煙草培養(yǎng)方法以及轉(zhuǎn)基因方法

1、煙草轉(zhuǎn)基因預(yù)備工具：EP管滅菌 無菌水 Ms培育基 75%的酒精（藍(lán)口小瓶） 升汞(要回收) 1ml槍 槍頭 EP管架 計時器一、轉(zhuǎn)基因(1) 無菌條件下，將煙草種子放入EP管中用無菌水沖洗2-3次；(2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec；(3) 再用0.1%的升汞處理5min，最終用無菌水沖洗5次；(4) 播種于MS培育基上，培育在杭州師范高校生命與環(huán)境科學(xué)院植物學(xué)重點試驗室組織培育室中，暗培育4天。25光照培育20-30天。 MS培育基 pH5.8 (5) 待煙草苗長至3-5cm時（20-30天），取頂芽放于MS+BA0.2 mg/L（壯芽，使其快速成長）培育基上，繼代培育。(6)

2、繼代培育14天后（有小葉片即可），取葉片，大小1cmX1cm，切去葉柄，葉片表面及葉邊緣劃傷，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的預(yù)培育培育基上，正面朝下緊貼培育基放置，于黑暗條件下預(yù)培育2-3天。(7) 然后取出預(yù)培育的葉片或莖段，放入侵染液中進(jìn)行侵染。侵染前一天晚上，搖菌農(nóng)桿菌2瓶。將2ml離心管裝滿菌液，4000rpm離心5min，用懸菌液清洗兩次。以1:10比例（10ml懸菌液放1管1.5ml菌體）放入懸菌液，加入As25mg/L（40ml中加40ulAs）不斷搖擺侵染液，使其與葉片及莖段切口處充分接觸，10min后，取出，放于滅過菌的干燥濾紙上吸干菌液；(8) 將葉片

3、及莖段放回到預(yù)培育基上，28黑暗條件下共培育2-3天，至葉片切口四周有微菌斑形成；(9) 洗菌，取出共培育的煙草葉片及莖段，用添加500mg/LCef的無菌水沖洗5次，第一次放置于搖床搖30min，后面每次5min，以洗去外植體表面的農(nóng)桿菌；(10) 取出后，用濾紙吸干，轉(zhuǎn)移到煙草誘芽培育基上，誘芽培育基為MS+ BA 1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8； 過2周觀看，假如發(fā)覺不長菌，則降低Cef濃度。假如長菌，則連續(xù)保持Cef濃度。(11) 每兩周更換一次培育基，直至長出不定芽（一般狀況為2周）。切下再生的小苗（1cm 左右），轉(zhuǎn)入繼代培育基MS+

4、 BA0.2-0.1mg/L+ Hyg25mg/L + Cef500mg/L pH5.8；(12) 至小苗長至2cm長時（有小芽即可），轉(zhuǎn)接入生根培育基MS+ NAA0.2-0.1mg/L上，24 士1、12h 光照、1500lx 培育三周左右即可長出粗大根系。(13) 對生根的植株進(jìn)行PCR初步檢測，將結(jié)果呈陽性的植株經(jīng)過煉苗后移到泥炭：蛭石=7:1的基質(zhì)中，放入人工氣候室進(jìn)行培育，并對其生長狀況進(jìn)行觀看、記錄。農(nóng)桿菌侵染液的制備(1) 取-80冰箱保存的含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，劃平板培育，LB固體平板中加入50mg/L Kan和50mg/L Rif；(2) 挑取單菌斑到含50mg/L Kan

5、和50mg/L Rif的5mL LB液體培育基中，放入搖床中28、200rpm培育過夜（12h-16h）；(3) 保存菌種，750ul菌液加入滅過菌的甘油250ul，-80冰箱保存?zhèn)溆谩?4) 搖菌，LB液體培育基10ml加Kan（所需濃度50mg/L）10ul、Rif（所需濃度50mg/L）10ul及菌液10ul，28、200rpm過夜培育（12h-16h）。(5) 當(dāng)菌液濃度達(dá)到OD600=1.5左右時，取2mL菌液加入到離心管中，4000rpm離心5min；(6) 倒掉上清液，吸1mL新的MS液體培育基，重懸農(nóng)桿菌，4000rpm離心5min。(7) 重復(fù)步驟（6）一次；(8) 用1mL

6、的MS液體培育基重懸菌后，再加入到40mL的MS的液體培育基中（含40ul 25mg/L的As），即為侵染液。放置2h以上，再侵染。200ml懸菌液 20x大量 10ml 200x有機 1ml 200x鐵鹽 1ml 200x微量 1ml 蔗糖5.6g二、煙草轉(zhuǎn)化Hyg篩選壓的確定由于所構(gòu)建的載體具有潮霉素（Hygromycin,Hyg）抗性，所以轉(zhuǎn)基因過程中需用Hyg進(jìn)行抗性苗的篩選。以MS培育基為基礎(chǔ)，添加不同Hyg濃度梯度進(jìn)行試驗，共設(shè)7個Hyg梯度：0 mg/L、5mg/L、10 mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L。取煙草葉片或莖段劃傷口后分別接種到潮霉素的誘芽培