Western Blot 技術(shù)原理及常見問題分析-2014

1、東勝創(chuàng)新東勝創(chuàng)新 科學(xué)儀器科學(xué)儀器部部2014.7Western Blot 簡介： 印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。 1975年，Southern將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測特定的DNA片段，稱為Southern印跡法。 而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。p 高分辨率的電泳技術(shù)高分辨率的電泳技術(shù)p 特異敏感的抗原

2、特異敏感的抗原- -抗體反應(yīng)抗體反應(yīng)p 1-5ng1-5ng中等大小的靶蛋白中等大小的靶蛋白q目的蛋白的表達特性分析q目的蛋白與其它蛋白的互作q目的蛋白的組織定位q目的蛋白的表達量分析兩種蛋白（兩種蛋白（47kDa47kDa和和55kDa)55kDa)的誘導(dǎo)表達分析的誘導(dǎo)表達分析 誘導(dǎo)劑：誘導(dǎo)劑：Q23Q23和和Q70Q70 溫度：溫度：3333和和3939 時間：時間：7 7天、天、1414天、天、2121天天示例示例2 2示例示例1 1proAproBIP: anti-proBNo IPWB: anti-proBWB: anti-proAproAIgGproBl蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備

3、SDS-PAGESDS-PAGE轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜封閉封閉一抗雜交一抗雜交二抗雜交二抗雜交底物顯色底物顯色 2SDS-PAGE上樣緩沖液：上樣緩沖液：DTT可臨用前以可臨用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分裝，比例混合加入，亦可全部配好分裝，-20凍存。凍存。 按按1:1比例與蛋白質(zhì)樣品混合，比例與蛋白質(zhì)樣品混合，95100加熱加熱515min，冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為20-25l，總蛋白量，總蛋白量2050g。1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml1M DTT20 mlSDS4 g甘油甘油20 ml溴酚藍溴酚藍0.2 g總體積總體積100ml 100mM

4、 Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT 4%SDS 0.2%溴酚蘭溴酚蘭 20%甘油甘油 ddH2OSDS(十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉 )：陰離子去污劑陰離子去污劑 變性劑變性劑氨基酸側(cè)鏈與氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。膠束。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷膠束所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不量，消除了不 同分子之間原有的電荷差異。同分子之間原有的電荷差異。與強還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子線與強還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子

5、線性化。性化。q 不連續(xù)的電泳緩沖體系。q SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。 SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠成分凝膠成分M丙烯酰胺和N,N-亞甲基雙丙烯酰胺 神經(jīng)毒素！MSDSM配膠的Tris緩沖液MTEMED 神經(jīng)毒素！M過硫酸銨(AP） 神經(jīng)毒素！MTris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE濃縮膠濃縮膠(5% Acrylamide)及分離膠配方及分離膠配方表：表：http:/ 灌制分離膠灌制分離膠 隔絕空氣隔絕空氣d

6、dH2O0.1%SDS:8%灌制濃縮膠灌制濃縮膠 插入梳子插入梳子 濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠樣品樣品加樣槽加樣槽蛋白質(zhì)分蛋白質(zhì)分子的遷移子的遷移方向方向 1 2 3 M電泳之后凝膠染色掃膠電泳之后凝膠染色掃膠注意：注意：做做western blot通常用預(yù)通常用預(yù)染染Marker！轉(zhuǎn)膜 要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜）上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法毛細管印跡法和電泳印跡法。 常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。 最常用于最常用于Western Blot的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸的轉(zhuǎn)移膜

7、主要是硝酸纖維素（纖維素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟）膜和聚偏二氟乙烯乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，）膜，此外也有用尼龍膜、此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和印跡。尼龍膜和NC膜的特點相似膜的特點相似,主要用于主要用于核酸雜交。核酸雜交。 各種膜的詳細特點介紹：各種膜的詳細特點介紹： http:/ 蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖 維素濾膜，換水幾次。只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探 針的Western印跡過程。 S 作用：為避免作為檢測試劑的特異性第一抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，使

8、非特異性背景提高，需對膜上的潛在結(jié)合位點進行封閉處理。S 封閉劑： 5%脫脂奶粉或BSA，或3%明膠溶于TBST Western Blot 膜封閉液（生物試劑公司）室溫孵育室溫孵育1h1h或或44過夜過夜注：注：Tween-20Tween-20的作用：減少非特的作用：減少非特異性吸附，不影響抗體與抗原的異性吸附，不影響抗體與抗原的結(jié)合。結(jié)合。一抗、二抗孵育一抗、二抗孵育1.把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動，于室溫孵育1-2小時或4過夜。2.用TBST漂洗膜3-5次，每次5-10min。3.加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，

9、于室溫孵育1-2小時或4過夜。 4.用TBST漂洗膜3次，每次5-10min。5.最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。6.加入顯色底物進行顯色反應(yīng)。加入一抗，室溫孵育1-2小時或4過夜洗膜洗膜加入二抗，室溫孵育1-2小時或4過夜洗膜洗膜顯色顯色125I標(biāo)記的抗體X-光片壓片顯色 熒光基團標(biāo)記的抗體凝膠成像儀 酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體 ：如：如HRPHRP（辣根過氧化物酶）、（辣根過氧化物酶）、APAP（堿性磷酸酶）（堿性磷酸酶）等等成像方法成像方法：加酶的底物產(chǎn)生：加酶的底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光反應(yīng)反應(yīng)HRP（辣根過氧化酶（辣根過氧化酶)AP（堿性磷酸酶）（堿性磷酸酶）大小大小40Kd140Kd最

10、佳酶活性最佳酶活性PH：57PH：810酶活和二抗特異性酶活和二抗特異性好于好于AP抑制劑抑制劑氰化物，氰化物，硫化物硫化物疊氮鈉疊氮鈉氰化物，氰化物，砷酸鹽，有機磷，砷酸鹽，有機磷，二價陽離子螯合劑二價陽離子螯合劑穩(wěn)定性穩(wěn)定性零度以下穩(wěn)定零度以下穩(wěn)定零度以下不穩(wěn)定零度以下不穩(wěn)定底物底物很多很多部分部分動力學(xué)特性動力學(xué)特性快速快速慢慢價格價格便宜便宜昂貴昂貴發(fā)光底物發(fā)光底物 ECL顯色底物顯色底物TMB，CN，DABNBT，BCIP，NBT/BCIP兩種常用檢測酶系統(tǒng)的比較兩種常用檢測酶系統(tǒng)的比較u 顯色反應(yīng)：顯色反應(yīng)：HRPHRP敏感物敏感物TMBTMB，CNCN，DABDAB等底物等底物

11、優(yōu)點：方便、便宜，直接成像優(yōu)點：方便、便宜，直接成像 缺點：有毒、靈敏度較低、背景高、反應(yīng)慢、線性窄、不易保存、缺點：有毒、靈敏度較低、背景高、反應(yīng)慢、線性窄、不易保存、不能重新剝離檢測不能重新剝離檢測辣根過氧化物酶（辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記）標(biāo)記 化學(xué)發(fā)光示意圖化學(xué)發(fā)光示意圖 堿式磷酸酶（堿式磷酸酶（AP）標(biāo)記）標(biāo)記 化學(xué)發(fā)光示意圖化學(xué)發(fā)光示意圖u 化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光顯色：顯色：目前使用最多的方法目前使用最多的方法 標(biāo)標(biāo)HRPHRP二抗加二抗加ECLECL底物化學(xué)發(fā)光反應(yīng)底物化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 優(yōu)點：靈敏、快速、節(jié)省抗體、反應(yīng)快、線性寬、無害、優(yōu)點：靈敏、快速、節(jié)省抗體、反應(yīng)快、線性寬、無害、

12、特異性高、可重新剝離檢測特異性高、可重新剝離檢測靈敏度：靈敏度：MicroChemi 膠片曝光膠片曝光 壓片壓片 vs. CCD成像成像暗室壓片MicroChemi CCD成像成像價格便宜，但需要不斷投入比較貴，但只需一次投入有毒？有毒？有毒，污染環(huán)境無毒無毒，環(huán)保 操作復(fù)雜，需要技術(shù)經(jīng)驗簡便易學(xué)，且可連續(xù)曝光不同時間成像質(zhì)量壓片后需要二次成像，圖像質(zhì)量損失嚴重一次性無損拍照，永久保存一次性無損拍照，永久保存成像后處理不可可后期調(diào)節(jié)對比度至理想狀態(tài)是否能直接疊加Marker否，需要比對劃線是，快速直接疊加動態(tài)范圍動態(tài)范圍比較小寬，可達到寬，可達到4.6個數(shù)量級個數(shù)量級是否可以定量分析是否可以定

13、量分析否是是，儀器自帶圖像分析軟件顯顯影影液液定定影影液液(1)(1)壓片壓片(2)(2)顯影顯影(3)(3)定影定影(4)(4)晾干晾干(5)(5)存儲存儲1 1小時小時-1 -1天天1-101-10分鐘分鐘暗室操作過程暗室操作過程壓片實例壓片實例壓片壓片：無法準(zhǔn)確獲得目的條帶的大小，只能固定膠片位置在：無法準(zhǔn)確獲得目的條帶的大小，只能固定膠片位置在膠片上標(biāo)出膠片上標(biāo)出Marker的大概位置的大概位置CCD成像成像 動態(tài)范圍大，能直接疊加動態(tài)范圍大，能直接疊加Marker，便于后期圖像的處理及分析，便于后期圖像的處理及分析Marker直接疊加在化學(xué)發(fā)光圖像上直接疊加在化學(xué)發(fā)光圖像上 West

14、ern Blot化學(xué)發(fā)光成像化學(xué)發(fā)光成像 特推薦東勝創(chuàng)新經(jīng)營特推薦東勝創(chuàng)新經(jīng)營DNR公司公司MicroChemi化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)，靈敏度高，操作簡便功能齊全，價格實惠檢測系統(tǒng)，靈敏度高，操作簡便功能齊全，價格實惠 產(chǎn)品產(chǎn)品特點：特點：l高靈敏度：高靈敏度：超亮大光圈鏡頭、大尺寸科學(xué)級超亮大光圈鏡頭、大尺寸科學(xué)級CCD、-60低溫制冷三重配置為檢測化學(xué)發(fā)光信號低溫制冷三重配置為檢測化學(xué)發(fā)光信號帶來高靈敏度、高質(zhì)量的成像效果帶來高靈敏度、高質(zhì)量的成像效果l一鍵拍照：一鍵拍照：整個拍照過程只需點擊一個按鈕，整個拍照過程只需點擊一個按鈕，即可獲得精準(zhǔn)高質(zhì)圖像即可獲得精準(zhǔn)高質(zhì)圖像l快速疊加快速疊

15、加Marker：落射白光實現(xiàn)樣品與落射白光實現(xiàn)樣品與Marker的準(zhǔn)確定位，方便快速在的準(zhǔn)確定位，方便快速在Western的圖像上直的圖像上直接疊加接疊加Marker l可清洗的樣品盤：可清洗的樣品盤：可完全抽出清洗，避免樣可完全抽出清洗，避免樣品間的交叉污染和實驗臺面的污染，延長儀器的使用品間的交叉污染和實驗臺面的污染，延長儀器的使用壽命壽命其他成像方法示例其他成像方法示例Western Blot結(jié)果分析 目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。 分析軟件如分析軟件如GelQuant等等？ 轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白很少1.1.蛋白分子量蛋白分子量 10KD1

16、0KD2.2.蛋白的等電點蛋白的等電點 93.3.SDSSDS濃度不合適濃度不合適4.4.凝膠太厚凝膠太厚 原因原因?qū)Σ卟?.1.蛋白分子量蛋白分子量10KD10KD時，減時，減少轉(zhuǎn)膜時間；使用小孔徑少轉(zhuǎn)膜時間；使用小孔徑的膜的膜2.2.更換高更換高pHpH值值BufferBuffer3.3.在陰極在陰極bufferbuffer中加入中加入0.005 - 0.01% SDS 0.005 - 0.01% SDS 可提可提高轉(zhuǎn)膜效率高轉(zhuǎn)膜效率4.4.延長轉(zhuǎn)膜時間延長轉(zhuǎn)膜時間1.1.膜沒有均勻浸濕膜沒有均勻浸濕2.2.膜或者緩沖液污染膜或者緩沖液污染3.3.封閉不充分封閉不充分4.4.抗體與封閉劑

17、出現(xiàn)交抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)叉反應(yīng)5.5.抗體濃度過高抗體濃度過高 原因原因?qū)Σ卟?.1.PVDFPVDF膜轉(zhuǎn)膜前用膜轉(zhuǎn)膜前用100%100%甲醇將膜甲醇將膜完全浸濕，轉(zhuǎn)膜前用緩沖液浸完全浸濕，轉(zhuǎn)膜前用緩沖液浸泡泡10min10min2.2.拿取膜與吸水紙時要戴手套，拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液3.3.更換封閉劑或延長封閉時間更換封閉劑或延長封閉時間4.4.檢測一抗、二抗與封閉劑是否檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)有交叉反應(yīng) 如有，更換封閉劑或抗體如有，更換封閉劑或抗體5.5.做預(yù)實驗檢測確定一抗、二抗做預(yù)實驗檢測確定一抗、二抗的最佳工作濃度的最佳工作濃度背景太高雜交信號很弱或沒有1.1.抗體不適合于抗體不適合于western blot 2.抗體濃度太低濃度太低3.3.抗體保存不當(dāng)抗體保存不當(dāng)4.4.抗原不充足抗原不充足5.5.膜的漂洗過度膜的漂洗過度6.6.轉(zhuǎn)膜不充分轉(zhuǎn)膜不充分 原因原因?qū)Σ卟?.1.設(shè)置陽性對照和內(nèi)參蛋白設(shè)置陽性對照和內(nèi)參蛋白2.2.加大抗體濃度加大抗體濃度3.3.抗體長期