細 胞 化 學 染 色

1、細 胞 化 學 染 色    細胞化學染色是將形態(tài)和功能相結(jié)合的細胞科學。它是在保持完整的細胞形態(tài)和細胞結(jié)構(gòu)的前提下, 運用化學反應將被檢細胞內(nèi)的各類化學成分和細胞結(jié)構(gòu)及生理活性物質(zhì)原位地顯示。因而對于探索細胞內(nèi)的化學成分、生理功能、新陳代謝及細胞生理和病理改變有著重要意義。    血液細胞化學染色的范圍一般可分為：蛋白質(zhì)類（氨基酸、酶 )、核酸類、多糖類、脂類、鹽類或金屬類, 采用的方法通常為化學結(jié)合和物理溶解及酶-底物反應。臨床評價 :1. 細胞化學染色的開展 ,已有數(shù)十年的歷史。其在結(jié)合細胞形態(tài)學的基礎(chǔ)上對各

2、類白血病的確診，對許多血液疾病鑒別診斷中的幫助，對各種良、惡性血液系統(tǒng)疾病療效和預后估計提供一定的信息。2. 血液系統(tǒng)各種惡性疾病，特別是急性白血病，因其多為早期分化較差的病理細胞增殖, 客觀上存在著形態(tài)變異、畸形發(fā)育，即使是有經(jīng)驗的檢驗人員僅憑細胞形態(tài)也難以避免錯誤診斷的發(fā)生。如將細胞形態(tài)和細胞化學染色相結(jié)合， 能提高急性白血病的診斷和較正確地對其分型及亞型分型，即為急性白血病FAB分型。3. 近年來，由于細胞免疫學、細胞遺傳學、分子生物學和細胞超微結(jié)構(gòu)等迅速發(fā)展，進一步推動了細胞化學染色這一領(lǐng)域的進展，并出現(xiàn)了細胞免疫組織化學染色、細胞超微化學染色等更新、更準確的檢驗方法與手段，對探討各類

3、血液疾病發(fā)病原理和觀察治療反應及預后起了極其重要的作用。如將細胞免疫化學、細胞遺傳學、分子生物學這三者與細胞化學染色及細胞形態(tài)學相結(jié)合，對各種白血病進行分型，即成為白血病的MICM分型診斷。4. 細胞化學染色通常應用在各種血液系統(tǒng)疾病特別是對各種急性白血病的診斷與鑒別診斷中。但白血病細胞因其呈高度的異質(zhì)性和多態(tài)性，有時即使是同一類型的白血病也可在細胞形態(tài)、細胞化學染色結(jié)果、細胞免疫表型及分子生物學等方面存在較大的差異。所以對各類型白血病作一套較完整的細胞化學是補充了單憑形態(tài)對細胞辨認的不足。因此我們在實際工作中若要對各類型白血病作出比較準確的診斷與鑒別診斷，應盡可能采用多項細胞化學染色或雙（多

4、）重染色。    細胞化學染色方法分門別類有許多種，結(jié)果的顯示也不盡相同，有時即使檢測同一物質(zhì)，因采用的方法不同其結(jié)果有可能存在一定的偏差，會造成科室間（甚至同科室不同操作人員間）對同一份標本作出不同的診斷。所以我們應注意選擇結(jié)果穩(wěn)定、操作簡便（操作步驟越多，出現(xiàn)的誤差幾率就越大）、陽性顯示明顯的方法或標準試劑盒。如果條件允許可與細胞免疫化學、細胞遺傳學、分子生物學等相結(jié)合,使細胞化學染色發(fā)揮最大、最準確的作用。 一 過氧化物酶染色peroxidase ,(POX)原理：    在血液和骨髓細胞中，粒細胞

5、系和單核細胞系的嗜苯氨藍顆粒 ("A"顆粒)內(nèi)的溶酶體中存在有過氧化物酶（POX）。通過此酶氧化過氧化氫，釋放出單原子氧，后者氧化3-3二氨基聯(lián)苯胺，使之變成棕黑色顆粒狀沉淀物，定位于酶活力所在處。由于各種細胞內(nèi)過氧化物酶（POX）的活力不同，其顆粒大小與色澤深淺也有所不等。此酶的活性與溶酶體的數(shù)量有關(guān)，而與嗜苯氨藍顆粒（"A"）顆粒的多少無關(guān)。淋巴細胞質(zhì)嗜苯氨藍顆粒中不存在溶酶體，所以過氧化物酶染色呈陰性反應，正常人群中性粒細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞呈陽性反應。淋巴細胞、巨核細胞、紅細胞、漿細胞等均呈陰性反應。正常細胞反應:1. 粒細胞系-各階段中性粒

6、細胞（少數(shù)原粒除外）可呈顆粒狀陽性或強陽性。定位于胞質(zhì)內(nèi)。嗜酸性粒細胞可呈均勻粗大顆粒狀陽性。定位于胞質(zhì)內(nèi)。2. 單核細胞系-成熟單核和幼稚單核及部分原始單核(分化較好)可呈彌散細顆粒狀陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)。3. 紅細胞系、淋巴細胞系、巨核細胞系、漿細胞系-均呈陰性。病理變化：1.酶活性增高可見于再生障礙性貧血、急性粒細胞性白血病、急性淋巴細胞性白血病、放射病、嗜堿粒細胞在慢性粒細胞性白血病時可出現(xiàn)陽性。2. 酶活性減低可見于某些腫瘤、MDS、鏈球菌感染、風濕熱等。3. 酶活性缺乏可見于：a.(MPO)髓過氧化物酶缺乏引起中性粒細胞和單核細胞POX呈陰性,僅在涂片中見少數(shù)早幼粒細胞呈弱陽性反應

7、。b.乳過氧化物酶缺乏引起的嗜酸粒細胞POX呈陰性。臨床評價:1. 通常將其染色陽性率3%作為淋與非淋的分界標準。但需注意在淋巴細胞白血病時原始粒和單核細胞有時也會超過3%, 此時應慎重考慮, 結(jié)合形態(tài)反復觀察。2. 若POX染色陽性且強度較高可結(jié)合細胞化學染色、細胞免疫表型檢測, 遺傳學和分子生物學檢測對各種急性髓性白血病進行分型或亞型間的區(qū)別, 特別有助于M1與M5a、M2b與M3b及M4型亞型的鑒別。3. 若POX染色呈陰性反應, 必須結(jié)合其它細胞化學染色、細胞免疫表型, 遺傳學和分子生物學, 來加以區(qū)分出淋巴系、非淋巴系、雙表型、干細胞型等惡性增生。并對Mo與L3、M5a與L2、干細胞

8、白血病與L3等進行診斷及鑒別診斷。操作步驟:    將新鮮涂片滴加POXI液數(shù)滴（覆蓋血膜為宜），室溫放置1分鐘，勿沖洗即滴加POXII液數(shù)滴(與液等量)，可用洗耳球輕輕將二液充分混勻后置室溫5分鐘，隨后用流水沖洗35分鐘。再滴加95%乙醇脫色約23分鐘，至涂片呈淡紅色。水洗后以瑞氏染色液復染1015分鐘，水洗待涂片干燥后鏡檢并觀察結(jié)果。結(jié)果顯示：陰性 （）胞質(zhì)內(nèi)無色。陽性 （+）胞質(zhì)中見棕黑色顆粒，呈局灶性分布。（+）胞質(zhì)中見粗大、密集、分布較廣的藍黑色顆粒。（+）胞質(zhì)中幾乎布滿大量粗大、成團塊、藍黑色顆粒。（+） 胞質(zhì)中充滿粗大團塊狀藍黑色顆粒并可覆

9、蓋于胞核上。位于胞質(zhì)。注意事項:1. 每次操作均須取正常標本做陰、陽性同步對照。2. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，可使結(jié)果穩(wěn)定得以減少室內(nèi)誤差。常見問題與解決方法：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期太久 從新購買試劑盒 載玻片未洗凈標本被污染 取干凈玻片從新采集標本 標本放置時間過久 從新采集標本 標本沾遇其他化學物質(zhì)特別是甲醇、過碘酸、鹽酸等 采用未被污染的標本重新染色 試劑滴加量太少或滴加后沿載玻片邊沿流失 可重新滴加試劑試劑啟用后保存不當特別是液 換新試劑或液 使用了加有抗凝劑的標本 從新采集標本 染色背景太復雜采用了溶血的標本 采用未溶血的標本重新染色 推制標本時用力過

10、猛造成細胞破裂 從新采集標本 部分白血病細胞易破碎特別是M3型白血病細胞 無法去除 染色及復染后水洗時間不夠或沖洗 通常水洗時間為23分鐘而且 方法不當 不能先倒掉復染液，須連染液一起沖洗 二、中性粒細胞堿性磷酸酶染色Neutrophil alkaline phosphatase ,(NAP)原 理：中性粒細胞內(nèi)的堿性磷酸酶（NAP）在堿性環(huán)境下，水解-磷酸萘酚鈉，產(chǎn)生-萘酚。后者與重氮劑偶聯(lián)形成紅色沉淀物，沉淀物的顯色深淺與NAP活性成正比。正常血細胞反應 :中性粒細胞堿性磷酸酶是中性粒細胞中的特異性顆粒 ("S" 顆粒 )所釋放的一種酶, 存在于細胞質(zhì)內(nèi)的三級顆粒中呈不

11、規(guī)則形的管狀結(jié)構(gòu), 該酶的活力與積分受到體內(nèi)許多因素的影響。如中性粒細胞的成熟程度、HbF、內(nèi)分泌功能等均能使NAP的積分產(chǎn)生一定的差異,但正常人群中性粒細胞的陽性程度一般很少達到3分, 絕對達不到4分。其酶活力的正常范圍通常為：細胞陽性率 ；256個/100個成熟中性粒細胞； 陽性細胞積分：480個/100個中性粒細胞病理變化：NAP 積分增高：1. 細菌感染,凡革蘭陽性球菌感染、NAP活力顯著升高。2. 真性紅細胞增多癥,NAP活力持續(xù)增加,且治療后未見能恢復正常。3. 再生障礙性貧血,NAP活力持續(xù)增加,經(jīng)治療緩解時可有下降趨勢。4. 類白血病,由化濃性球菌引起的類白反應,NAP活力明顯

12、升高。5. 急性淋巴細胞性白血病可見NAP中度增加,而多發(fā)性骨髓瘤則活力顯著提高。6. 其它類型如燒傷、中毒、手術(shù)后、外傷等均可使NAP活力升高。NAP 積分降低：1. 粒細胞缺乏癥、脾亢等疾病時NAP活力下降。2. 感染, 由革蘭陰性桿菌、結(jié)核、病毒、立克次體病等NAP活力可明顯或重度減低。3. 白血病,單核細胞和粒細胞系統(tǒng)白血病,特別是慢性粒細胞白血病 NAP活力明顯減低甚至消失。臨床評價:    若配合染色體檢查及分子生物學診斷技術(shù)可提高慢性粒細胞白血病的診斷；配合酸溶血試驗,尿含鐵血黃素試驗可提高PNH的診斷及有利于PNH與再生障礙性貧血的鑒別；

13、配合其它細胞化學染色可輔助鑒別急性淋巴細胞性白血病與急性非淋巴細胞性白血病。操作步驟：    將新鮮涂片滴加固定液（4）30秒，水洗待干備用。將NAP液置入NAP液混合成為基質(zhì)液(可先吸取少量NAP液置入NAP液內(nèi)，待NAP液充分溶解后再一起置入NAP液內(nèi))。將涂片置入后，37放置30分鐘。連染色缸流水沖洗數(shù)分鐘，取出待干。蘇木素復染12分鐘，水洗，待干，鏡檢。結(jié)果顯示：陰性 （）0分：胞質(zhì)內(nèi)無色。陽性 （+）1分：胞質(zhì)見淺紅色，無顆?；蛴猩倭考毿☆w粒但小于胞質(zhì)1/4面積。（+）2分：胞質(zhì)見紅色，有較粗紅色顆粒但小于胞質(zhì)1/2面積。（+） 3分：胞質(zhì)見粗

14、大紅色顆粒，可達胞質(zhì)面積3/4以上。（+）4分：胞質(zhì)見粗大深紅色顆粒，達胞質(zhì)全部面積甚至可掩蓋于胞核上。注意事項:1. 年齡變化：新生兒NAP活性較高,以后逐漸下降。2. 應激狀態(tài)：緊張、恐懼、激烈運動等NAP積分可增高。3. 妊娠和月經(jīng)周期的變化也可使NAP的活力有所差異。4.藥物所致,特別是激素類如腎上腺皮質(zhì)激素、雌激素等均可使NAP積分增高。 5. 每次實驗均設(shè)陰、陽性標本對照。6. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，盡量減少室內(nèi)誤差。7. 觀察結(jié)果時需注意涂片的部位, 最好選擇體尾交接處,有時不同部位其陽性強度可相差二個(+)以上。尤其作慢粒隨訪病人積分計算時需特別注意。常見問題與結(jié)局方法：

15、常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期太久 從新購買試劑盒 載玻片未洗凈標本被污染 取干凈玻片從新采集標本 標本放置時間過久且未固定 從新采集標本并立即固定，在三天內(nèi)檢測完畢固定液使用時大于4另取標本重新用4固定液固定 采用了加有抗凝劑的標本從新采集標本 標本沾遇其他化學物質(zhì)乙醚、二甲苯等 采用未被污染的標本重新染色 試劑配制時液未完全置入液內(nèi)或未完全溶解 需取新試劑從新配制 試劑配制后未及時使用 需取新試劑從新配制 孵育時間或溫度不夠 調(diào)整溫度或孵育時間 染色背景太復雜背景細胞染色過深 孵育時間太長，若影響觀察需另取標本重新染色 染色后沖洗方法不當不能先倒掉染液，應連染色缸置流水

16、沖洗染液，23分鐘復染后水洗時間不夠復染后水洗時間通常為35分鐘而且須連復染液一起沖洗 三、細胞內(nèi)酸性磷酸酶染色acid phosphatase in cells ,(ACP)原理:    酸性磷酸酶廣泛存在于人體組織細胞內(nèi), 其最適pH為4.55.5左右 , 酸性磷酸酶通常存在于溶酶體內(nèi), 其同工酶有七種。血細胞內(nèi)的酸性磷酸酶（ACP）能水解磷酸萘酚AS-BI，釋放出萘酚AS-BI，后者與偶氮劑偶聯(lián)形成紅色沉淀物。沉淀物的顯色深淺與ACP活性成正比。正常血細胞反應 :· 粒細胞系-部分成熟粒細胞可呈彌散狀弱陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)。 ·

17、 淋巴細胞系- 部分T-淋巴細胞可呈粗顆?；蛐K狀陽性,定位于胞質(zhì)內(nèi)。 部分B-淋巴細胞可呈細顆?；驈浬铌栃?定位于胞質(zhì)內(nèi)。· 單核細胞系-部分單核細胞可呈彌散狀弱陽性,定位于胞質(zhì)內(nèi)。 · 巨核細胞系-巨核細胞和血小板可呈彌散狀弱陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)。 · 網(wǎng)狀細胞、吞噬細胞、組織噬堿性細胞可呈彌散和/或顆粒狀陽性,定位于胞質(zhì)內(nèi)。 · 紅細胞系-基本呈陰性. 病理變化:    酸性磷酸酶在T-淋巴細胞異常增多時都具較強的活性, 特別在急性T-淋巴細胞白血病時最為顯著, 但對L(+) 酒石酸敏感受其抑制, 在B-

18、淋巴細胞異常增生時, 多數(shù)為陰性或弱陽性反應。而多毛細胞性白血病可呈較強的陽性反應, 且因含獨特的同工酶5,不被 L(+) 酒石酸所抑制。所以酸性磷酸酶對多毛細胞白血病的診斷具重要價值。在急性非淋巴細胞白血病中, 單核細胞系統(tǒng)反應比粒系細胞系統(tǒng)較強。多發(fā)性骨髓瘤細胞、漿細胞均可呈強陽性反應。另對高-雪細胞和尼曼-匹克細胞的鑒別有較重要價，通常高-雪細胞呈強陽性反應而尼曼-匹克細胞呈陰性反氣應。臨床評價 :1. 結(jié)合電鏡超微結(jié)構(gòu)檢查, 可對多毛細胞性白血病作出診斷。2. 結(jié)合細胞免疫表型檢測, 有助于區(qū)別各種B-細胞克隆增生性疾病 , 如慢淋與毛白、B-ALL與毛白。3. 結(jié)合其它細胞化學染色,

19、有助于對急性粒-單細胞白血病亞型的分類。操作步驟:    將新鮮涂片滴加固定液58滴 ，蓋滿血膜即可，（4）30秒水洗備用。將ACP液、液加入ACP液中混勻(可先吸取少量ACP液分別置入ACP、液內(nèi)，待ACP、液充分溶解后再一起置入ACP液內(nèi))成為基質(zhì)液。再將涂片置入后，37放置90分鐘，流水沖洗數(shù)分鐘。蘇木素復染12分鐘，水洗待干，鏡檢。結(jié)果顯示：陰性 （）胞質(zhì)無沉淀物（無色）陽性 （+）胞質(zhì)見淺紅色或有少量細小顆粒。（+）胞質(zhì)見紅色或有較粗紅色顆粒但小于胞質(zhì)1/2面積。（+）胞質(zhì)見粗大紅色顆粒，可達胞質(zhì)面積3/4以上。（+） 胞質(zhì)見粗大深紅色顆粒，達

20、胞質(zhì)全部面積。注意事項:1. 由于含酸性磷酸酶的血液細胞有許多, 且各種細胞所含ACP同工酶不同, 即同一基質(zhì)可有陽性程度的差異, 在同一類細胞中可因基質(zhì)不同而使陽性結(jié)果存在明顯差異, 特別在不同的實驗室之間龍為突出。2. 在每次操作時均應設(shè)正常標本陰、陽性對照。3. ACP染色結(jié)果以彌散狀陽性出現(xiàn)的細胞較多,如為弱陽性反應, 在復染時應注意在涂片縱向復染一半, 另一半不復染以利弱陽性的觀察。4. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，盡量減少室內(nèi)誤差。5. 觀察結(jié)果時需注意涂片的部位,最好選擇體尾交接處,有時不同部位其陽性強度可相差二個(+)以上。作L-酒石酸抑制實驗時需特別注意。 常見問題與解決方法

21、：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期太久 從新購買試劑盒 載玻片未洗凈標本被污染 取干凈玻片從新采集標本 標本放置時間過久且未固定 從新采集標本并立即固定，在三天內(nèi)檢測完畢固定液使用時大于4另取標本重新用4固定液固定 采用了加有抗凝劑的標本從新采集標本 標本沾遇其他化學物質(zhì)乙醚、二甲苯等 采用未被污染的標本重新染色 試劑配制時 、 液未完全置入液內(nèi)或未完全溶解 需取新試劑從新配制 試劑配制后未及時使用 需取新試劑從新配制 孵育時間或溫度不夠 調(diào)整溫度或孵育時間 染色背景太復雜背景細胞染色過深 孵育時間太長，若影響觀察需另取標本重新染色 染色后沖洗方法不當不能先倒掉染液，應連染色

22、缸置流水沖洗染液，23分鐘復染后水洗時間不夠復染后水洗時間通常為35分鐘而且須連復染液一起沖洗 四、氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色naphthol-AS-D,chloracetate esterase(AS-DNCE)原理:    一般認為, 氯化醋酸萘酚酯酶是粒細胞及肥大細胞的標志酶, 其主要存在于粒細胞(包括分化較好的原粒細胞)的溶酶體上, 此酶與過氧化物酶在中性粒細胞中均呈陽性反應，但此酶形成的產(chǎn)物比 POX 更為特異。血細胞內(nèi)的氯化醋酸AS-D萘酚酯酶(AS-DNCE)將氯化醋酸AS-D萘酚水解 ,產(chǎn)生萘酚AS-D，后者與重氮劑偶聯(lián)形成紅色沉淀物。

23、沉淀物的顯色深淺與AS-DNCE活性成正比。 正常細胞反應 :· 粒細胞系-中性粒細胞(除原粒細胞外)均可呈陽性或強陽性,且酶活性并不隨細胞成熟而增強，定位于胞漿內(nèi)。嗜酸和嗜堿粒細胞為陰性和弱陽性，定位于胞質(zhì)內(nèi)。 2. 肥大細胞有時可呈陽性反應，定位于胞質(zhì)內(nèi)。3. 紅細胞系、淋巴細胞系、單核細胞系、巨核細胞系、漿細胞系均呈陰性。臨床評價:1. 氯化醋酸萘酚酯酶亦稱為粒系細胞特異性酯酶, 如與細胞免疫表型檢測相結(jié)合, 對AML分型具有很大的價值,特別是結(jié)合CD13、CD33、MPO 等單克隆檢測結(jié)果, 對AML-M0的診斷有極大的幫助。2. 如將氯化醋酸萘酚酯酶染色與-丁酸萘酚酯酶染色

24、在同一標本進行雙脂染色、其對AML- M4亞型分析非常有價值。因氯化醋酸萘酚酯酶僅為粒細胞陽性, 而-丁酸萘酚酯酶可視作單核-巨噬細胞系統(tǒng)的標志酶。操作步驟：    將新鮮涂片滴加固定液58滴，蓋滿血膜即可，（4）30秒水洗。先將AS-DNCE液和液置入AS-DNCE液中溶解混和(可先吸取少量AS-DNCE液分別置入AS-DNCE、液內(nèi)，待AS-DNCE、液充分溶解后再一起置入AS-DNCE液內(nèi))成為基質(zhì)液。將涂片置入后，37放置30分鐘，連缸流水沖洗35分鐘。蘇木素復染12分鐘，水洗待干，鏡檢。結(jié)果顯示：陰性 （）胞質(zhì)無沉淀物（無色）陽性 （+）胞質(zhì)見

25、淡紅色，無顆?；蛴猩倭考毿☆w粒。（+）胞質(zhì)見鮮紅色，有較粗紅色顆粒但小于胞質(zhì)1/2面積。（+） 胞質(zhì)見粗大深紅色顆粒，可達胞質(zhì)面積3/4以上。（+）胞質(zhì)見粗大紅紫色顆粒，達胞質(zhì)全部面積甚至可掩蓋于胞核上。 注意事項:1.此酶主要以定性為主，而陽性強度僅作為參考。因為酶的活力并不隨細胞成熟而增加。2.標本必須新鮮, 取材后如無法及時染色可先行固定。3.每次操作均須取正常標本做陰、陽性同步對照。4. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，可使結(jié)果穩(wěn)定得以減少室內(nèi)誤差。5. 氯化醋酸萘酚酯酶染色與-丁酸萘酚酯酶染色在同一標本進行雙脂染色須向公司另購雙酯酶染色專用試劑,用常規(guī)染色試劑無法分別陽性結(jié)果。

26、常見問題與解決方法：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期太久 從新購買試劑盒 載玻片未洗凈標本被污染 取干凈玻片從新采集標本 標本放置時間過久且未固定 從新采集標本并立即固定，在三天內(nèi)檢測完畢固定液使用時大于4另取標本重新用4固定液固定 采用了加有抗凝劑的標本從新采集標本 標本沾遇其他化學物質(zhì)乙醚、二甲苯等 采用未被污染的標本重新染色 試劑配制時 、 液未完全置入液內(nèi)或未完全溶解 需取新試劑從新配制 試劑配制后未及時使用 需取新試劑從新配制 孵育時間或溫度不夠 調(diào)整溫度或孵育時間 染色背景太復雜背景細胞染色過深 孵育時間太長，若影響觀察需另取標本重新染色 染色后沖洗方法不當不能先

27、倒掉染液，應連染色缸置流水沖洗染液，23分鐘復染后水洗時間不夠復染后水洗時間通常為35分鐘而且須連復染液一起沖洗 五、-醋酸荼酚酯酶染色(-naphthol acetate esterase,-NAE)、原理：    血細胞內(nèi)的-醋酸萘酚酯酶（-NAE）將基質(zhì)液中的-醋酸萘酚酯水解，釋放出-萘酚，后者與重氮鹽偶聯(lián)形成灰黑色沉淀物。沉淀物的顯色深淺與- NAE活性成正比。正常細胞陽性反應:1.粒細胞系-少數(shù)中晚幼?？沙蕪浬钊蹶栃? 定位于胞質(zhì)內(nèi)。2.單核細胞系-成熟單核和幼稚單核及部分原始單核(分化較好)可呈不同程度陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)。3.紅細胞系-部

28、分中晚幼紅可呈弱陽性，定位于胞質(zhì)內(nèi)。4.巨核細胞系-巨核細胞和血小板可呈弱陽性或陽性，定位于胞質(zhì)內(nèi)。5.淋巴細胞系部分淋巴細胞和漿細胞可呈弱陽性，定位于胞質(zhì)內(nèi)。6.吞噬細胞-可呈強陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)。臨床評價：1.-醋酸荼酚酯酶染色屬臨床上常用的非特異性醋酶染色之一。此酶在單核細胞、吞噬細胞中含量較多且多數(shù)受到氟化納(NaF)抑制；粒細胞、淋巴細胞、部分幼紅細胞、巨核細胞和血小板等含量較少。非特異性酯酶由于具有較多的同工酶，且不同種類的細胞內(nèi)存有的同工酶也不盡相同，所以此類酶除了在單核-巨噬系統(tǒng)反應較強烈以外，其它細胞系統(tǒng)也可呈現(xiàn)出不同程度的陽性，所以對細胞中非特異性酶酶如能組合檢測比單一檢

29、測更具價值和意義。非特異性酯酶染色的主要意義在于結(jié)合細胞形態(tài)，結(jié)合其他細胞化學染色，為臨床急性非淋巴細胞性白血病的分型和亞型確定提供重要的依據(jù)。2. -醋酸荼酚酯酶因主要存在于單核細胞中，且為同工酶4、5，而中性粒細胞含有的同工酶為1、2、7、9，由于一定濃度的氟化鈉能完全抑制酯酶3、5、6，此特點在對急性髓性白血病中M2、M4、M5等分型和亞型分類有一定參考價值。另由于巨核細胞此酶也可呈陽性反應, 如結(jié)合酸性磷酸酶染色(ACP)和免疫表型檢測, 可對AML-M7作出診斷。3. 非特異性醋酶染色若結(jié)合POX染色和PAS染色(雙酶染色)來綜合判斷結(jié)果，特別是如能將POX 染色與-醋酸荼酚酯酶染色

30、聯(lián)合顯示于一張標本片上，這比分別染色效果要更好，對M4的分型尤為突出。4. 將AS-DNCE染色與-醋酸荼酚酯酶染色同顯示于一張標本片上，即雙醋染色，可使單核細胞和粒細胞系分辨的更為清楚, 并且能發(fā)現(xiàn)在同一個細胞上同時存在二種酯酶呈陽性反應, 稱酯酶雙表現(xiàn)型細胞，為M4的診斷與分型提供了有力依據(jù)。操作步驟：    將新鮮涂片滴加固定液58滴，蓋滿血膜即可，（4）30秒水洗。先將-NAE液和液置入-NAE液中溶解混和(可先吸取少量-NAE液分別置入-NAE、液內(nèi)，待-NAE、液充分溶解后再一起置入-NAE液內(nèi))成為基質(zhì)液。將涂片置入后，37放置30分鐘，連

31、缸流水沖洗35分鐘。蘇木素復染12分鐘，水洗待干，鏡檢。·NaF抑制試驗:    將新鮮涂片滴加固定液58滴，蓋滿血膜即可，（4）30秒水洗。先將-NAE液和液置入-NAE液中溶解混和(可先吸取少量-NAE液分別置入-NAE、液內(nèi)，待-NAE、液充分溶解后再一起置入-NAE液內(nèi))，再加入NaF一瓶（訂貨時可向公司要求配置）成為基質(zhì)液。將涂片置入后，37放置30分鐘，連缸流水沖洗35分鐘。蘇木素復染12分鐘，水洗待干，鏡檢結(jié)果顯示：陰性 （）胞質(zhì)無沉淀物（無色）陽性 （+）胞質(zhì)見淺灰色，無顆?；蛴猩倭考毿☆w粒。（+）胞質(zhì)見深灰色，有較粗灰黑色顆粒

32、但小于胞質(zhì)1/2面積。（+）胞質(zhì)見粗大黑色顆粒，可達胞質(zhì)面積3/4以上。（+） 胞質(zhì)見粗大深黑色顆粒，達胞質(zhì)全部面積甚至可掩蓋于胞核上。注意事項：1. 酶的活性隨標本采集后的時間而逐步下降，如無法及時染色，應先固定否則將影響陽性結(jié)果。2. 涂片固定時滴加固定液要迅速一次蓋滿血膜，反復滴加可造成染色背景深淺不一。影響結(jié)果觀察。3. 每次操作均須取正常標本做陰、陽性同步對照。· 以防引起背景污染，沖洗困難，特別在冬天，易使涂片表面產(chǎn)生脂質(zhì)沉淀從而影響結(jié)果觀察。 5. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，可使結(jié)果穩(wěn)定得以減少室內(nèi)誤差。6. 觀察結(jié)果時需注意涂片的部位,有時不同部位其陽性強度可相差二

33、個(+)以上。作NaF抑制率計算時需特別注意 常見問題與解決方法：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期太久 從新購買試劑盒 載玻片未洗凈標本被污染 取干凈玻片從新采集標本 標本放置時間過久且未固定 從新采集標本并立即固定，在三天內(nèi)檢測完畢固定液使用時大于4另取標本重新用4固定液固定 采用了加有抗凝劑的標本從新采集標本 標本沾遇其他化學物質(zhì)乙醚、二甲苯等 采用未被污染的標本重新染色 試劑配制時 、 液未完全置入液內(nèi)或未完全溶解 需取新試劑從新配制 試劑配制后未及時使用 需取新試劑從新配制 孵育時間或溫度不夠 調(diào)整溫度或孵育時間 染色背景太復雜背景細胞染色過深 孵育時間太長，若影響觀

34、察需另取標本重新染色 染色后沖洗方法不當不能先倒掉染液，應連染色缸置流水沖洗染液，23分鐘復染后水洗時間不夠復染后水洗時間通常為35分鐘而且須連復染液一起沖洗 六、-丁酸萘酚酯酶染色(-naphthol butyrase esterase-NBE)原理:    血細胞內(nèi)的-丁酸萘酚酯酶（-NBE）將基質(zhì)液中的-丁酸萘酚酯水解，釋放出-萘酚，后者與重氮鹽偶聯(lián)形成棕褐色沉淀物。沉淀物的顯色深淺與-NBE活性成正比。正常細胞陽性反應:1.粒細胞系-個別成熟中性粒細胞可呈彌散狀弱陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)。2.單核細胞系-成熟單核和幼稚單核及部分原始單核(分化較好)可

35、呈不同程度陽性或強陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)。3.吞噬細胞-可呈陽性或強陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)4.紅細胞系、巨核細胞系、淋巴細胞系、漿細胞均呈陰性。臨床評價：1.-丁酸荼酚酯酶染色屬臨床上常用的非特異性醋酶染色之一。此酶在單核-巨噬細胞系統(tǒng)中反應強烈，同時此反應也能被NaF所抑制,而粒細胞、淋巴細胞、部分幼紅細胞、巨核細胞和血小板等含量很少。所以-丁酸荼酚酯酶亦被視作單核-巨噬細胞系統(tǒng)所特有的標志酶。若結(jié)合細胞形態(tài)和其他細胞化學染色，為臨床急性非淋巴細胞性白血病的分型和亞型確定提供重要的依據(jù)。2. -丁酸荼酚酯酶染色也可結(jié)合POX染色來綜合判斷結(jié)果，特別是如能將POX 染色與-丁酸荼酚酯酶染色聯(lián)合顯示

36、于一張標本片上，這比分別染色效果要更好，對M2、M4、M5的分型尤為突出。· 將AS-DNCE染色與-丁酸荼酚酯酶染色同顯示于一張標本片上，即雙醋染 色，可使單核細胞和粒細胞系分辨的更為清楚, 并且能發(fā)現(xiàn)在同一個細胞上同時存在二種酯酶呈陽性反應, 稱酯酶雙表現(xiàn)型細胞，為M4的診斷與分型提供了有力依據(jù)。操作步驟:    將新鮮涂片滴加固定液58滴，蓋滿血膜即可，（4）30秒水洗。先將-NBE液和液置入-NBE液中溶解混和(可先吸取少量-NBE液分別置入-NBE、液內(nèi)，待-NBE、液充分溶解后再一起置入-NBE液內(nèi))成為基質(zhì)液。將涂片置入后，37放

37、置30分鐘，連缸流水沖洗35分鐘。蘇木素復染12分鐘，水洗待干，鏡檢。·NaF抑制試驗:    將新鮮涂片滴加固定液58滴，蓋滿血膜即可，（4）30秒水洗。先將-NBE液和液置入-NBE液中溶解混和(可先吸取少量-NBE液分別置入-NBE、液內(nèi)，待-NBE、液充分溶解后再一起置入-NBE液內(nèi))，再加入NaF一瓶（訂貨時可向公司要求配置）成為基質(zhì)液。將涂片置入后，37放置30分鐘，連缸流水沖洗35分鐘。蘇木素復染12分鐘，水洗待干，鏡檢結(jié)果顯示：陰性 （）胞質(zhì)無沉淀物（無色）陽性 （+）胞質(zhì)見淡棕紅色，無顆粒或有少量細小顆粒。（+）胞質(zhì)見棕紅色，

38、有較粗棕紅色顆粒但小于胞質(zhì)1/2面積。（+）胞質(zhì)見粗大棕紅色顆粒，可達胞質(zhì)面積3/4以上。（+） 胞質(zhì)見粗大棕褐色顆粒，達胞質(zhì)全部面積甚至可掩蓋于胞核上。注意事項：1. 酶的活性隨標本采集后的時間而逐步下降，如無法及時染色，應先固定，否則將影響陽性結(jié)果。2. 每次操作均須取正常標本做陰、陽性同步對照。3. 此染色沖洗時間需適當延長，特別在冬天，易使涂片表面產(chǎn)生脂質(zhì)沉淀,引起背景污染影響結(jié)果觀察。4. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，可使結(jié)果穩(wěn)定得以減少室內(nèi)誤差。5. 觀察結(jié)果時需注意涂片的部位,最好選擇體尾交接處,有時不同部位其陽性強度可相差二個(+)以上。作NaF抑制率計算時需特別注意。常見問題

39、與解決方法：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期太久 從新購買試劑盒 載玻片未洗凈標本被污染 取干凈玻片從新采集標本 標本放置時間過久且未固定 從新采集標本并立即固定，在三天內(nèi)檢測完畢固定液使用時大于4另取標本重新用4固定液固定 采用了加有抗凝劑的標本從新采集標本 標本沾遇其他化學物質(zhì)乙醚、二甲苯等 采用未被污染的標本重新染色 試劑配制時 、 液未完全置入液內(nèi)或未完全溶解 需取新試劑從新配制 試劑配制后未及時使用 需取新試劑從新配制 孵育時間或溫度不夠 調(diào)整溫度或孵育時間 染色背景太復雜背景細胞染色過深 孵育時間太長，若影響觀察需另取標本重新染色 染色后沖洗方法不當不能先倒掉染液

40、，應連染色缸置流水沖洗染液，23分鐘復染后水洗時間不夠復染后水洗時間通常為35分鐘而且須連復染液一起沖洗 七、過碘酸一雪夫反應periodic acid Schiff reaction ,PAS原理:    血細胞內(nèi)含乙二醇的糖類物質(zhì)（PAS）能被過碘酸氧化，形成雙醛基類物質(zhì)。后者與無色品紅結(jié)合，形成紫紅色沉淀物，沉淀物的顯色深淺與乙二醇的含量成正比。正常細胞反應 :1. 粒細胞系-原粒細胞多呈陰性, 通常隨細胞不斷成熟陽性反應由弱漸強, 至細胞完全成熟后達到最大強度。其中，中性粒細胞呈胞質(zhì)內(nèi)彌散狀紅色陽性，嗜酸粒細胞S顆粒之間的胞質(zhì)呈紅色陽性，嗜堿粒細

41、胞呈大小不一的顆粒狀紫紅色陽性。2. 單核細胞系-各階段部分單核細胞可呈彌散伴細小顆粒狀紅色陽性。定位于胞質(zhì)內(nèi)。3. 淋巴細胞系-由于亞群的關(guān)系, 可有所不同,T-細胞僅一小部分可呈粗顆粒和小快狀陽性，但B-細胞絕大部分呈陽性反應。4. 紅細胞系-紅細胞系的各個階段皆呈陰性反應，偶見少數(shù)幼紅細胞有較弱的陽性反應。5. 巨核細胞系- 巨核細胞和血小板呈彌散性和粗大顆粒狀強陽性反應，且隨細胞成熟而增強。定位于胞質(zhì)內(nèi)。6. 其他-漿細胞呈陰性反應, 偶見少數(shù)呈較弱陽性。巨噬細胞可呈陽性反應。均定位于胞質(zhì)內(nèi)。臨床評價：1. 能被過碘酸一雪夫反應呈陽性的多糖類物質(zhì)有糖原、粘多糖、糖蛋白、糖脂 , 還包括

42、一些磷脂類物質(zhì)等, 因此PAS陽性不能簡單地就表明有糖原的存在, 只是在對血細胞的組織化學研究中通常習慣于將PAS陽性認同于糖原。2.PAS染色雖然不完全代表糖原,但在血液系統(tǒng)疾病特別在各類型白血病中卻有較大的應用價值。(1) 粒細胞系統(tǒng): 糖原是保障中性粒細胞吞噬功能的能量來源,所以在急性炎癥時PAS染色陽性程度明顯增強, 在淋巴系統(tǒng)惡性增生性疾病、真性紅細胞增多癥、類白血病反應等時亦可增強, 在粒細胞系統(tǒng)惡性增生性疾病如急粒、慢粒等, 其陽性程度可減低。(2) 紅細胞系統(tǒng):PAS染色在紅細胞疾病中具有較大的使用價值，在大部分紅血病、紅白血病及部分重型海洋貧血等疾病中可呈強陽性反應, 部分缺

43、鐵性貧血、重型海洋貧血、MDS、骨髓硬化癥等可見陽性反應。其它類型的貧血如巨幼紅細胞性貧血、再生障礙性貧血、溶血性貧血等均為陰性反應。(3) 巨核細胞和血小板系統(tǒng): 巨核細胞胞漿中存有糖原和粘多糖兩類物質(zhì)，糖原呈粗大紫紅色顆粒或塊狀，粘多糖呈彌散狀紅色細顆粒, 二者遍布于整個胞漿之中。此為一般血液細胞所不具有，利用此特點有助于與惡性細胞相鑒別, 并結(jié)合電鏡PPO染色, 免疫表型檢測以確定原始巨核細胞的存在和對M7的診斷。(4) 淋巴細胞系統(tǒng): 淋巴細胞糖原的改變主要體現(xiàn)在不同類型的淋巴細胞克隆性增生疾病之, 其中尤以B-細胞惡性增多改變較為明顯，如慢淋、淋巴肉瘤、急性B-細胞白血病等疾病的PA

44、S陽性率和陽性強度可明顯提高。而T-細胞惡性病變PAS強度無明顯改變,另外，淋巴細胞由于感染引起的增多通常PAS多在正常范圍之內(nèi)。3.PAS 染色雖不能特異地表示何種病理改變，但結(jié)合其它細胞化學染色和細胞免疫表型檢測及超微結(jié)構(gòu)檢查等,對部分疾病的診斷和鑒別診斷具一定價值, 如MDS、M6與其它類型貧血的鑒別；原淋細胞與原單核細胞、原粒細胞的鑒別 ;M6與M7的鑒別、高-雪細胞與尼曼達克細胞的鑒別、 (Reed-Sternberg) 瑞-斯細胞和巨核細胞的鑒別、骨髓轉(zhuǎn)移性腺癌細胞與白血病細胞的鑒別。操作步驟:    涂片滴加固定液58滴，蓋滿血膜即可，5分

45、鐘，水洗待干。滴加PAS液10分鐘(若實驗室溫度較低可適當延長510分鐘)，水洗待干。置入PAS液內(nèi)室溫（2025左右為宜）暗處放置30分鐘，然后小心取出涂片流水沖洗數(shù)分鐘。蘇木素復染l2分鐘，水洗待干，鏡檢。結(jié)果顯示：陰性 （）胞質(zhì)內(nèi)無色。陽性 （+）胞質(zhì)內(nèi)呈淡紅色或有少量細小紅色顆粒。（+）胞質(zhì)呈紅色或有10個以上紅色顆粒。（+） 胞質(zhì)呈暗紅色或有粗大紅色顆粒，可出現(xiàn)紅色塊狀。（+） 胞質(zhì)呈紫紅色或有粗大紅色塊狀。注意事項:1.標本除新鮮涂片外, 保存較好未被污染的涂片也可使用。2.標本和器材應避免被還原基團的物質(zhì)所污染, 以免出現(xiàn)假陽性。3. 涂片經(jīng)PAS液氧化水洗后, 必須待涂片徹底干

46、燥后方可置入PAS液中, 以免細胞間隙中的殘留水份導致整張涂片呈鮮紅色, 影響結(jié)果觀察。4. 每次操作均須取正常標本做陰、陽性同步對照。5. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，可使結(jié)果穩(wěn)定得以減少室內(nèi)誤差。6. 觀察結(jié)果時需注意涂片的部位,最好選擇體尾交接處,有時不同部位其陽性強度可相差二個(+)以上。7. 染色后應及時觀察結(jié)果, 或用中性樹膠封片, 以利長期保存。常見問題與解決方法：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期從新購買試劑盒 試劑開封后未蓋緊開啟新試劑盒PAS開封后混入雜質(zhì)或水造成試劑變質(zhì)返紅開啟新試劑盒 載玻片未洗凈標本被污染 取干凈玻片從新采集標本 采用了加有抗凝劑的標本

47、從新采集標本標本沾遇其他化學物質(zhì)維生素C、 甲醛等采用未被污染的標本重新染色標本在液內(nèi)氧化時間不夠 另取標本和新試劑從新操作試劑配制后未及時使用 需取新試劑從新配制孵育時間或溫度不夠 調(diào)整溫度或孵育時間染色背景太復雜標本在液內(nèi)氧化水洗后未徹底干透 若影響觀察需另取標本重新染色 背景細胞染色過深 孵育時間太長，若影響觀察需另取標本重新染色染色后沖洗方法不當 不要連染色缸一起置流水沖 復染后水洗時間不夠復染后水洗時間通常為35分鐘而且須連復染液一起沖洗 八、鐵染色（Iron stalnlng）原理：    骨髓中的細胞內(nèi)外鐵在酸性環(huán)境下與亞鐵氰化鉀作用，形成

48、藍色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵部位。藍色沉淀顆粒的多少和深淺與細胞內(nèi)外鐵的含量成正比。正常細胞反應 :骨髓鐵包括幼紅細胞外鐵和幼紅細胞內(nèi)鐵二部分。細胞外鐵正常為 ( 十 )(+) 細胞內(nèi)鐵正常為 1944%幼紅細胞陽性 , 型為主，少數(shù)型。且無環(huán)行鐵粒幼紅細胞及鐵粒紅細胞。臨床評價 :1. 骨髓鐵包括細胞內(nèi)鐵和細胞外鐵。細胞內(nèi)鐵為幼紅細胞合成血紅蛋白時的利用形式, 而細胞外鐵是骨髓以含鐵血黃素形式存在的貯存鐵。骨髓鐵染色可了解骨髓中幼稚紅細胞對鐵利用的功能和鐵原料在機體內(nèi)的吸收與貯存情況, 但外鐵在檢測時易受到取材、儀器、試劑等因素的干擾, 就其價值來說不及細胞內(nèi)鐵高。2. 細胞內(nèi)外鐵減低或

49、消失, 見于鐵原料攝入性降低, 鐵吸收功能障礙或鐵的丟失和消耗過度, 使幼紅細胞血紅蛋白合成量減少或障礙, 如臨床常見的缺鐵性貧血及能引起機體缺鐵的相關(guān)性疾病,如鉤蟲病、ITP 等均能使機體中細胞內(nèi)外鐵減, 產(chǎn)生貧血癥狀, 因此對骨髓鐵的檢測是診斷缺鐵性貧血最重要且較早期的指標之一。3. 細胞內(nèi)外鐵增多性疾病見于機體造血功能障礙, 鐵利用和轉(zhuǎn)換能力下降或遲緩及外源性含鐵物質(zhì)的多次輸入等。臨床常見的有:再生障礙性貧血、鐵粒幼細胞貧血、骨髓增生異常綜合征、溶血性貧血、白血病等, 均可引起細胞內(nèi)外鐵的增多。4. 如將鐵染色與血清鐵、總鐵結(jié)合力等檢測綜合觀察, 可了解機體內(nèi)鐵的動態(tài)變化, 機體對鐵劑治

50、療的早期效果, 可了解骨髓代償造血的能力, 所以我們只要嚴格控制鐵染色操作技術(shù), 抓住取材、涂片、染色等幾個重要環(huán)節(jié), 對結(jié)果嚴格辨認, 就能使細胞內(nèi)外鐵染色在各種貧血的診斷、鑒別診斷中發(fā)揮更大作用。操作步驟：    骨髓涂片滴加固定液58滴，蓋滿骨髓膜即可。10分鐘水洗待干、備用。將鐵染色液緩緩滴入鐵染色液內(nèi)，混勻后放入固定好的骨髓涂片，置入37水浴箱內(nèi)放置60分鐘，然后連缸流水沖洗數(shù)分鐘。核固紅復染35分鐘，水洗待干，鏡檢。結(jié)果顯示：細胞外鐵：陰性 （）細胞外和細胞間隙中無藍色沉淀物（無色）。陽性 （+）細胞外和細胞間隙中見少數(shù)藍色顆粒。（+）細胞外

51、和細胞間隙中見較多藍色鐵顆粒和鐵小珠。（+） 細胞外和細胞間隙中見很多藍色鐵顆粒和鐵小珠。（+）細胞外和細胞間隙中見極多藍色鐵顆粒和鐵小珠并可見鐵小塊。細胞內(nèi)鐵：陰性 （）細質(zhì)內(nèi)無藍色沉淀物（無色）陽性 （） 胞質(zhì)見12個藍色細小顆粒。（） 胞質(zhì)見2個以上藍色顆粒。（） 胞質(zhì)見14個藍色粗大顆粒。（） 胞質(zhì)見5個以上藍色粗大顆粒。 注意事項:1.標本取材要滿意。外鐵檢查要選擇含有髓小粒的涂片, 如標本保存得當,陳舊骨髓涂片也可使用。2. 所用載玻片及相關(guān)器皿應經(jīng)去離子水洗滌(至少為雙蒸水), 除去載玻片和器皿上可能存有的污染鐵, 此點對外鐵檢測特別重要。3. 試劑要新鮮配置, 如二者

52、混合后試劑顏色變綠則表示受污染不能使用。4. 復染時應采用縱向, 一半不復染以利觀察細胞外鐵, 另一半復染以利觀察細胞內(nèi)鐵。在尋找細胞外鐵時, 最好能在吞噬細胞體內(nèi)看到鐵顆粒, 其比在細胞外看到鐵顆粒更有意義。5. 通常計算幼紅細胞內(nèi)鐵染色積分時以中晚幼紅為主, 原紅和早幼紅不計入百分比內(nèi)。為使結(jié)果準確,應選擇不同的區(qū)域和部位仔細觀察,避免發(fā)生遺漏和差錯。6. 每次操作均須取正常標本做陰、陽性同步對照。7. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，可使結(jié)果穩(wěn)定得以減少室內(nèi)誤差。8. 觀察結(jié)果時需注意涂片的部位，最好選擇體尾交接處。 常見問題與解決方法：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期從新

53、購買試劑盒 試劑被污染變色 需取新試劑從新配制 載玻片未洗凈標本被污染取干凈玻片從新采集標本 采用了加有抗凝劑的標本從新采集標本標本沾遇其他化學物質(zhì)乙醚、二甲苯等 采用未被污染的標本重新染色試劑配制時液未完全置入液內(nèi) 液開啟時間過長需取新試劑從新配制試劑配制后未及時使用 需取新試劑從新配制孵育時間或溫度不夠 調(diào)整溫度或孵育時間 染色背景太復雜標本被鐵污染采用未溶血的標本重新染色 背景細胞染色過深 孵育時間太長，若影響觀察需另取標本重、新染色染色后沖洗方法不當不能先倒掉染液，應連染色缸置流水沖洗染液，23分鐘復染后水洗時間不夠復染后水洗時間通常為35分鐘而且須連復染液一起沖洗 九、白血病細胞免疫

54、分型測定檢測原理：    利用細胞膜表面所特有的分化抗原對細胞進行鑒別和分型，將免疫酶標技術(shù)運用于普通骨髓(血)涂片?？梢赃_到準確區(qū)別各種類型血液細胞的目的。本公司采用目前國際上較為先進的免疫組化二步法，并選擇國際上被公認的一線單抗和部分常用二線單抗，運用AP染色技術(shù)，只需2-3張普通推制的骨髓(血)涂片即可。該法具有靈敏度高，操作簡便，試劑用量較少，結(jié)果穩(wěn)定，重復性好，背景清晰，無需特殊儀器(僅用一臺普通光學顯微鏡)、陽性結(jié)果保存時間長（便于會診），整個操作過程耗時僅需2小時即可獲得滿意的結(jié)果。能基本滿足臨床上對于各類型急、慢性白血病細胞的免疫分型檢測

55、。    在血液和骨髓細胞中有一部分細胞含有非常豐富的內(nèi)源性過氧化物酶，雖然在操作時可采取一些措施來抑制細胞內(nèi)過氧化物酶，但這種處理比較粗糙，往往不能完全抑制該細胞內(nèi)源酶的活性，又可造成部分細胞表面抗原的破壞或丟失。而對血液系統(tǒng)中許多惡性疾病的診斷，通常是檢測其細胞表面的分化抗原。再則在血液和骨髓組織中，還存在大量的成熟紅細胞。其中的血紅蛋白對本法也會產(chǎn)生強烈的干擾，(因血紅蛋白具過氧化物酶的功能)，可對被檢    標本的背景產(chǎn)生難以去除的非特異性染色。從而導致結(jié)果難以判斷。所以在血液學中的細胞免疫組化染色，應該首選堿性磷酸酶(AP)顯色系統(tǒng)。而盡量不采用辣根過氧化酶（HIP）顯色系統(tǒng)。正常細胞反應:1. T-淋巴細胞- CD3、CD5、CD7等標記可部分或全部表達，其他系列標記均不表達。2. B-淋巴細胞- CD10、CD19、CD20、HLA-DR等標記可部分或全部表達，其他系列標記均不表達。3. 髓系細胞- CD13、CD14、CD33、CD34、CD68、MPO、HLA-DR等標記可部分或全部表達，其他系列標記均不表