馬齒莧甜菜紅素抗腫瘤實驗研究

1、馬齒莧甜菜紅素抗腫瘤實驗研究         【摘要】目的觀察馬齒莧甜菜紅素聯(lián)合環(huán)磷酰胺(CTX)的抗腫瘤作用。方法將接種S180瘤細胞的小鼠分為荷瘤對照組、CTX組、馬齒莧甜菜紅素(高、中、低劑量)+CTX組。給藥10 d，進行抑瘤率 計算 ，以及外周血常規(guī)、骨髓有核細胞計數(shù)、脾臟、胸腺指數(shù)、免疫球蛋白、肝腎功能等的檢測。結果與荷瘤對照組相比，CTX組腫瘤生長明顯受到抑制。馬齒莧甜菜紅素低、中、高劑量聯(lián)合CTX各組抑瘤率明顯高于CTX組的抑瘤率。與荷瘤對照組相比，單一CTX處理組脾臟和胸腺指數(shù)、IgA、IgG、I

2、gM水平明顯降低，WBC、PLT和骨髓有核細胞計數(shù)降低，ALT、BUN升高。不同劑量的馬齒莧甜菜紅素聯(lián)合CTX處理，可以不同程度地改善脾臟和胸腺指數(shù)、IgG、IgM等免疫水平指標，提高WBC、PLT和骨髓有核細胞的數(shù)量，降低ALT和BUN。結論馬齒莧甜菜紅素對小鼠S180肉瘤有抑制作用，對化療藥物CTX抗S180小鼠具有增效減毒的作用。 【關鍵詞】   馬齒莧甜菜紅素抗腫瘤環(huán)磷酰胺S180小鼠Abstract：ObjectiveTo explore the role of betacyanins extracted from Portulaca oleracea L. in the

3、therapeutic effect of cyclophosphamide (CTX) and its side-effect in mice loaded with S180 murine sarcoma cells.MethodsThe mice inoculated with S180 murine sarcoma cells were divided into 5 groups: S180 control group, sc 2 mg/kg·d of CTX group,  ig betacyanins (250，500 and1000 mg/ kg·d

4、 ) + sc CTX groups. After 10-day treatment, the tumor inhibition rate, peripheral blood cells, bone marrow karyocytes, immunoglobulin (Ig), the index of spleen and thymus, the liver and renal function were evaluated respectively. ResultsAlthough CTX application separately led to decrease of the inde

5、xes of spleen and thymus and the levels of IgG and IgM, the CTX application combined with different doses of betacyanin not only increased the tumor inhibition rate, but also improved the indexes of spleen and thymus and the levels of IgG and IgM. Similarly, the CTX in combination with different dos

6、es of betacyanin had a larger number of white blood cell (WBC), platelet (PLT) and bone marrow karyocytes than CTX group. Furthermore, betacyanin application also alleviated the CTX-induced increase of alanine aminotransferase (ALT) and blood urea nitrogen (BUN) in S180 mice. ConclusionBetacyanins e

7、xtracted from Portulaca oleracea L. can enhance therapeutic effect of CTX and reduce its side-effect in the S180 mice.Key words：Portulaca oleracea L.;   Betacyanins;   Anti-tumor;   Cyclophosphamide;   S180 mice馬齒莧Portulaca oleracea L.為馬齒莧科一年生肉質草本植物，廣布于溫帶和熱帶地區(qū)

8、，在許多國家作為藥食兩用植物使用。多以其干燥地上部分入藥，性味酸寒，具有清熱解毒，涼血止血之功。主治熱痢膿血、熱淋、帶下、痛腫惡毒、丹毒1。近年來的藥理研究表明，馬齒莧具有殺菌、降血脂、降血糖、抗動脈粥樣硬化等功能2，其抗癌作用也有報道35。馬齒莧化學成分復雜，主要含有生物堿、萜類、有機酸、香豆素、黃酮、揮發(fā)油和多糖等6。但是對于馬齒莧中含有的特有色素甜菜紅素及其功效卻鮮有報道。甜菜素是一種水溶性含氮色素，因最早發(fā)現(xiàn)于甜菜根中而得名，是吡啶衍生物，包括甜菜紅素和甜菜黃素兩種形式。到目前為止，人們發(fā)現(xiàn)甜菜素只能在石竹目部分科的植物中合成7。近年來國外對甜菜素的研究日益活躍，其價值也突破了作為食品

9、添加劑的局限性，其抗氧化及療效正引起了人們的關注812。為了進一步了解馬齒莧的藥效物質基礎，我們從馬齒莧中分離提純了甜菜紅素，并對其可能存在的抗癌作用進行了研究分析，以期為進一步明確馬齒莧中的有效成分，增加對其有效成分分離提純、深加工和開發(fā)應用的針對性以及馬齒莧中藥飲片的炮制和制劑工藝提供理論依據(jù)。 1  材料    昆明種小鼠，雌雄各半，體重為1822 g，由山東大學藥學院提供。小鼠S180肉瘤腹水型細胞由 中國 科學 院上海藥物研究所提供。環(huán)磷酞胺(CTX)為濟南制藥廠生產(chǎn)。 2  方法 2.1  馬齒莧甜菜紅素的分離提純參照王長泉等13的

10、方法，取馬齒莧的紅色莖段，剪碎后于液氮下研磨，分別以10倍體積的甲醇浸提30 min，4 下 以8 000 g離心10 min，棄去上清液，連續(xù)3次，沉淀用雙蒸水浸提30 min，12 000 g于4 離心10 min后取上清液合并，即為馬齒莧甜菜紅素水溶液。然后按照孫世萍等14的方法，用高效液相色譜儀分離提純。高效液相色譜儀系統(tǒng)(島津公司)：配LC-10ADvp泵、二級管陣列檢測器SPD-M10Avp，柱溫箱CTO-10Avp，CLASS-VP 站。色譜柱：Shim-pack vp-ODS (150 mm×4.6 mm i.d., 5 m),預柱：him-pack Gvp-ODS

11、(10 mm×4.6 mm i.d, 5m)，流動相： A：甲醇、B：2% 冰醋酸緩沖液(AB =2080 V/V) ，流速0.7 ml/min，檢測波長：535 nm，柱溫：室溫，收集洗脫時間為46 min段的洗脫液。再用真空旋轉蒸發(fā)儀（R201 型旋轉蒸發(fā)儀，上海申科儀器廠）于 40濃縮，直到水完全蒸發(fā)，得到紫紅色粉末即為馬齒莧甜菜紅素，-70 保存?zhèn)溆谩?.2  動物分組與給藥無菌條件下抽取67 d 生長良好的S180小鼠的腹水，按13用生理鹽水稀釋，充分混勻，在顯微鏡下瘤細胞計數(shù)，用生理鹽水調(diào)整細胞數(shù)為1.0×105/ml，取0.2 ml于每只小鼠右側腋窩

12、下碘酊消毒后皮下接種，制備S180荷瘤小鼠模型。小鼠接種采用隨機法分成荷瘤對照組、CTX組、馬齒莧甜菜紅素低、中、高劑量+CTX組等5組。荷瘤對照組用生理鹽水灌胃，0. 4 ml/只，1次/d，連續(xù)10 d。單純化療組腹腔注射CTX 2 mg·kg-1·d-1，同時用生理鹽水灌胃，0. 4 ml/只，1次/d，連續(xù)10 d。馬齒莧甜菜紅素低、中、高劑量+CTX組的化療藥物劑量、給藥途徑及時間與CTX組相同，同時低、中、高劑量組為分別給予250，500，1 000 mg· kg-1·d -1的馬齒莧甜菜紅素灌胃，0.4 ml/只，1次/d，連續(xù)10 d。2

13、.3  計算抑瘤率和脾臟、胸腺指數(shù) 于最后一次給藥后24 h處死小鼠，稱鼠體重，剝離腫瘤稱瘤重。按下式計算抑瘤率。   抑瘤率（%）=(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。   以無菌操作取下脾臟、胸腺， 電子 天平稱量并下式計算脾臟(胸腺)指數(shù)。   脾臟(胸腺)指數(shù)=脾臟(胸腺)重/體質量×10002.4  外周血常規(guī)、免疫球蛋白和肝腎功能的檢測雅培C8000型全自動生化分析儀檢測免疫球蛋白和肝腎功能，血細胞自動分析儀檢測血常規(guī)。2.5  骨髓有核

14、細胞計數(shù)按照馮雪梅等15的方法，剝離股骨取小鼠完整右側股骨用7號針在股骨膝關節(jié)端打一小孔，抽取3%冰醋酸溶液反復沖洗其骨髓細胞于10 ml 3%冰醋酸溶液內(nèi)，4號針頭過濾后，充分混勻，在血細胞計數(shù)盤上計數(shù)4個大方格的細胞數(shù)，然后乘以2.5×104，得1根股骨中的骨髓有核細胞總數(shù)。         3   結果 3.1  馬齒莧甜菜紅素對化療小鼠體重和瘤重的影響3.2  馬齒莧甜菜紅素對化療小鼠免疫器官質量和血清免疫球蛋白的影響 3.3  馬齒莧甜

15、菜紅素對化療小鼠外周血象和骨髓有核細胞計數(shù)的影響3.4  馬齒莧甜菜紅素對化療小鼠肝腎功能的影響 4  討論 甜菜素作為重要的植物次生代謝物質在離體條件下具有很強的抗氧化和清除氧自由基的能力，可以用來 治療 與過氧化脅迫有關的人體機能失調(diào)7。體外實驗表明，甜菜根提取液對小鼠的皮膚癌和肺癌細胞具有顯著的抑制作用8，9。Allegra等10發(fā)現(xiàn)甜菜素可以通過與人類髓過氧化物酶及其中間體作用而清除次氯酸。Tesoriere等11發(fā)現(xiàn)食用含有甜菜素的刺梨果實后，可以明顯降低過氧化脅迫造成的脂質損害，提高人體的抗氧化水平。而且人體紅血球的抗氧化能力明顯增加，離體紅血球在甜菜

16、素溶液中培養(yǎng)一段時間也可以明顯延遲由于氧化劑異丙基苯過造成的溶血作用12。國內(nèi)對馬齒莧的抗癌作用也有研究，但都沒有明確有效成分35。本研究通過馬齒莧甜菜紅素聯(lián)合CTX抗S180荷瘤鼠發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組腫瘤抑制率高于CTX組，說明馬齒莧甜菜紅素具有潛在的抗癌功能，對CTX化療效果一定增強作用。胸腺、脾臟質量在一定程度上反映了機體免疫功能的強弱，而IgG、IgM的水平反映了體液免疫能力。本研究顯示，荷瘤小鼠應用CTX后脾臟和胸腺指數(shù)、IgG和IgM的水平均下降，通過聯(lián)合馬齒莧甜菜紅素可使脾臟和胸腺指數(shù)增加、促進IgG、IgM的分泌，說明馬齒莧甜菜紅素可緩解化療藥物CTX所致的免疫抑制。而且，馬齒莧甜菜紅

17、素聯(lián)合CTX應用，還可以不同程度地抑制單獨使用CTX后引起的ALT、BUN升高，WBC、PLT和骨髓有核細胞計數(shù)明顯降低，說明CTX所引起的肝功能損害與骨髓抑制狀態(tài)得到改善?？傊R齒莧甜菜紅素與化療藥物CTX合用可增強CTX抑制腫瘤生長的作用，同時減輕其所致的骨髓抑制、免疫功能和肝功能的損害，具有增效減毒作用?！?參考 文獻 】 1 中國 科學 院藥物研究所. 中藥志M. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1988: 18.2杜士明, 蔡華, 梁俊, 等. 馬齒莧藥理研究進展及開發(fā)思路J. 中國藥房. 2007, 18(27): 2145.3樸龍,張學武. 馬齒莧正丁醇提取物體內(nèi)抑瘤作用及其機理研究

18、J. 四川中醫(yī), 2007, 25(12): 19.4崔麗敏, 張學武. 馬齒莧提取物抑制肺癌A549細胞增殖的實驗研究J. 四川中醫(yī), 2007, 25(12): 15.5崔香淑, 金元哲, 張學武. 馬齒莧提取物對肝癌細胞HepG-2抑制作用的實驗研究J. 時珍國醫(yī)國藥, 2007, 18(5): 1065.6姚佳琪, 孟 娜, 宋少江, 等. 馬齒莧的化學成分J. 沈陽藥科大學學報, 2007, 24(12): 751.7王長泉, 劉濤, 王寶山. 植物甜菜素研究進展J. 植物學通報, 2006, 3: 302.8Kapadia GJ, Tokuda H, Konoshima T, et al. Chemoprevention of lung and skin cancer by Beta vulgaris (beet) root extractJ. Cancer Lett., 1996, 100: 211. 9Kapadia GJ, Azuine MA, Sridhar R, et al. Chemoprevention of DMBA-induced UV-B promoted,