干化學技術與應用所謂干化學是與傳統(tǒng)的濕化學即溶液化學相對比

1、干化學技術與應用所謂“干化學是與傳統(tǒng)的“濕化學即溶液化學相比照擬而言的。它是以被檢測樣品中的液體作為反響媒介，待測物直接與固化于載體上的干粉試劑反響的一種方式。它與傳統(tǒng)濕化學的最大區(qū)別就在于參與化學反響的媒介不同。隨著生物化學中酶的別離、提純、存儲等技術的開展，傳感器、光度計和電極技術的進步，以及計算機應用的普及，干化學技術在近20年里得到了長足的進步，相對于“濕化學，“干化學具有如下優(yōu)點：比擬點P干式生化心濕式生化倍統(tǒng)檢測心試制2準備工作卩定標門無需際畑的穩(wěn)定性心周期長數(shù)月卩周期短口種類卩全血可直攝上機檢浪卜全血不可心給排水系統(tǒng)Q無需占電源心無需后備電源除非大型設備»大參數(shù)需要電源

2、裝備Q操作心簡單便捷t觸小時待機 試劑無需設置和堆備+ 分斬前后無需淸洗心菲專業(yè)人員丕可操作訂試劑需堆備，存在浪費，測試后清洗心 預熱，測試前的港潔心校正Q的卡校正匸每次測訶原那么上需要枝正心容易口繁瑣口運轉費用衛(wèi)拝本少經(jīng)濟心拝本少 > 不經(jīng)濟心反響條件變動衛(wèi)不可喪如可孌動卩干化學試劑載體的結構 干化學試劑載體的結構分為二層結構，三層結構，和多層膜。最簡單的二層結構用于生化分析的試劑載體最簡單的是二層結構，在支持層塑料基片上有一試劑層纖維素片，在纖維素片中預固相了全部試劑。常見的是尿生化分析試劑條：尿液中的待測成分與預固相在纖維素片上的試劑直接反響，通過反射光度計測定其顏色的改變，從而計

3、算待測成份的濃度。這種機 構只能對待測成分進行定性或半定量測定，這樣就限制了它在其它須準確定量的標本的應用。稍加改良的三層結構 在試劑層上加一多孔膠膜過濾層，其作用是將樣品中的雜質過濾掉，并起保護試劑層作用。常見的是微量法測定葡萄糖的試劑條。三層試劑載體的測定光路是通過透明的塑料基片，而不經(jīng)過最上面的過濾層，這樣消除了樣品中干擾成分的影響，保證了待測成分 測定的穩(wěn)定性和準確性。比擬完善的多層膜當代臨床檢驗中的干化學法，最具代表性的就是多層膜法，即干化學的多層膜試劑載體。它集現(xiàn)代化學、光學、酶工程學、化學計量學和計算機技術于一體。多層膜分為三種類型：比色/速率法干片、離子法干片和免疫速率法干片1

4、.1 介紹比色/速率法干片比色/速率法干片主要用于常規(guī)生化工程的測定，干片模式圖圖1顯示了一個臨床化學比色/速率法干片模式簡圖。在這個試劑片中，多種反響試劑被固化在一張透明聚酯膜上，上面覆以多孔的擴散層，然后被夾在一個塑料結構中。如下圖，共有4個功能層:擴散層、試劑層、指示劑層和支持層。每個試劑片的層數(shù)視所采用的分析方法而定，干片的大小大致與一枚郵票相同，顯色劑層呈現(xiàn)的 顏色深淺與待測物濃度成正比。圖4干片模式圖擴散層：擴散層的概念最早是由柯達研究實驗室Edwin Przybylowic 博士提出的，是由TiO2,BaSO4和醋酸纖維素構成的100-300微米的多空聚合物，聚合物的孔徑在1.5

5、 30微米之間。擴散層的孔徑和厚度將取決于特定分析的需要。擴散層的中空體積占 40% 90%這種毛細網(wǎng)狀結構能使樣品溶液快速、均勻地分布到下層。當一滴樣品約10微升加在試劑片上后，毛細作用將樣品迅速吸入多空擴散層，但樣品在一瞬間被下面的凝膠層所排斥，因為凝膠層在接受血清組份之前，必須先生成水合物。擴散層不僅可阻留細胞，結晶和其他小顆粒，它也可以根據(jù)需要讓大分子，如蛋白質等滯留。當待檢樣品通過擴散層后，可以消除溶液中影響檢測反響干擾物質。擴散層中的TiO2和BaSO4.方面可用來掩蓋待檢樣品中的有色物質，使反射光度計的測定結果不受影響，同時這些反光化合物也給干片底層的顯色層提供反射背景。在一些特

6、定試劑片中，擴散層中還含有選擇性阻留某種成份或啟 動某種反響的物質，以提高分析的特異性。試劑層：在化學試劑層中，根據(jù)實際測定的需要，可由數(shù)層至數(shù)十個功能試劑層組成。反響區(qū)的功能是將待測物通過物理、化學或生物酶學等反響轉化為可與顯色劑結合的化合物。試劑層中按照反響的順序涂布了不同的化學試劑，使反響按照預先的設定依次進行。針對不同檢測工程的個性化設計為化學反響提供了最理想的物理和化學反響環(huán)境一這就是為什么干化學技術能夠確保更準確的試驗結果。尿酸干片是使用去除劑層的一個例如。去除劑層含有抗壞血酸氧化酶，用于將抗壞血酸維生素C一種內(nèi)源性干擾物轉化，對試劑層中所發(fā)生反響不產(chǎn)生干擾。指示劑層：反響底物進入

7、指示劑層，在這里發(fā)生顯色反響。此層包含染料或相似的指示劑，使反響產(chǎn)物到達指示劑層后生成了有 色化合物，其顏色變化與分析物濃度成比例，被反射光檢測支持層：此層是透明塑料制成，起到支持其它層的作用，且允許光線百分之百透射，以便對有色復合物進行測量。顏色變化通過反射光檢測，由于光線不通過已經(jīng)被阻留在擴散層上的潛在干擾物，從而防止了對檢測結果的干擾。因為多層的設計，不同的工程參加了特殊的試劑層增強反響的特異性，干化學具有優(yōu)異的抗干擾能力。結合非結合膽紅素BuBc干片是使用屏蔽層的一個例如。屏蔽層可有效阻隔可能的干擾成分例如，血紅蛋白以防其進入擴散層，從而防止它們影響測量結果。1.2 直接選擇性電極離子

8、檢測干片離子鈉，鉀，氯檢測是干化學檢測工程中的傳統(tǒng)優(yōu)勢工程，采用離子法干片。其設計采用直接電勢法，樣本無需稀釋。離子干片是由紙橋將兩個離子選擇性電極相連，通過電壓表來測量患者樣本和參比液之間的電勢差，從而計算出鈉，鉀，氯的離子濃度。1.3 免疫速率法干片免疫速率法干片主要用于進行藥物濃度和蛋白質檢測，分為競爭法和非競爭性干片兩類。I. 競爭法例如地高辛讀數(shù)時采用了多點速率法來檢測分析物濃度。分析物與酶標抗原競爭有限數(shù)量的抗體結合位點。參加含底物的免疫洗液，一方面洗去未結合物質，另一方面抗原抗體復合物與無色底物反響顯色以670nm波長參加免疫洗液并孵育 2.5min后讀數(shù)；通過速率的變化采計算分

9、析物濃度，發(fā)射光密度與分析物濃度成反比。II.非競爭法CRP讀數(shù)時采用定點速率法。待測物與固相抗體、酶標抗體形成夾心“三明治。參加含底物的免疫洗液后洗去讀數(shù)視窗區(qū)域未結合物質，抗原抗體結合物與底物反響顯色，孵育2.5分鐘時讀數(shù)670nm發(fā)射光密度與待測物濃度成正比。1反射光度法的原理一一干化學分析法的理論根底反射光度法依據(jù)反射介質不同，有多種理論。光線進入介質后出現(xiàn)以下效應：在照射外表產(chǎn)生反射和折射內(nèi)部吸收在內(nèi)部或照射外表產(chǎn)生散射這些效應的總和決定了光再離開介質的比率和方向。反射光密度與分析物濃度不呈線性關系的原因是檢測到的光信號包含了反射光和散射光。光通過各層干片時，干片內(nèi)部各個層和外表會產(chǎn)

10、生散射和反射。檢測比色/速率和免疫速率法干片時采用的是反射分光光度法。強生干化學技術反射光理論是Williams,Clapper 等提出的。在儀器內(nèi)部光源發(fā)出一束光透過透明支持層，在試劑層光被有色化合物局部吸收后，在擴散層提供的反射面被反射，反射光經(jīng)濾光裝置后回到光度檢測器被讀數(shù)。光密度由此被轉化為電壓讀數(shù)，并計算成分析物濃度。圖E反射光示意圖干化學技術中入射光IO 100%進入干片。有色物質吸收一定比例光后反射。反射法檢測反射光IR，反射比為 R= lr/lo反射光密度DR公式為DR=log10反射法中，分析物濃度與DR不成比例關系。C不等于Ao 截距+A1 斜率*DR雖然不呈線性關系，但是

11、結果仍然可以預測。嚴密的研究建立了患者標本濃度與反射光密度間的數(shù)學關系。通過一個函數(shù)就可完成二者間轉換。函數(shù)關系是使用前通過定標盤載入檢測系統(tǒng)，通過函數(shù)實現(xiàn)每種測試工程的轉換。通用定標模式這是用來把儀器檢測光密度與分析物濃度建立關聯(lián)的通用公式。A0、A1、A2是未知的，需經(jīng)定標程序計算得出gDR是將檢測g(DR)與濃度呈線性關系。許多分析工程用了二條將DR轉換成g(DR)，轉換函數(shù)是出廠時由大量該儀器反復研究得出的，確保了 曲線來完成分析物濃度的轉換?！癉R曲線及“函數(shù)轉換曲線，二者在通過原點的直線上相交幾點可以看到二者呈鏡像關系。將它們疊加后，結果將全部落在 直線上。正是引入“函數(shù)轉換的目的

12、。當然，此圖8只是為了便于理解而畫的比擬規(guī)律，實際更為復雜。0.4每個定標品的g(DR)值都定義在通用定標模式中，方程式A (圖9)函數(shù)轉換曲線與定標曲線是相對應的，當DR為1.0時那么轉化為g(DR)校正讀數(shù)為1.3，當DR為0.6時，校正讀數(shù)應為g(DR)與通用定標模式值和未知值定標中的值有：C:三個是標品的濃度，是通過定標盤載入儀器的DR：從干片測得K:每種工程固定不變由定標載入雖未知但可計算出，是定標參數(shù)：A0=截距A仁斜率A2=曲率通過廠家的設置和用戶端的定標操作，每個標本的結果就可以通過光信號值計算得到反射光的反射背景是擴散層，光線不通過已經(jīng)被阻留在擴散層上的潛在干擾物，從而防止了

13、對檢測結果的干擾。這是擴散層承當 排除干擾的根底。由試劑片的結構和反射光檢測技術可見涂層技術相對于溶液化學分析技術具有很多優(yōu)點： 在試劑片中化學反響可以在個別物理分 層中進行，如下圖，前一反響的產(chǎn)物可以繼續(xù)進入另一層進行其他化學反響，從而引導一個反響序列，因此在多層復合薄膜中的各層 可以給出一種特定的環(huán)境用以完成某種特定的反響。這一點溶液化學分析是無法完成的，例如乳糜血的樣品，在進行溶液方式生化分析 時，就需要先脫脂，然后進行分析，而利用多層復合膜技術，即可在一個薄膜上一次完成全部反響，明顯提高了分析的特異性。同時由 于沒有溶液對待檢樣品的稀釋作用，所以本方法也可大大提高了檢測的靈敏度。這種能夠實施幾個連續(xù)的物理和或化學反響而無需操作 者介入的方法，就像計算機領域中廣泛應用的芯片技術，可以使繁雜的實驗室儀器設備和各種器皿聯(lián)合完成的工作固化在一個多層復合 薄膜上，極大的簡化了操作和提高重復性及穩(wěn)定性。因此，在短短的十幾年時間里，干化學技術即在世界各臨床化學實驗室廣為應用。經(jīng)過