生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)LSW

1、實(shí)驗(yàn)一 植物DNA的提取與測(cè)定一、目的本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍W(xué)習(xí)從植物材料中提取和測(cè)定DNA的原理和方法，進(jìn)一步了解DNA的性質(zhì)。二、原理細(xì)胞中的DNA絕大多數(shù)以DNA-蛋白復(fù)合物（DNP）的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)。提取DNA時(shí)，一般先破碎細(xì)胞釋放出DNP，再用含少量異戊醇的氯仿除去蛋白質(zhì)，最后用乙醇把DNA從抽提液中沉淀出來(lái)。DNP與核糖核蛋白（RNP）在不同濃度的電解質(zhì)溶液中溶解度差別很大，利用這一特性可將二者分離。以NaCl溶液為例：RNP在0.14 mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度僅為純水中的1。當(dāng)NaCl濃度逐漸增大時(shí)，RNP的溶解度變化不大，而DNP的溶解則隨之不斷增加。

2、當(dāng)NaCl濃度大于1mol/L時(shí)，DNP的溶解度最大，為純水中溶解度的2倍，因此通常可用1.4 mol/L NaCl提取DNA。為了得到純的DNA制品，可用適量的RNase處理提取液，以降解DNA中攙雜的RNA。關(guān)于植物總DNA的提取主要有兩種方法：1 CTAB法：CTAB（十六烷基三甲基溴化銨，hexadecyltrimethylammonium bromide, 簡(jiǎn)稱CTAB）：是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽的濃度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）時(shí)從溶液中沉淀，通過(guò)離心就可將CTAB與核酸

3、的復(fù)合物同蛋白、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。2 SDS法：利用高濃度的陰離子去垢劑SDS（sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉）使DNA與蛋白質(zhì)分離，在高溫（5565）條件下裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物體的基因組DNA為107109 bp，在基因克隆工作中，通常要求制備的大分子DNA的分子量為克隆片段長(zhǎng)度的4倍以上，否則會(huì)

4、由于制備過(guò)程中隨機(jī)斷裂的末端多為平末端，導(dǎo)致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，嚴(yán)重影響克隆工作。因此有效制備大分子DNA的方法必須考慮兩個(gè)原則：（1）盡量去除蛋白質(zhì)、RNA、次生代謝物質(zhì)（如多酚、類黃酮等）、多糖等雜質(zhì)，并防止和抑制內(nèi)源DNase對(duì)DNA的降解。（2）盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞。幾乎所有的DNase都需要Mg2+或Mn2+為輔因子，故實(shí)現(xiàn)（1）盡量去除蛋白質(zhì)的要求，需加入一定濃度的螯合劑，如EDTA、檸檬酸，而且整個(gè)提取過(guò)程應(yīng)在較低溫度下進(jìn)行（一般利用液氮或冰浴）。為實(shí)現(xiàn)（2）需要在DNA處于溶解狀態(tài)時(shí)，盡量減弱溶液的渦旋，而且動(dòng)作要輕柔，在進(jìn)行DNA溶液轉(zhuǎn)移

5、時(shí)用大口（或剪口）吸管。提取的DNA是否為純凈、雙鏈、高分子的化合物，一般要通過(guò)紫外吸收、化學(xué)測(cè)定、“熔點(diǎn)”（melting temperature, Tm）測(cè)定、電鏡觀察及電泳分離等方法鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用CTAB法提取DNA并通過(guò)紫外吸收法鑒定。三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑1實(shí)驗(yàn)材料新鮮菠菜幼嫩組織、花椰菜花冠或小麥黃化苗等2主要儀器（1）高速冷凍離心機(jī) （2）751型分光光度計(jì)（3）恒溫水浴（3）液氮或冰浴設(shè)備（4）磨口錐形瓶3試劑（CTAB法）（1）CTAB提取緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4 mol/L NaCl

6、（如表1），2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的-巰基乙醇。表1 CTAB提取緩沖液配制試劑名稱M.W.配制1 000ml配制500mlTris121.1412.114 g6.057 gEDTA-Na2372.247.4448 g3.7224 gNaCl58.4481.816 g40.908 g用HCl調(diào)pH值。（2）TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（ pH8.0）。（3）DNase-free RNase A: 溶解RNase A于TE緩沖液中，濃度為10mg/ml，煮沸1030min, 除去DNase活性，20貯存（DNase為DNA酶，RNase

7、為RNA酶）。（4）氯仿-異戊醇混合液（24:1，V/V）：240ml氯仿（A. R.）加10mL異戊醇（A.R.）混勻。（5）3mol/L乙酸鈉（NaAc，pH6.8）：稱取NaAc·3H2O 81.62 g，用蒸餾水溶解，配制成200 ml，用HAc調(diào)pH至6.5。（6）無(wú)水乙醇TE緩沖液，Tris-HCl（pH8.0）液，NaAc溶液均需要高壓滅菌。四、操作步驟(1) DNA抽提1稱取25 g新鮮菠菜幼嫩組織或小麥黃花苗等植物材料，用自來(lái)水、蒸餾水先后沖洗葉面，用濾紙吸干水分備用。葉片稱重后剪成1cm長(zhǎng)，置研缽中，經(jīng)液氮冷凍后研磨成粉末。待液氮蒸發(fā)完后，加入15mL預(yù)熱（606

8、5）的CTAB提取緩沖液，轉(zhuǎn)入一磨口錐形瓶中，置于65水浴保溫，0.51 h，不時(shí)地輕輕搖動(dòng)混勻。2加等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，蓋上瓶塞，溫和搖動(dòng)，使成乳狀液。3將錐形瓶中的液體轉(zhuǎn)移到離心管中，在室溫下4 000 r/min離心5min，靜置，離心管中出現(xiàn)3層，小心地吸取含有核酸的上清到另一干凈的離心管中 (注意吸取上清時(shí)不能吸入界面物質(zhì))，棄去中間層的細(xì)胞碎片和變性蛋白以及下層的氯仿。4根據(jù)需要，上清液可用氯仿/異戊醇反復(fù)提取多次。5在抽提后的上清液中加入1/10倍體積的3 mol/L NaAc（pH6.8）和2倍體積的95乙醇，混勻，室溫放置5 min，以10 000 r/min離

9、心5min，傾去乙醇液，將離心管倒置于吸水紙上，吸干液體。6加入1 ml 70乙醇洗滌DNA沉淀，按步驟5所述方法棄上清，于空氣中或用電吹冷風(fēng)使DNA沉淀干燥。7用適量含RNase A酶（20 g/ml）的TE溶解DNA。(2) DNA含量及純度測(cè)定1吸取5 l DNA樣品，加水至1 ml，混勻后轉(zhuǎn)入石英比色杯中。2分光光度計(jì)先用1 ml蒸餾水校正零點(diǎn)。3在260 nm紫外光波長(zhǎng)下讀出光密度值，代入下式計(jì)算DNA的含量。4測(cè)OD260/ OD280值，DNA純品的OD260/ OD280值為1.8。如果OD260/ OD280值大于1.8，說(shuō)明存在RNA，可以考慮用RNA酶處理樣品；小于1.6

10、，說(shuō)明樣品中存在蛋白質(zhì)，應(yīng)再用酚/氯仿抽提以及氯仿單獨(dú)抽提，之后用乙醇沉淀純化DNA。五、結(jié)果計(jì)算DNA濃度（g/ml）OD260×稀釋倍數(shù)0.020×L式中OD260 為260 nm處的光密度；L為比色杯光徑（cm）；0.020為1 g/ml DNA鈉鹽的光密度。六、附注如果植物樣品不經(jīng)液氮處理，提取液中的CTAB濃度需要提高到4%（W/V）。在許多情況下，使用0.1%（V/V）巰基乙醇，并不能完全抑制葉片中的氧化作用，但是，這種氧化作用不會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。如果使用的巰基乙醇濃度高于0.1%（V/V），則會(huì)大大降低DNA的得率。七、思考題1制備的DNA在什么溶液中

11、較穩(wěn)定?2為了保證植物DNA的完整性，在吸取樣品、抽提過(guò)程中應(yīng)注意什么？實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)測(cè)定一、目的 （1）通過(guò)實(shí)驗(yàn)了解蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)與蛋白質(zhì)分子聚沉的關(guān)系。（2）掌握通過(guò)聚沉測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的方法。二、原理 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。蛋白質(zhì)分子中可以解離的基團(tuán)除N端氨基與C端羧基外，還有肽鏈上某些氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)，如酚基、巰基、胍基、咪唑基等基團(tuán)，它們都能解離為帶電基團(tuán)。因此，在蛋白質(zhì)溶液中存在著下列平衡：蛋白質(zhì)分子陰離子 兩性離子 陽(yáng)離子 pH > pI pH = pI pH < pI電場(chǎng)中： 移向陽(yáng)極 不移動(dòng) 移向陰極 調(diào)節(jié)溶液的p

12、H使蛋白質(zhì)分子的酸性解離與堿性解離相等，即所帶正負(fù)電荷相等，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度最小，溶液的混濁度最大，配制不同pH的緩沖液，觀察蛋白質(zhì)在這些緩沖液中的溶解情況即可確定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。三、儀器和試劑 1儀器 試管架；試管：15ml×6；刻度吸管：1ml×4，2ml×4，10ml×2；膠頭吸管×2。2試劑(1) 1mol/L乙酸：吸取99.5%乙酸（比重1.05）2.875ml，加水至50ml。 (2) 0.1mol/L乙酸：吸取1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。 (3

13、) 0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。(4) 0.2mol/LNaOH：稱取NaOH2.000g，加水至50ml，配成1mol/LNaOH。然后量取1mol/L NaOH 10ml，加水至50ml,配成0.2mol/L NaOH。(5) 0.2mol/L鹽酸：吸取37.2%（比重1.19）鹽酸4.17ml，加水至50ml，配成1mol/L鹽酸。然后吸取1mol/L鹽酸10ml，加水至50ml，配成0.2mol/L鹽酸。(6) 0.01%溴甲酚綠指示劑：稱取溴甲酚綠0.005g，加0.29ml 1mol/L NaOH，然后加水至50ml。(7) 0.5%酪蛋

14、白溶液：稱取酪蛋白（干酪素）0.25g放入50ml容量瓶中，加入約20ml水，再準(zhǔn)確加入1mol/L NaOH 5ml，當(dāng)酪蛋白溶解后，準(zhǔn)確加入1mol/L乙酸5ml，最后加水稀釋定容至50ml，充分搖勻。四、操作方法  1蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)（1）取一支試管，加0.5%酪蛋白1ml，再加溴甲酚綠指示劑4滴，搖勻。此時(shí)溶液呈藍(lán)色，無(wú)沉淀生成。（2）用膠頭吸管慢慢加入0.2 mol/L鹽酸，邊加邊搖至有大量沉淀生成。此時(shí)溶液的pH值接近酪蛋白的等電點(diǎn)。觀察溶液顏色的變化。（3）繼續(xù)滴加0.2 mol/L鹽酸，沉淀會(huì)逐漸減少以至消失。觀察此時(shí)溶液顏色的變化。（4）滴加0.2mol/

15、L NaOH 進(jìn)行中和，沉淀又出現(xiàn)，繼續(xù)滴加0.2 mol/L NaOH，沉淀又逐漸消失。觀察溶液顏色的變化。解釋以上(1)(4)的顏色及沉淀變化的原因。注：溴甲酚綠的變化范圍pH3.8 (黃色) 5.4 (藍(lán)色)，pH4.5時(shí)開始有顏色變化。2. 酪蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定（1）取同樣規(guī)格的試管7支，按下表精確地加入下列試劑：試劑（ml）管 號(hào)12345671.0mol/L 乙酸1.60.8000000.1mol/L 乙酸00410000.01mol/L 乙酸00002.51.250.62蒸餾水2.43.2031.52.753.38溶液的pH3.53.84.14.75.35.65.9（2）充分搖勻，

16、然后向以上各試管依次加入0.5%酪蛋白1ml，邊加邊搖，搖勻后靜置5 min，觀察各管的混濁度。（3）用-、±、+、+、+等符號(hào)表示各管的混濁度。根據(jù)混濁度判斷酪蛋白的等電點(diǎn)，最混濁一管的pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn)。 五、注意事項(xiàng) 緩沖液的pH值必須準(zhǔn)確。 六、思考題1解釋蛋白質(zhì)兩性反應(yīng)中顏色及沉淀變化的原因。2該方法測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的原理是什么？實(shí)驗(yàn)三 雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量一、目的 掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。掌握分光光度計(jì)的使用方法。二、原理 堿性溶液中雙縮脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）能與 Cu2+ 產(chǎn)生紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)

17、稱為“雙縮脲反應(yīng)”。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵也能與銅離子發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，溶液紫紅色的深淺與蛋白質(zhì)含量在一定范圍內(nèi)符合朗伯-比爾定律，而與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子質(zhì)量無(wú)關(guān)。其可測(cè)定范圍為 1- l0 mg 蛋白質(zhì)，適用于精度要求不高的蛋白質(zhì)含量測(cè)定。Tris，一些氨基酸，EDTA等會(huì)干擾該測(cè)定。 三、器材、試劑和材料 1器材 （1) 分光光度計(jì) （2）分析天平 （3）振蕩器 （4）刻度吸管： 1 m1×2， 5 m1×2， 10 m1×1 （5）具塞三角瓶： 100 ml （6）漏斗： 13個(gè) 2試劑 （1）雙縮脲試劑：取硫酸銅（CuSO4 · 5H2O）1.5

18、g 和酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6 · 4H2O） 6.0 g ，溶于500 m1蒸餾水中，在攪拌的同時(shí)加入 300 m1 10% NaOH 溶液，定容至 1000 ml ，保存于塑料試劑瓶中或內(nèi)壁涂一層純凈石蠟的普通試劑瓶中。如無(wú)紅色或黑色沉淀出現(xiàn)，此試劑可長(zhǎng)期使用。 （2） 0.05 mol/L 的 NaOH 。 (3) 標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液：準(zhǔn)確稱取酪蛋白 0.5 g 溶于 0.05 mol/ L 的 NaOH 溶液中，并定容至 100 m1, 即為 5 mg/m1 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 3材料 小麥、玉米或其它谷物樣品，風(fēng)干、磨碎并通過(guò)100目銅篩。 四、操作步驟 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取

19、6 支試管，編號(hào)，按下表加入試劑： 試劑管號(hào)123456標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液（ml）00.20.40.60.81.0H2O（ml）10.80.60.40.20雙縮脲試劑（ml）444444蛋白質(zhì)含量（mg）012345A 540 nm振蕩15 min，室溫靜置 30 min，540 nm 比色，以蛋白質(zhì)含量(mg)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2樣品測(cè)定（1）將磨碎過(guò)篩的谷物樣品在 80 下烘至恒重(連續(xù)兩次稱重差值不超過(guò)0.5 mg)，取出置于燥器中冷卻待用。 （2）稱取烘干樣品約 0.2 g 兩份，分別放入兩個(gè)干燥的三角瓶中。然后在各瓶中分別加入5 ml 0.05mol/L 的NaOH

20、溶液濕潤(rùn)，之后再加入20 ml的雙縮脲試劑，振蕩15 min，室溫靜置反應(yīng)30 min，分別過(guò)濾，取濾液在 540 nm 波長(zhǎng)下比色，讀取吸光度。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量(mg)。 五、結(jié)果計(jì)算 六、注意事項(xiàng) 1三角瓶一定要干燥，勿使樣品粘在瓶壁上。 2所用酪蛋白需經(jīng)凱氏定氮法確定蛋白質(zhì)的含量。 七、思考題 1. 干擾本實(shí)驗(yàn)的因素有哪些？2. 雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理是什么?實(shí)驗(yàn)四 溫度、pH及酶的激活劑、 抑制劑對(duì)酶活性的影響一、目的 1. 鞏固溫度、pH值、激活劑、抑制劑對(duì)酶活性影響的認(rèn)識(shí)。2. 學(xué)習(xí)測(cè)定酶的最適溫度、最適pH值的簡(jiǎn)單方法，學(xué)習(xí)檢測(cè)激活劑和抑制劑的方法

21、。二、原理 酶是指化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)的生物催化劑。在一定條件下，酶促化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的能力即稱為酶活性（酶活力）。影響酶活性的因素是多方面的，如溫度、pH及某些化學(xué)物質(zhì)等都會(huì)影響酶的催化活性。在一定條件下，能使酶活性達(dá)到最高時(shí)的溫度即酶的最適溫度，而能使酶活性達(dá)到最高時(shí)的pH即酶的最適pH。例如，唾液淀粉酶的最適溫度是37，而其最適pH是6.8。能增高酶活性的物質(zhì)稱為酶的激活劑，能降低酶活性卻又不使酶變性的物質(zhì)叫酶的抑制劑。凡能使蛋白質(zhì)變性的因素都可以使酶變性而喪失活性。酶活性通常是通過(guò)測(cè)定酶促化學(xué)反應(yīng)的底物或產(chǎn)物量的變化來(lái)進(jìn)行觀察的。本實(shí)驗(yàn)用唾液淀粉酶為材料來(lái)觀察酶活性受理化因素影響的情

22、況。唾液中含有唾液淀粉酶，淀粉在該酶的催化作用下會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)不同程度的水解，從而得到各種糊精乃至麥芽糖、少量葡萄糖等水解產(chǎn)物。而碘液能指示淀粉的水解程度淀粉遇碘可呈紫色、暗褐色與紅色，而麥芽糖與葡萄糖遇碘則不呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，如圖所示：淀粉酶淀粉酶 淀粉 糊精 麥芽糖+少量葡萄糖（棕黃色，碘本身顏色）加碘后：（藍(lán)色）（紫紅色、暗褐色或紅色等）三、器材和試劑 1器材試管 (10 mm×100 mm)；試管架；電熱恒溫水浴箱；沸水浴；冰浴；多孔白瓷板 (或比色盤)；滴管2試劑(1) 0.5%淀粉溶液：稱取可溶性淀粉0.5 g加蒸餾水少許攪拌成糊狀，然后用煮沸的1%氯化鈉溶

23、液稀釋到100 ml。(2) 碘化鉀碘溶液：取碘化鉀2 g及碘1.27 g溶解于200 ml蒸餾水中，使用前用蒸餾水稀釋5倍。(3) 1%淀粉溶液：稱取可溶性淀粉1.0 g加蒸餾水100 ml，煮沸溶解。(4) 1%CuSO4溶液：稱取1 g CuSO45H2O，用蒸餾水溶解至100 ml。(5) 磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液 pH5.0-8.0A0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱25.62 g Na2HPO42H2O，用蒸餾水溶解后，定容至1000 ml；B0.1 mol/L檸檬酸溶液：稱19.21 g 無(wú)水檸檬酸，用蒸餾水溶解后定容至1000 ml。用A、B兩種溶液，按附錄方法，配制pH5.0

24、、pH6.8、pH8.0各10 ml。(6) 0.5%NaCl溶液。(7) 唾液淀粉酶制備：每人用自來(lái)水漱口3次，然后取20 ml蒸餾水含于口中，半分鐘后吐入燒杯中，稀釋至40 ml為稀釋唾液，供實(shí)驗(yàn)用。四、操作方法 (一) 溫度對(duì)酶活性的影響1取3支大試管，編號(hào)后按下表操作試 管 號(hào)0.5%淀粉溶液稀釋唾液1溫 度15 ml1 ml0水浴25 ml1 ml37水浴35 ml1 ml沸水浴2在白色比色盤上，置碘液2滴于各孔中，自試管放入水浴后，每隔1 min，從第二管中取反應(yīng)液1滴與碘液混合，觀察顏色變化。3待第二管中反應(yīng)液遇碘不發(fā)生顏色變化 (即只呈碘的顏色)時(shí)，向各管中加入碘液1

25、滴，搖勻，觀察并記錄各管顏色，說(shuō)明溫度對(duì)酶活性的影響。(二) pH對(duì)酶活性的影響21取試管3支，按下表操作試管號(hào)0.5%淀粉溶液pH5.0緩沖液pH6.8緩沖液pH8.0緩沖液稀釋唾液12 ml3 ml001 ml22 ml03 ml01 ml32 ml003 ml1 ml2將3支試管放入37水浴中，并在白色比色盤上用碘液檢查第二管，待碘液不變色時(shí)，向各管加碘液幾滴，觀察并記錄各管顏色。(三) 酶的激活劑及抑制劑對(duì)酶活性的影響1取小試管3支，按下表操作試管號(hào)1%淀粉溶液1%CuSO4溶液30.5%NaCl溶液4蒸餾水稀釋唾液12 ml1 ml001 ml22 ml01 ml01 ml32 ml

26、001 ml1 ml2將3支試管放入37水浴中，并在白色比色盤上用碘液檢查第二管，待碘液不變色時(shí)，向各管加碘液1滴，觀察水解情況，記錄并解釋結(jié)果。注：1 稀釋唾液加入時(shí)應(yīng)迅速，其中加入沸水浴的一管，當(dāng)唾液加入后應(yīng)立即放入沸水浴。2 酶的最適pH受緩沖液性質(zhì)的影響。如唾液淀粉酶的最適pH為6.8，但在磷酸緩沖液中，其最適pH為6.46.6，在醋酸緩沖液中則為5.6。3 CuSO4溶液為唾液淀粉酶的抑制劑。4 NaCl溶液為唾液淀粉酶的激活劑。激活劑和抑制劑不是絕對(duì)的，有些物質(zhì)在低濃度時(shí)為激活劑，而在高濃度時(shí)則為該酶的抑制劑。例如，氯化鈉到1/3飽和度時(shí)就抑制唾液淀粉酶的活性。實(shí)驗(yàn)五 還原糖和總糖

27、的測(cè)定3,5-二硝基水楊酸比色法一、目的掌握還原糖和總糖測(cè)定的基本原理，學(xué)習(xí)比色法測(cè)定還原糖的操作方法和分光光度計(jì)的使用。二、原理還原糖的測(cè)定是糖定量測(cè)定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來(lái)，對(duì)沒(méi)有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測(cè)定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計(jì)）。還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。

28、在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計(jì)，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時(shí)，每斷裂一個(gè)糖苷鍵需加入一分子水，所以在計(jì)算多糖含量時(shí)應(yīng)乘以0.9。三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑1 實(shí)驗(yàn)材料小麥面粉；精密pH試紙。2 主要儀器（1）具塞玻璃刻度試管：20 ml×11（2）大離心管：50 ml×2（3）燒杯：100 ml×1（4）三角瓶：100 ml×1（5）容量瓶：100 ml×3（6）刻度吸管：1 ml×1；2 ml×2；1

29、0 ml×1（7）恒溫水浴鍋（8）沸水?。?）離心機(jī)（10）扭力天平（11）分光光度計(jì)3 試劑（1）1 mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取80烘至恒重的分析純葡萄糖100 mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容至100 ml，混勻，4冰箱中保存?zhèn)溆?。?）3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑將6.3 g DNS和262 ml 2M NaOH溶液，加到500 ml含有185 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g結(jié)晶酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000 ml，貯于棕色瓶中備用。（3）碘-碘化鉀溶液：稱取5 g碘和10 g碘化鉀，溶

30、于100 ml蒸餾水中。（4）酚酞指示劑：稱取0.1 g酚酞，溶于250 ml 70%乙醇中。（5）6 M HCl和6 M NaOH各100 ml。四、操作步驟1 制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支20 ml具塞刻度試管編號(hào)，按表4.1分別加入濃度為1 mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。表4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作管 號(hào)1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml）蒸餾水（ml）DNS（ml）葡萄糖含量（mg）光密度值（OD540 nm）0021.50 10.21.81.50.2 20.41.61.50.4 30.61.41

31、.50.6 40.81.21.50.8 51.01.01.51.0 61.20.81.51.2 將各管搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5 min，取出，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至20 ml，加塞后顛倒混勻，在分光光度計(jì)上進(jìn)行比色。調(diào)波長(zhǎng)540 nm，用0號(hào)管調(diào)零點(diǎn)，測(cè)出16號(hào)管的光密度值。以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 樣品中還原糖和總糖的測(cè)定（1）還原糖的提取準(zhǔn)確稱取3.00 g食用面粉，放入100 ml燒杯中，先用少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加入50 ml蒸餾水，攪勻，置于50恒溫水浴中保溫20 min，使還原糖浸出。

32、將浸出液（含沉淀）轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中，于4 000 r/min下離心5 min，沉淀可用20 ml蒸餾水洗一次，再離心，將二次離心的上清液收集在100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測(cè)液。（2）總糖的水解和提取準(zhǔn)確稱取1.00 g食用面粉，放入100 ml三角瓶中，加15 ml蒸餾水及10 ml 6M HCl，置沸水浴中加熱水解30 min（水解是否完全可用碘-碘化鉀溶液檢查）。待三角瓶中的水解液冷卻后，加入1滴酚酞指示劑，用6 mol/L NaOH中和至微紅色，用蒸餾水定容在100 ml容量瓶中，混勻。將定容后的水解液過(guò)濾，取濾液10 ml，移入另一100 ml容

33、量瓶中定容，混勻，作為總糖待測(cè)液。（3）顯色和比色取4支20 ml具塞刻度試管，編號(hào)，按表2所示分別加入待測(cè)液和顯色劑，空白調(diào)零可使用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的0號(hào)管。加熱、定容和比色等其余操作與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同。表4.2 樣品還原糖測(cè)定管 號(hào)還原糖待測(cè)液（ml）總糖待測(cè)液（ml）蒸餾水（ml）DNS（ml）光密度值（OD540 nm）查曲線葡萄糖量（mg）70.5 1.51.5  80.5 1.51.5  9 111.5  10 111.5  五、結(jié)果與計(jì)算計(jì)算出7、8號(hào)管光密度值的平

34、均值和9、10管光密度值的平均值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上分別查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)，按下式計(jì)算出樣品中還原糖和總糖的百分含量。 還原糖含量=查曲線所得葡萄糖毫克數(shù)× 提取液總體積測(cè)定時(shí)取用體積×100%樣品毫克數(shù) 總糖含量=查曲線所得水解后還原糖毫克數(shù)×稀釋倍數(shù)×0.9×100%樣品毫克數(shù)六、附注1 離心時(shí)對(duì)稱位置的離心管必須配平。2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與樣品測(cè)定應(yīng)同時(shí)進(jìn)行顯色，并使用同一空白調(diào)零點(diǎn)和比色。3 面粉中還原糖含量較少，計(jì)算總糖時(shí)可將其合并入多糖一起考慮。七、思考題13,5-二硝基水楊酸比色法是如何對(duì)總糖進(jìn)行測(cè)定的?2如何正確繪制和使用標(biāo)

35、準(zhǔn)曲線?實(shí)驗(yàn)六 糖的顏色反應(yīng)和定性鑒定一、目的(1) 學(xué)習(xí)鑒定糖類及區(qū)分酮糖和醛糖的方法。 (2) 了解鑒定還原糖的方法及其原理。二、糖的顏色反應(yīng). Molish反應(yīng)-萘酚反應(yīng)1 實(shí)驗(yàn)原理糖在濃硫酸或濃鹽酸的作用下脫水形成糠醛及其衍生物與-萘酚作用形成紫紅色復(fù)合物，在糖液和濃硫酸的液面間形成紫環(huán)，因此又稱紫環(huán)反應(yīng)。自由存在和結(jié)合存在的糖均呈陽(yáng)性反應(yīng)。此外，各種糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈顏色近似的陽(yáng)性反應(yīng)。因此，陰性反應(yīng)證明沒(méi)有糖類物質(zhì)的存在；而陽(yáng)性反應(yīng)，則說(shuō)明有糖存在的可能性，需要進(jìn)一步通過(guò)其他糖的定性試驗(yàn)才能確定有糖的存在。2 試劑Molish試劑：取5 g -萘酚用95

36、%乙醇溶解至100 ml，臨用前配制，棕色瓶保存。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。3 操作方法取試管，編號(hào)，分別加入各待測(cè)糖溶液1 ml，然后加兩滴Molish試劑，搖勻。傾斜試管，沿管壁小心加入約1 ml濃硫酸，切勿搖動(dòng)，小心豎直后仔細(xì)觀察兩層液面交界處的顏色變化。用水代替糖溶液，重復(fù)一遍，觀察結(jié)果。. 蒽酮反應(yīng)1 實(shí)驗(yàn)原理糖經(jīng)濃酸作用后生成的糠醛及其衍生物與蒽酮（10-酮-9,10-二氫蒽）作用生成藍(lán)綠色復(fù)合物。2 試劑蒽酮試劑：取0.2 g 蒽酮溶于100 ml 濃硫酸中，當(dāng)日配制。待測(cè)糖溶液，同Molish試驗(yàn)。3 操作方法取試管，編號(hào)，均加入1 ml蒽酮溶液，再向各管滴加

37、2 3滴待測(cè)糖溶液，充分混勻，觀察各管顏色變化并記錄。. 酮糖的Seliwanoff反應(yīng)1 實(shí)驗(yàn)原理該反應(yīng)是鑒定酮糖的特殊反應(yīng)。酮糖在酸的作用下較醛糖更易生成羥甲基糠醛，它與間苯二酚作用生成鮮紅色復(fù)合物，反應(yīng)僅需20-30秒。醛糖在濃度較高時(shí)或長(zhǎng)時(shí)間煮沸，才產(chǎn)生微弱的陽(yáng)性反應(yīng)。2 試劑Seliwanoff試劑：0.5 g 間苯二酚溶于1升鹽酸（H2OHCl=21）(V/V) 中，臨用前配制。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%果糖溶液。3 操作方法取試管，編號(hào)，各加入Seliwanoff試劑1 ml，再依次分別加入待測(cè)糖溶液各4滴，混勻，同時(shí)©放入沸水浴中，比較各管顏色的變化過(guò)程。. Fehling (菲林) 試驗(yàn)1 實(shí)驗(yàn)原理菲林試劑是含有硫酸銅和酒石酸鉀鈉的氫氧化鈉溶液。硫酸銅與堿溶液混合加熱，則生成黑色的氧化銅沉淀。若同時(shí)有還原糖存在，則產(chǎn)生黃色或磚紅色的氧化亞銅沉淀。為防止銅離子和堿反應(yīng)生成氫氧化銅或堿性碳酸銅沉淀，F(xiàn)ehling試劑中加入酒石酸鉀鈉，它與Cu2+形成的酒石酸鉀鈉絡(luò)合銅離子是可溶性的絡(luò)離子，該反應(yīng)是可逆的。平衡后溶液內(nèi)保持一定濃度的氫氧化銅。菲林試劑是一種弱的氧化劑，它不與酮和芳香醛發(fā)生反應(yīng)。2 試劑試劑甲：稱取34.5 g硫酸銅溶于500 ml蒸餾水中。試劑乙：稱取1