞中-珠蛋白沉默的因子被確定，如DRED復(fù)合物

4、，研究證明其可與 -及 -珠蛋白啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，參與 -及 -珠蛋白在成人期的沉默。NF-E4的異構(gòu)體可通過使轉(zhuǎn)錄激活因子CP2與-珠蛋白啟動(dòng)子區(qū)的脫離參與-珠蛋白成人期沉默。另一方面，人們發(fā)現(xiàn)各珠蛋白啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平和組蛋白乙酰化水平均存在明顯的發(fā)育階段特異性，說明表觀遺傳學(xué)修飾在珠蛋白開關(guān)中也具有重要作用。盡管多年來的研究取得了很大進(jìn)展，但由于珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律遠(yuǎn)比人們所認(rèn)識(shí)的復(fù)雜，至今尚未能完全闡明其調(diào)控機(jī)制。遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在綜合癥（HPFH）是一種在成人階段胎兒血紅蛋白（HbF）持續(xù)高表達(dá)的遺傳病，通常是由于-珠蛋白基因簇內(nèi)序列的缺失或-珠蛋白基因啟動(dòng)子突變所引起，而本

5、組此前鑒定到一個(gè)HPFH 家系，其中兩個(gè)成員均為HPFH 患者，通過Southern雜交及DNA 序列分析均未發(fā)現(xiàn)上述改變。據(jù)此推測(cè)，此家系成員HbF 與F 細(xì)胞水平升高很可能涉及到-珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子的變化。而人臍帶血中主要是胎兒血紅蛋白的高表達(dá)，其中也很可能存在-珠蛋白基因活化因子的高表達(dá)，因此我們通過差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT-PCR）方法比較了此家系成員的骨髓同正常成人骨髓紅細(xì)胞及人臍帶血來源的紅細(xì)胞間的基因表達(dá)情況，鑒別得到了大量在人臍帶血或HPFH 患者骨髓中表達(dá)高于正常成人骨髓的基因。K562 細(xì)胞是一種白血病細(xì)胞系，能夠在hemin 的誘導(dǎo)下向紅系分化，主要表達(dá)-珠蛋白

6、基因簇中的-、-珠蛋白，基本檢測(cè)不到-珠蛋白的表達(dá)，可以作為研究-、-珠蛋白調(diào)節(jié)機(jī)制的很好細(xì)胞模型。而小鼠的紅白血病細(xì)胞系MEL585 則主要表達(dá)-珠蛋白基因，且可向誘導(dǎo)向紅系分化。在這里，我們著重研究了在臍帶血紅細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平較高的ZF 基因和在HPFH 成員的骨髓紅細(xì)胞中表達(dá)較高的SH3GLB1 基因的差異表達(dá)情況，以及其在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，并在人紅白血病細(xì)胞系K562 細(xì)胞以及小鼠紅白血病細(xì)胞系MEL585 中初步研究了其對(duì)于珠蛋白的調(diào)節(jié)作用。初步確定了ZF 對(duì)于人-珠蛋白啟動(dòng)子的活化作用和對(duì)于小鼠-珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用，以及SH3GLB1 對(duì)于小鼠-珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用。2.材

7、料及方法2.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選轉(zhuǎn)染前一天，以適當(dāng)密度傳代細(xì)胞，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將0.81.2g 質(zhì)量良好的質(zhì)粒DNA 加入50l 無血清培養(yǎng)基中混勻，然后將2l 脂質(zhì)體2000（Invitrogen）也加入50l 無血清培養(yǎng)基中，室溫靜置5min。將DNA 和質(zhì)?；旌虾螅覝仂o置20min。將混合物直接加入24 孔板的細(xì)胞中，輕輕搖晃使其混勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448h。如要構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，按照體積比1:101:20 的比例用新鮮完全培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至10cm 培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)兩天后，加入終濃度為500 g/ml 的G418（ME

8、L585 細(xì)胞），繼續(xù)培養(yǎng)。約715d 后，光鏡下可觀察到有細(xì)胞克隆出現(xiàn)，在顯微鏡下挑取細(xì)胞克隆于96孔的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至一定數(shù)量，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。2.4 雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)在轉(zhuǎn)染后2448h 檢測(cè)熒光素酶活性，使用威格拉斯的雙報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。即首先將5x 的細(xì)胞裂解液稀釋至1x，細(xì)胞用PBS 漂洗一次，24 孔板每孔加入100l 的細(xì)胞裂解液，晃動(dòng)數(shù)次使混勻，并將細(xì)胞及所有液體移至離心管中，置于冰上。漩渦震蕩510s，然后離心15s2min 鐘，轉(zhuǎn)移上清。在熒光光度計(jì)測(cè)量管中每管加入100 l 檢測(cè)液和20l細(xì)胞裂解液，進(jìn)行讀數(shù)。再加入100l stop&Glo

9、 溶液進(jìn)行第二次讀數(shù)。3.結(jié)果及討論3.1 ZF 和SH3GLB1 基因差異表達(dá)的驗(yàn)證DDRT-PCR 顯示ZF 基因在臍帶血紅細(xì)胞（CB）中的表達(dá)高于正常成人骨髓（NB）及HPFH患者骨髓（PB）紅細(xì)胞（如圖1A）。同樣分別以3 種誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的紅細(xì)胞cDNA 為模板進(jìn)行Real-time PCR 擴(kuò)增，根據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得出在誘導(dǎo)培養(yǎng)的臍帶血紅細(xì)胞、正常成人骨髓及HPFH 患者骨髓紅細(xì)胞中ZF 的表達(dá)水平，之后使用同時(shí)擴(kuò)增的內(nèi)參照GAPDH進(jìn)行歸一化，再進(jìn)行比較。ZF 的表達(dá)水平如圖1B 所示，結(jié)果顯示其在誘導(dǎo)培養(yǎng)的臍帶血紅細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平為正常成人骨髓紅細(xì)胞內(nèi)的3.8 倍，另外

10、為HPFH 患者骨髓紅細(xì)胞內(nèi)的8.34 倍。與DDRT-PCR 結(jié)果基本一致，說明其可能參與胎兒珠蛋白表達(dá)的活化。DDRT-PCR 顯示SH3GLB1 基因在HPFH 患者骨髓（PB）紅細(xì)胞中的表達(dá)高于臍帶血紅細(xì)胞（CB）中的以及正常成人骨髓（NB） （如圖1C）。以3 種誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的紅細(xì)胞cDNA 為模板進(jìn)行real-time PCR 擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得出在誘導(dǎo)的臍帶血紅細(xì)胞、正常成人骨髓及HPFH 患者骨髓紅細(xì)胞中SH3GLB1 的表達(dá)水平，以同時(shí)擴(kuò)增的相應(yīng)內(nèi)參照GAPDH進(jìn)行歸一化后再比較。SH3GLB1 在不同來源紅細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平如圖1D 所示，結(jié)果顯示其在誘導(dǎo)的HPF

11、H 患者骨髓紅細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平為人臍帶血紅細(xì)胞內(nèi)的2 倍，為正常成人骨髓紅細(xì)胞內(nèi)的1.6 倍。與DDRT-PCR 結(jié)果基本一致，說明其可能與HPFH 患者骨髓紅細(xì)胞中胎兒珠蛋白高相關(guān)。3.2 ZF 和SH3GLB1 真核表達(dá)載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位分別使用構(gòu)建好的含ZF和SH3GLB1的pEGFP-N1 載體，轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3，表達(dá)ZF 和SH3GLB1 與EGFP 的融合蛋白。轉(zhuǎn)染48h 后置熒光顯微鏡下觀察，ZF 和SH3GLB1基因產(chǎn)物均定位于細(xì)胞核內(nèi)，而對(duì)照pEGFP-N1 質(zhì)粒在所轉(zhuǎn)染NIH3T3 細(xì)胞內(nèi)在胞核與胞質(zhì)中均有分布。這些提示這兩個(gè)基因可能在細(xì)胞核中行使功能，可能

12、參與DNA 復(fù)制及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。3.3 ZF 和SH3GLB1 對(duì)人-珠蛋白基因啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用為了實(shí)驗(yàn)這兩個(gè)基因?qū)τ谌?珠蛋白基因的調(diào)節(jié)作用，我們用人-珠蛋白啟動(dòng)子啟動(dòng)的螢火蟲熒光素酶載體（Luci）與這兩個(gè)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染K562 細(xì)胞。以海腎熒光素酶作為內(nèi)參，雙報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)螢火蟲熒光素酶的相對(duì)活性。結(jié)果如圖3 所示，ZF+Luci 組熒光素酶的相對(duì)活性較對(duì)照組Luci 以及Luci+pc3.1 有明顯升高，提高大約1倍，而SH3GBL1+Luci 組熒光素酶的相對(duì)活性較對(duì)照組Luci 以及Luci+pc3.1 無明顯改變。初步說明ZF 對(duì)于人-珠蛋白基因啟動(dòng)子具有一定的促進(jìn)作

13、用。其對(duì)K562 細(xì)胞內(nèi)源的-珠蛋白基因的促進(jìn)作用還需進(jìn)一步證明。3.4 ZF 和SH3GLB1 MEL585 穩(wěn)定表達(dá)株的建立與鑒定為了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)這兩個(gè)基因?qū)τ?珠蛋白基因的調(diào)節(jié)作用，我們用構(gòu)建得到的以pcDNA3.1 為載體并分別插入了ZF 和SH3GLB1 基因的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠紅白血病細(xì)胞系MEL585，經(jīng)G418 篩選得到了穩(wěn)定過表達(dá)ZF 和SH3GLB1 的細(xì)胞株。RT-PCR 檢測(cè)了兩個(gè)基因的過表達(dá)情況，結(jié)果在MEL/ZF 細(xì)胞株中ZF mRNA 水平較高，而在作為陰性對(duì)照的MEL585 轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞MEL/pc3.1 內(nèi)未檢測(cè)到ZF 表達(dá)。在MEL/SH3GLB1細(xì)胞株

14、中檢測(cè)到SH3GLB1 mRNA較高水平表達(dá)，在陰性對(duì)照MEL/pc3.1 細(xì)胞內(nèi)低水平表達(dá)，說明小鼠細(xì)胞內(nèi)存在與其同源的基因序列。以上結(jié)果均顯示兩個(gè)基因在各自的穩(wěn)定細(xì)胞株中過表達(dá)成功，可用于下一步的功能分析。3.5 ZF 和SH3GLB1 過表達(dá)對(duì)于小鼠珠蛋白基因的調(diào)節(jié)作用用DMSO 誘導(dǎo)ZF 和SH3GLB1 MEL585 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株向紅系分化后，檢測(cè)小鼠-珠蛋白以及-珠蛋白基因的表達(dá)。結(jié)果說明ZF 基因過量表達(dá)使得小鼠-珠蛋白基因的表達(dá)明顯下調(diào)，僅為轉(zhuǎn)入空載體的陰性對(duì)照內(nèi)的表達(dá)水平的50%，而SH3GLB1 基因的過量表達(dá)則使小鼠-珠蛋白基因的表達(dá)明顯升高，約為對(duì)照組的3 倍。而這兩個(gè)基因過量表達(dá)對(duì)于小鼠-珠蛋白基因的表達(dá)水平影響均不明顯，說明了ZF 和SH3GLB1 對(duì)于小鼠-珠蛋白基因表達(dá)的影響具有一定特異性。SH3GLB1 過表達(dá)細(xì)胞株內(nèi)-珠蛋白基因表達(dá)較對(duì)照細(xì)胞有明顯提高，而-珠蛋白基因表達(dá)水平無明顯區(qū)別。ZF 過表達(dá)細(xì)胞株內(nèi)-珠蛋白基因表達(dá)較對(duì)照細(xì)胞有明顯降低，-珠蛋白基因表達(dá)水平無明顯區(qū)別。4. 結(jié)論本文鑒別了兩個(gè)在人臍帶血、正常成人骨髓和異細(xì)胞型HPFH 患者骨髓中差異表達(dá)的基因，ZF 和SH3GLB1。在K5