去內(nèi)毒素的方法及檢查方法

1、去內(nèi)毒素的方法及檢查方法注：這部分內(nèi)容為內(nèi)毒素的檢測方法及去除方法。熱原(pyrogen)(pyrogen)是微生物產(chǎn)生的內(nèi)毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物， 微量即可引起恒溫動物體溫異常升高。 其中脂多糖具有很強(qiáng)的熱原活性。由革蘭氏陰性桿菌產(chǎn)生的熱原致熱能力最強(qiáng)，真菌、病毒也可以產(chǎn)生熱原?！鞠嚓P(guān)鏈接】熱原的危害一、熱原的性質(zhì)及除去熱原的方法1 1 . .高溫法熱原的耐熱性能良好， 60c60c 加熱 1h1h 不被分解破壞， 100C100C 不降解,但 180c180c3 34h4h、200c60min200c60min 或 250c250c303045min45min 可使熱原

2、徹底破壞。因此耐熱物品如玻璃制品、 金屬制品、 生產(chǎn)過程中所用的容器和其它用具以及注射時使用的注射器等， 均可采用此法破壞熱原。 但在通常使用的注射劑熱壓滅菌條件下不足以破壞熱原。2 2 . .吸附法熱原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性質(zhì)穩(wěn)定、吸附性強(qiáng)兼具助濾和脫色作用，故廣泛用于注射劑生產(chǎn)，但應(yīng)注意吸附藥液所造成的主藥的損失。3 3 . .超濾法熱原分子量為 1X1061X106 左右，體積較小，約 1 15nm5nm 可以通過一般濾器和微孔濾膜，但采用超濾法如用 3.03.015nm15nm 超濾膜可將其除去。4 4 . .蒸儲法熱原能溶于水但不揮發(fā)，但可隨水蒸

3、氣的霧滴進(jìn)入注射用水中，因此制備注射用水時，原水中的熱原可經(jīng)蒸儲除去，但需多次蒸儲，并加有隔沫裝置，單次蒸儲往往效果不理想。5 5 . .酸堿法熱原能被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)氧化劑破壞。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、輸液瓶等可用重銘酸鉀硫酸清潔液或稀氫氧化鈉處理，破壞熱原。6 6 . .其它包括離子交換法、凝膠濾過法、反滲透法等。二、熱原的檢查方法中國藥典20052005 年版規(guī)定熱原檢查采用家兔法，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查采用宜試劑法。1 1 . .熱原檢查法由于家兔對熱原的反應(yīng)與人基本相似，目前家兔法仍為各國藥典規(guī)定的檢查熱原的法定方法。中國藥典20052005 年版規(guī)定的熱原檢查法系將一定劑量的供試品，

4、靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性取決于試驗(yàn)動物的狀況、 試驗(yàn)室條件和操作的規(guī)范性。 家兔法檢測內(nèi)毒素的靈敏度為 0.001wg/ml,0.001wg/ml,試驗(yàn)結(jié)果接近人體真實(shí)情況，但操作繁瑣費(fèi)時，不能用于注射劑生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)控， 且不適用于放射性藥物、 腫瘤抑制劑等細(xì)胞毒性藥物制劑。2 2 . .細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系利用宣試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法.細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EUEU 表示。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括凝膠

5、法和光度測定法兩種方法，前者利用宣試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法， 系分別利用宣試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化及產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少來測定內(nèi)毒素。賞試劑法檢查內(nèi)毒素的靈敏度為 0.0001wg/ml,0.0001wg/ml,比家兔法靈敏 1010 倍，操作簡單易行，試驗(yàn)費(fèi)用低，結(jié)果迅速可靠，適用于注射劑生產(chǎn)過程中的熱原控制和家兔法不能檢測的某些細(xì)胞毒性藥物制劑，但其對革蘭陰性菌以外的內(nèi)毒素不靈敏，目前尚不能完全代替家兔法二除內(nèi)毒素的方法內(nèi)毒素在體外的減毒在體外有多種理化和生物學(xué)方法可以使內(nèi)毒素的毒性減低， 這些方法可用來

6、研究內(nèi)毒素毒性的化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)， 或用于消除某些制劑的致熱原（即內(nèi)毒素）污染，或用以制備防治用的免疫制劑等。(1)(1)物理方法： 紫外線、 射線、 超聲波等可使內(nèi)毒素毒性降低。 FustFust 等(1977)(1977)報導(dǎo)，內(nèi)毒素經(jīng)丫射線照射后，其對小白鼠致死性、狗體內(nèi)降壓作用以及抗補(bǔ)體等活性降低， 且其程度與射線照射劑量成正比。 經(jīng)照射的脂多糖激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑的能力減低， 如經(jīng)驗(yàn) 0megarads0megarads 照射的脂多糖， 激活補(bǔ)體幾乎全通過替代途徑。 如前所述， 經(jīng)典途徑由類脂A A激發(fā)， 可見照射主要作用于類脂A。NerdaNerdar r等(1977)(1977)指出經(jīng)照

7、射類脂 A A 中的(3(3 羥經(jīng)肉豆蔻酸即消失，且認(rèn)為照射可使內(nèi)毒素變?yōu)轭惗舅亍?Szilsgyi(1978)Szilsgyi(1978)通過家兔實(shí)驗(yàn)比較， 提出大腸桿菌內(nèi)毒素經(jīng)6060CoCo 電離照射后，引致白細(xì)胞和血小板減少及局部 ShwartzmanShwartzman 反應(yīng)的能力均明顯減低，而對纖維蛋白原和補(bǔ)體的影響較小。(2)(2)化學(xué)方法：用化學(xué)藥品使內(nèi)毒素減毒。所用化學(xué)藥品種類繁多，其機(jī)制有酸或磴的水解作用、?；饔?、脫?；饔?，轉(zhuǎn)酯化作用、羥胺解作用以及氫化鋁鋰(LiAIH4)LiAIH4)的還原作用等， 上述作用主要影響內(nèi)毒素類脂 A A 的脂肪酸部分，如 LiAIH4,

8、LiAIH4,使酯鍵斷裂，經(jīng) NaOHNaOH 處理，使內(nèi)毒素脂肪酸皂化，發(fā)生分子的化學(xué)構(gòu)型改變而減毒。若再加入 95%95%乙醇或 80%80%二甲基亞碉可加速其皂化，故用 0.03NNaOH0.03NNaOH 的 95%95%乙醇處理葡聚糖凝膠， 以去除污染的致熱原， 效果很好。(3)(3)生物學(xué)方法： 業(yè)已證實(shí)多粘菌素 B B 具有使內(nèi)毒素減毒的功能。 多粘菌素 B B的陽離子氨基與內(nèi)毒素類脂 A A 的帶負(fù)電荷的磷酸根結(jié)合， 使內(nèi)毒素失卻多種生物學(xué)活性(包括致死性、致熱性、抗補(bǔ)體的經(jīng)典途徑、促分裂活性、激發(fā)單核細(xì)胞產(chǎn)生組織因子、對白細(xì)胞、血小板和巨噬細(xì)胞的激發(fā)作用以及對賞珠溶解物的凝固能力等等）。因此認(rèn)為多粘菌素 B B 為類脂 A A 的抑制劑。CraigCraig 等（19741974）在實(shí)驗(yàn)狗體內(nèi)證實(shí)多粘菌素 B B 有抗脂多糖的活性，然而必須使用高毒性劑量，以致臨術(shù)應(yīng)用極為困難。CorriganCorrigan 等（19791979）以出血敗血性巴斯德菌造成家兔的內(nèi)毒素血癥的前或后給予多粘菌素 B,B,均可減低血液中內(nèi)毒素量，從而