氨對(duì)腦細(xì)胞胞漿游離鈣含量的影響

1、    氨對(duì)腦細(xì)胞胞漿游離鈣含量的影響          摘要 目的與方法：采用 Fura-2AM探針技術(shù)觀(guān)察 NH4Cl對(duì)離體急性分離之Wist ar乳鼠大腦細(xì)胞胞漿游離鈣Ca2+i含量的影響。結(jié)果：NH4 +濃度為25 mmol/L時(shí)腦細(xì)胞內(nèi)Ca2+i含量升高。在一定范圍內(nèi)，隨著NH4 +濃度的加大，細(xì)胞內(nèi)Ca2+持續(xù)升高。NH4+的升鈣作用主要被Nicardipine所阻斷 ，其變化特征類(lèi)以KCl。結(jié)論：NH4+主要通過(guò)影響電壓依賴(lài)性鈣離子通 道的開(kāi)啟而導(dǎo)致細(xì)

2、胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)。氨中毒時(shí)所引起的各種腦的功能，代謝及結(jié)構(gòu)改變有可 能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)機(jī)制實(shí)現(xiàn)。關(guān)鍵詞：氨；鈣離子；腦細(xì)胞中分類(lèi)號(hào)：R338.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-6834(2000)02-0114-03THE EFFECT OF AMMONIA ON THE FREE CALCIUM CONTENT OF ISOLATED BRAIN CELLSLI Xia-qing, HAN De-wu, ZHAO Yuan-chang(Department ot Pathophysiology, Shanxi Medical University, Ta iyuan 030001)AB

3、STRACTAim and methods: The effect of ammonium chloride on the free calcium Ca2+i content of isolated brain cell from newborn Wistar rats(2-5 d) were investigated by Fura-2/AM probe techniques in SHIMADZU RF-5000 Spectrof Iuorophotometer (Japan).Results: The Ca2+i, content in 2 .5 mmol/L of ammonium-

4、treated cells was increased. The cytoplasmic Ca2+ i content raised continuously following the increase of ammonium concentrati on. The effect of NH4+ could be blocked by Nicardipine, a kind of blocker fo r voltage-gated calcium channel, which was similar to that ot KCI.Conclus ion: NH4+ might result

5、 in the calcium homeostasis imbalance of brain c ells through interfering the voltage-gated calcium channels. Variable dysfuncti on,metabolic alteration and structural abnormality in ammonia intoxication happe ned in acute or chronic hepatic dieases might be related to the intracelluar cal cium home

6、ostasis imbalance caused by hyperammonemia.KEY WORDS： ammonia;calcium ions；brain cell近年來(lái)，人們開(kāi)始從事細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)與細(xì)胞代謝、功能及結(jié)構(gòu)變化之間關(guān)系的研究，以探討某些疾病的發(fā)病機(jī)制1,2。鈣有多種生物學(xué)功能，鈣作為第二信使參 與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、電傳導(dǎo)、酶及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)等多種生理過(guò)程。在神經(jīng)系統(tǒng)，鈣離 子是最重要的調(diào)節(jié)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的離子。高氨狀態(tài)下腦組織存在著多種代謝紊亂，神經(jīng)系統(tǒng)的多種功能受到累及，所以。在各種嚴(yán)重 肝病或先天性尿素代謝紊亂引起高氨血癥，時(shí)常合并腦病的發(fā)生。然而，在高氨時(shí)，是否

7、腦 細(xì)胞內(nèi)鈣離子的分布亦有改變目前尚不清楚。為此，本文采用體外實(shí)驗(yàn)方法觀(guān)察氨對(duì)腦細(xì)胞 胞漿游離鈣含量的影響，旨在為探討肝性腦病的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。1材料與方法11動(dòng)物及試劑動(dòng)物采用生后35 d Wistar乳鼠。Fura-2AM鈣離子熒光探針(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥物 研究所)；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司)；胰蛋白酶（Sigma公司）；牛血清白蛋白（Fluka 公司）；其余試劑皆為市售國(guó)產(chǎn)分析純。1.2腦細(xì)胞懸液制備3將腦組織置于冰冷D-Hanks液(mmol/L) NaCl 137,Na2HPO40.6,KH2PO40.4,NaHCO 33.0,Glucose 5.6,Hepes 20,p

8、H 7.4。去除小腦及腦干，小心剝?nèi)ケ砻婺X膜及血管，剪碎 ，加入適量0.25%胰酶液（Sigma)產(chǎn)品，消化10min(37）。用含0.2%小牛血清白蛋白 （BSA）的冰冷DMEM終止消化，分散細(xì)胞，濾過(guò)，制備細(xì)胞懸液。苔盼藍(lán)染色95 以上為存活細(xì)胞時(shí)方可用于實(shí)驗(yàn)。1.3Fura-2/AM負(fù)載及熒光測(cè)定上述細(xì)胞懸液37預(yù)溫5 min,加入Fura-2/AM,終濃度：5 mol/L,37水浴恒溫振蕩 40 min進(jìn)行負(fù)載。負(fù)載后，調(diào)整細(xì)胞濃度為12×106/ml，在島津（日本）RF-5 000雙波長(zhǎng)熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件：激發(fā)光柵5 nm，發(fā)射光柵10 nm，以340 nm

9、和380 nm波長(zhǎng)激發(fā)，480 nm波長(zhǎng)發(fā)射測(cè)定時(shí)依次記錄靜息狀態(tài)（細(xì)胞外鈣濃度為13 mmolL)及加入不同濃度 N H4Cl后的340380 nm的熒光比值(R)，根據(jù)下列公式求出細(xì)胞內(nèi)游離鈣Ca2+ i的含量。Ca2+ikd(F0/FS)(R-Rmin)/(Rmax-R)公式中，kd224 nmol/L;Rmax和 Rmin分別為最大值和最小值；Fo和 FS分別代表Ca2+為零和 Ca2+飽和狀態(tài)下，在380 nm波長(zhǎng)測(cè)得的熒光強(qiáng)度。 14實(shí)驗(yàn)分組(1)加入 NH4Cl組：NH4+的終濃度(mmol/L)依次為25,5及10。(2)加受體門(mén)控性鈣離子通道阻斷劑MgCl24作用5 min后

10、再加 NH4Cl組： MgCl2終濃度為400 mol/L。(3)加電壓依賴(lài)性鈣離子通道阻斷劑Nicardipine作用5 min再加 NH42結(jié)果2.1NH4+對(duì)靜息狀態(tài)下腦細(xì)胞內(nèi)游離鈣含量的影響加入25 mmol/L NH4+10 s后，腦細(xì)胞內(nèi)游離鈣含量明顯增加。增加NH4+的 濃度，其胞漿內(nèi)游離鈣含量呈遞增趨勢(shì)：當(dāng)NH4+濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)游離鈣 含量增至最高值(1)。繼續(xù)增加NH4+的濃度，游離鈣含量不再增加。     Fig.1 Effect of NH4 on the cytoplasm icCa2+i content o

11、f isolated brain cells*P<0.05, vs NH4 0(nmol/L)22鈣離子通道阻斷劑對(duì)NH4+升鈣作用的影響用受體門(mén)控性鈣離子通道阻斷劑MgCl2和電壓依賴(lài)性鈣離子通道阻斷劑Nicardiipine 分別阻斷鈣離子通道，再向懸液中加入不同濃度的NH4+。NH4+的升鈣作用基本不 受 MgCl2影響。MgCl2阻斷后,NH4+可使細(xì)胞內(nèi)游離鈣升高的百分比有所下降，但與單純加NH4+組相比其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2)。Nicardipine阻斷后，NH4+升高細(xì) 胞內(nèi)游離鈣的百分率明顯下降，與未阻斷前相比，差異具有顯著性(P005)。NH4 +升高腦細(xì)胞內(nèi)游離鈣的作

12、用主要被Nicardipine所阻斷(2)。NH4+的這種被阻斷觀(guān) 象類(lèi)似于電壓依賴(lài)性鈣離子通道阻斷劑-KCl，在同樣濃度的Nicardipine作用下，KCl的升 鈣作用幾乎可被完全阻斷(表1)。     Fig.2 Blockage effect of MgCl2 and N icardipine on NH4Cl 3討論本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將NH4Cl加入細(xì)胞懸浮液造成高氨環(huán)境時(shí)，腦細(xì)胞內(nèi)游 離鈣含量明顯升高,NH4+濃度為10 mmolL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升至最高值。Tab.1 Block effect of Nicardipi ne on the

13、 C a2+iKCl(mmol/L)0255075Before blockage 1343±1441533±1561773±153*1773±153 *After blockgage140.4±17.11458±18.51459±1651502 ±97     *P<0.05,vs KCl 0 and 25(mmol/L) 生理?xiàng)l件下，氨(NH3)在體循環(huán)內(nèi)主要以氨離子(NH4+)的形式存在(NH3+H +NH4+)5。因此,氯化銨和醋酸銨經(jīng)常被用于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中研究氨對(duì)

14、機(jī)體的 影響。Szerb等認(rèn)為5，NH4+之所以能夠引起細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度升高可能是由 于NH4+具有K+樣性質(zhì)，可與K+競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)Ki+降低，引起腦細(xì)胞 不同程度的去極化，從而導(dǎo)致電壓依賴(lài)性鈣離子通道開(kāi)放，大量的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)， 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高6。當(dāng)用Nicardipine阻斷后，氨的這種升鈣作用被 阻斷，本實(shí)驗(yàn)觀(guān)象也證實(shí)了上述論點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在實(shí)驗(yàn)性門(mén)腔分流性肝性腦病動(dòng)物及各種肝病所引起的肝性腦病病人，腦內(nèi)氨的濃度可達(dá)到25 mmol/L5。故本實(shí)驗(yàn)所選擇的NH4+濃度主要依據(jù)上述 而確定。在25 mmolLNH4+濃度內(nèi)，腦細(xì)胞內(nèi)Ca2+i含量確實(shí)表現(xiàn)升高 。普遍

15、認(rèn)為，肝性腦病屬代謝性腦病范疇，腦病發(fā)作期間神經(jīng)細(xì)胞沒(méi)有明顯的結(jié)構(gòu)損傷，腦內(nèi)的特征性改變是神經(jīng)細(xì)胞的多種功能及代謝的紊亂，如神經(jīng)傳遞功能障礙及神經(jīng)遞質(zhì)種類(lèi)改變等。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在急性肝功能衰竭及急性實(shí)驗(yàn)性高氨血癥時(shí)可發(fā)生腦細(xì)胞水腫。許多臨床與實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，這些功能代謝紊亂主要與氨中毒有關(guān)，但氨中毒同時(shí)，是否腦細(xì)胞內(nèi)鈣的穩(wěn)態(tài)也發(fā)生變化則尚有爭(zhēng)議。Benjamin等人7通過(guò)對(duì)大鼠腦片的研究發(fā) 觀(guān)，一定程度的鈣離子濃度升高可以促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)氨的解毒代謝增強(qiáng)，而當(dāng)鈣的濃度過(guò)大 時(shí)則產(chǎn)生相反的作用。另外，還有人認(rèn)為，鈣離子參與細(xì)胞體積大小的調(diào)節(jié)8。 細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)可能損傷細(xì)胞體積穩(wěn)定性調(diào)節(jié)機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)

16、胞水腫甚至凋亡。已有研究者 發(fā)現(xiàn)，高氨血癥可引起腦膠質(zhì)細(xì)胞腫脹9。是否這種腫脹為鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)所致尚需 進(jìn)一步澄清。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果可以認(rèn)為，高氨環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)游離鈣含量確有改變，氨中毒時(shí)所引起的各種功能，代謝及結(jié)構(gòu)改變有可能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)機(jī)制實(shí)現(xiàn)。作者簡(jiǎn)介：李夏青（1958-），女，河北省人，副教授，博士，從事 慢性實(shí)驗(yàn)肝功能不全的發(fā)病機(jī)理及肝性腦病發(fā)生機(jī)制的研究李夏青(山西醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，太原030001)韓德五(山西醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，太原030001)趙元昌(山西醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，太原030001)參考文獻(xiàn)1 Farber J L. The role of calc

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