EColi_感受態(tài)細胞的制備、質粒DNA的轉化、提取與酶切鑒定

1、實驗實驗5454E.Coli E.Coli 感受態(tài)細胞的制備、質粒感受態(tài)細胞的制備、質粒DNADNA的轉化、提取與酶切鑒定的轉化、提取與酶切鑒定 制作人：劉如石制作人：劉如石一一. 實驗目的和要求實驗目的和要求 1、通過本實驗了解和掌握氯化鈣法制備大腸桿菌感通過本實驗了解和掌握氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞和質粒受態(tài)細胞和質粒DNADNA轉化受體菌細胞的原理與技術；轉化受體菌細胞的原理與技術；2 2、了解質粒了解質粒DNA的特性，掌握堿裂解法從大腸桿菌的特性，掌握堿裂解法從大腸桿菌細胞中分離、提取質粒細胞中分離、提取質粒DNA的方法；的方法；3、掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電、掌握

2、限制性內(nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法；泳的操作方法； 通過本實驗了解大腸桿菌感受態(tài)細胞制備、通過本實驗了解大腸桿菌感受態(tài)細胞制備、DNA轉化、限制性內(nèi)切酶在分子生物學研究中的意義與作轉化、限制性內(nèi)切酶在分子生物學研究中的意義與作用。用。二二.實驗原理實驗原理 1 1、感受態(tài)細胞制備、感受態(tài)細胞制備: :所謂所謂感受態(tài)感受態(tài)是指受體細胞處是指受體細胞處于容易吸收外源于容易吸收外源DNADNA的一種生理狀態(tài)，可以通過物理的一種生理狀態(tài)，可以通過物理與化學方法誘導形成，也可以自然形成，在基因工與化學方法誘導形成，也可以自然形成，在基因工程技術中通常采用誘導的方法。用于轉化的受體菌程技術

3、中通常采用誘導的方法。用于轉化的受體菌細胞一般是細胞一般是限制限制- -修飾系統(tǒng)（修飾系統(tǒng)（Restriction-Restriction-ModificationModification）缺陷的變異株，以防止對導入的外缺陷的變異株，以防止對導入的外源源DNADNA的切割，用符號的切割，用符號R R- -M M- -表示。其基本原理是：細表示。其基本原理是：細菌處于菌處于00的的CaClCaCl2 2低滲溶液中，會膨脹成球形，細胞低滲溶液中，會膨脹成球形，細胞膜的通透性發(fā)生變化，轉化混合物中的質粒膜的通透性發(fā)生變化，轉化混合物中的質粒DNADNA形成形成抗抗DNaseDNase的羥基的羥基-

4、-鈣磷酸復合物黏附于細胞表面，鈣磷酸復合物黏附于細胞表面，經(jīng)經(jīng) (4) (4)、有不同來源的限制性內(nèi)切酶可以識別相同的序列，、有不同來源的限制性內(nèi)切酶可以識別相同的序列，甚至切割的位點也相同，稱為甚至切割的位點也相同，稱為同裂酶同裂酶或或異源同工酶異源同工酶，如，如Hpa IIHpa II與與Msp IMsp I；有的識別位點不同，但對；有的識別位點不同，但對DNADNA切割后可產(chǎn)切割后可產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為生相同的粘性末端，稱為同尾酶同尾酶，如，如BamHBamH I I與與BglBgl IIII。色，可確定色，可確定DNA在膠中的位置。在膠中的位置。 影響瓊脂糖凝膠電泳影響瓊脂糖凝膠電

5、泳DNADNA遷移率的因素：遷移率的因素： DNADNA的分子大小；的分子大??； 瓊脂糖濃度；瓊脂糖濃度； DNADNA構象；構象； 電場強度；電場強度； 堿基組成與溫度；嵌入染料的存在；電泳緩沖液的組成。堿基組成與溫度；嵌入染料的存在；電泳緩沖液的組成。 三實驗材料與設備：三實驗材料與設備：1 1、用品與與儀器：、用品與與儀器： 超凈工作臺、電熱恒溫水浴、分光光度計、恒溫培養(yǎng)超凈工作臺、電熱恒溫水浴、分光光度計、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、移液器、微型離心管等、臺式冷凍高速箱、恒溫振蕩器、移液器、微型離心管等、臺式冷凍高速離心機、旋渦震蕩器、電泳儀、電泳槽、紫外透射儀，凝離心機、旋渦震蕩器、電泳

6、儀、電泳槽、紫外透射儀，凝膠成像儀、冰箱、制冰機等；膠成像儀、冰箱、制冰機等； 1.5mL 1.5mL 與與0.5mL Eppendorf 0.5mL Eppendorf 管、管、tiptip頭頭 、燒杯、量、燒杯、量筒筒四操作步驟四操作步驟: ( (一一) ) 感受態(tài)細胞的制備：感受態(tài)細胞的制備： 1 1、從新活化的、從新活化的E.coliE.coli DH5 DH5平板上挑取一平板上挑取一單菌落單菌落，接種于接種于3 35ml LB5ml LB液體培養(yǎng)中，液體培養(yǎng)中，3737振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期期( (12h左右左右) )； 2 2、將該菌懸液以、將該菌懸液以1:1001

7、:1001:501:50轉接于轉接于100ml LB100ml LB液體液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，3737振蕩擴大培養(yǎng)，當培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁振蕩擴大培養(yǎng)，當培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔后，每隔202030min30min測一次測一次ODOD600600，至，至ODOD600600為為0.30.30.50.5時停時停止培養(yǎng)，并轉裝到止培養(yǎng)，并轉裝到1.5 mL1.5 mL離心管中；離心管中； 3 3、培養(yǎng)物于冰上放置、培養(yǎng)物于冰上放置20min20min； 4 4、 0 044，4000g4000g離心離心10min10min，棄去上清液，加入，棄去上清液，加入1 1 mLmL冰冷的冰冷的0.1mo

8、10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液，小心懸浮細胞溶液，小心懸浮細胞, , 冰浴冰浴2020分鐘；分鐘；CaClCaCl2 2純度至關重要，不同廠家，純度至關重要，不同廠家，甚至同一廠家不同批號的產(chǎn)品均影響感受態(tài)的轉化效率甚至同一廠家不同批號的產(chǎn)品均影響感受態(tài)的轉化效率 5、04， 4000g離心離心10min，倒凈上清培養(yǎng)液，倒凈上清培養(yǎng)液，再用再用1.0 mL1.0 mL冰冷的冰冷的0.1mo10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液溶液輕輕懸浮輕輕懸浮細胞，細胞，冰浴冰浴20min20min； 6 6、 04， 4000g離心離心10min，棄去上清液，加入棄去上清液，

9、加入100 L100 L冰冷的冰冷的0.1mo10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液，溶液，小心懸浮細胞小心懸浮細胞，冰，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細胞懸液；上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細胞懸液； 8 8、制備好的感受態(tài)細胞懸液可直接用于轉化實驗，、制備好的感受態(tài)細胞懸液可直接用于轉化實驗，如果在如果在4 4放置放置1224h，其轉化效率可以增高，其轉化效率可以增高46倍倍；也可加入占總體積也可加入占總體積1515左右高壓滅菌過的甘油，混勻后左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于分裝于1.5ml1.5ml離心管中，置于離心管中，置于-70-70條件下，可保存半年條件下，可保存半年至一

10、年。至一年。（二）質粒（二）質粒DNADNA的轉化：的轉化： 1 1、每、每100L100L感受態(tài)細胞懸液中加入感受態(tài)細胞懸液中加入1L1L質粒質粒DNA,DNA,輕輕輕輕搖勻，同時設置三組對照：搖勻，同時設置三組對照：( (1)1)不加質粒，不加質粒，(2)不加受體不加受體菌，菌， (3)加已知具有轉化活性的質粒加已知具有轉化活性的質粒DNA，具體操作按具體操作按下表進行：下表進行：*陽性對照，用已知具有轉化活性的pGEX-PDIP-r質粒DNA進行轉化 五五. 實驗結果報告：實驗結果報告： 1、轉化效率的計算、轉化效率的計算 ： 轉化子總數(shù)菌落數(shù)（轉化反應原液總體積轉化子總數(shù)菌落數(shù)（轉化反應原液總體積/涂涂板菌液體積）板菌液體積） 轉化