生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)復(fù)習(xí)重點(diǎn)匯編詳細(xì)

1、【精品文檔】如有侵權(quán)，請聯(lián)系網(wǎng)站刪除，僅供學(xué)習(xí)與交流生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)復(fù)習(xí)重點(diǎn)匯編詳細(xì).精品文檔.前言1. 本課程主要講述了哪些實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其中被稱為生化實(shí)驗(yàn)室中三大實(shí)驗(yàn)技術(shù)的是？答：層析技術(shù)、電泳技術(shù)、離心技術(shù)、分光光度技術(shù)、免疫化學(xué)技術(shù)。其中層析技術(shù)、電泳技術(shù)、離心技術(shù)是生物學(xué)的三大實(shí)驗(yàn)技術(shù)。第一章 生物化學(xué)基本操作與要求1.洗滌液的種類配置與應(yīng)用答：（1）鉻酸洗液（稱取5g重鉻酸鉀粉末置于250mL燒杯中，加水5mL，盡量使其溶解，慢慢加入濃硫酸100mL，邊加邊攪拌。冷卻后貯存?zhèn)溆?，若顏色變綠，表示洗液已失效。）用于洗滌玻璃器皿。（2）濃鹽酸，洗去水垢或某些無機(jī)鹽沉淀。（3）30%硝酸，洗

2、滌CO2測定儀器及微量滴管（4）45%尿素，洗滌蛋白制劑、血樣（5）有機(jī)溶劑，洗滌油脂、脂溶性染料（6）去污粉，一般污染物2. 化學(xué)試劑的分級答：3. 什么是準(zhǔn)確度、精密度？答：準(zhǔn)確度表示實(shí)驗(yàn)分析測量值與真實(shí)值相接近的程度。誤差。精密度是指在相同條件下多次測量結(jié)果互相吻合的程度，表現(xiàn)了測定結(jié)果的再現(xiàn)性。偏差。4. 如何提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度、精密度？答：準(zhǔn)確度：減少系統(tǒng)誤差1.儀器校正2.空白試驗(yàn)3.對照實(shí)驗(yàn)；精密度：減少偶然誤差1.平均取樣2.多次取樣。第二章 層析技術(shù)1. 層析技術(shù)及其原理答：層析技術(shù)是一種基于被分離物質(zhì)的物理、化學(xué)、生物學(xué)特性的不同，使它們在某種機(jī)制中移動速度不同而進(jìn)行分離和分

3、析的方法。2. 名詞：固定相、流動相、分配系數(shù)答：固定相：固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑、凝膠、離子交換劑等）也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附、溶解、交換等作用。流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等。分配系數(shù)：是指在一定的條件下，某種組分在固定相和流動相中含量的比值，Kd=固定相中的總量/流動相中的總量。3. 層析法的分類答：按流動相的形式分：氣相色譜法1.氣固色譜法2.氣液色譜法，液相色譜法1.液固色譜法2.液液色譜法；按固定相的形式分：1.柱層析法2.紙層析法3.薄層層析法

4、。4. 幾種主要凝膠的中英文名稱、型號、及型號數(shù)字代表的含義答：葡萄糖凝膠（dextran型號Sephadex G-10200數(shù)字代表凝膠的吸水率）聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide主要型號有Bio-Gel P-2300,數(shù)字代表它們的排阻極限的10-3）瓊脂糖凝膠（agarose Sepharose,Bio-Gel A）5. 凝膠層析及其基本原理、操作過程和主要應(yīng)用答：是利用凝膠把物質(zhì)按分子大小不同進(jìn)行分離的一種方法。原理：由于被分離物質(zhì)的分子大小不同，洗脫時，大分子物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨溶劑向下移動，因此流程短，首先流出層析柱，而小

5、分子物質(zhì)，由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，能自由進(jìn)出膠粒網(wǎng)孔，使之洗脫流程增長，移動速度慢而后流出層析柱。應(yīng)用：1）脫鹽及去除小分子雜質(zhì)2）蛋白質(zhì)的分離、生物大分子的純化3）分子量測定4）去熱源物質(zhì)5）溶液的濃縮6. 離子交換層析的原理、離子交換劑的類型答：原理：依據(jù)各種帶電離子或生物大分子與帶相反電荷離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的。陰離子交換劑：吸附陰離子，如DEAE；陽離子交換劑：吸附陽離子，如CM。7. 離子交換色譜的操作和應(yīng)用答：1.離子交換劑的選擇2.離子交換劑的處理和保存3.層析柱的選擇4.平衡緩沖液的選擇5.洗脫、洗脫速度控制6.樣品的濃縮、脫鹽7.再生和保存。應(yīng)用：1.水處理2.

6、分離純化小分子物質(zhì)3.分離純化生物大分子物質(zhì)。8. 何謂親和層析答：是利用生物分子間專一的親和力而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。9. 各種層析原理和載體的綜合比較 （見ppt表）答：第三章 電泳技術(shù)1. 電泳（技術(shù)）的概念答：帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象。2. 電泳的分類答：按分離的原理：1.區(qū)帶電泳2.自由界面電泳3.等速電泳4.等電聚焦電泳；按支持介質(zhì)的不同：1.紙電泳2.醋酸纖維薄膜電泳（1、2為區(qū)帶電泳）3.瓊脂凝膠電泳4.聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳（PAGE）5.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)；按支持介質(zhì)形狀不同：1.薄層電泳2.板電泳3.柱電泳；按用途不同：1.分析電泳

7、2.制備電泳3.定量免疫電泳4.連續(xù)制備電泳；按所用電壓不同：1.低壓電泳2.高壓電泳。3. 什么是遷移率？影響遷移率、電泳分離的主要因素答：是指帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度下泳動的速度，m=v/E。遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比，與粒子的形狀有關(guān)；電泳分離的影響因素：1.帶電顆粒的性質(zhì)（所帶凈電荷的數(shù)量大小及形狀）2.溶液的pH值（離等電點(diǎn)遠(yuǎn)，快）3.溶液的離子強(qiáng)度（離子強(qiáng)度小泳動快）4.電場強(qiáng)度5.電滲作用（方向一致，快）6.支持介質(zhì)的篩孔。4. 如何制備聚丙烯酰胺凝膠？答：1.化學(xué)聚合：加速劑TEMED使催化劑過硫酸銨形成自由基，這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰

8、胺和甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)形成;2.光聚合：催化劑核黃素經(jīng)光照形成無色基，再被痕量氧氧化成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED存在可加速聚合。5. 聚丙烯酰胺凝膠電泳和不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的區(qū)別、分離效應(yīng)答：區(qū)別：A：整個電泳體系中所用緩沖液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的；B：在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液，pH值和孔徑。分離效應(yīng)A：分子篩效應(yīng)（某分子通過這種網(wǎng)孔的能力將取決于凝膠孔隙和分離物質(zhì)顆粒的大小和形狀）B：1.樣品的濃縮效應(yīng)2.電荷效應(yīng)3.凝膠的分子篩效應(yīng)。6. 簡述等電聚焦及其優(yōu)缺點(diǎn)答：是根據(jù)兩性物質(zhì)等電點(diǎn)（pI）的不同而進(jìn)行分離的。優(yōu)點(diǎn)：1.分辨率高，可達(dá)0.01

9、pH單位2.能抵消擴(kuò)散作用，使區(qū)帶越走越窄3.可直接測出蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，精確度可達(dá)0.01pH單位。缺點(diǎn)：1.該法要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀2.不適用在等電點(diǎn)不溶或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)。7. 什么是雙向電泳？答：由第一向等電聚焦（IEF）電泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)合組成。第四章 離心技術(shù)1. 離心技術(shù)的概念答：是利用轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，根據(jù)物質(zhì)顆粒沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度的差異將其分離的方法。2. 名詞：相對離心力、沉降速度、沉降系數(shù)、沉降常數(shù)答：相對離心力：F=m2r,F常用重力加速度表示，稱為相對離心力。沉降速度：在離心力作用下，單位時間內(nèi)

10、物質(zhì)顆粒運(yùn)動的距離。沉降系數(shù)：單位離心力下的沉降速度。沉降常數(shù)：顆粒在20水中的沉降系數(shù)。3. 離心機(jī)和離心轉(zhuǎn)頭（轉(zhuǎn)子）的種類答：離心機(jī)的種類：低速、高速、超速離心機(jī)，冷凍離心機(jī)，臺式、地式離心機(jī)，制備性、分析性離心機(jī)；離心轉(zhuǎn)頭的種類：1.角度轉(zhuǎn)頭FA2.甩平式轉(zhuǎn)頭SW3.垂直轉(zhuǎn)頭V4.區(qū)帶轉(zhuǎn)頭Z5.連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭CF。4. 簡述離心分離的方法（3種） p99101答：1.差速沉降離心：不斷改變離心速度，使沉降速度不同的顆粒在不同的速度和時間下分批分離的方法，一般用于沉降系數(shù)相差較大的顆粒，用角度轉(zhuǎn)頭。2.差速區(qū)帶離心：在一定離心力的作用下存在沉降系數(shù)差的不同顆粒各自以一定速度沉降，后在密度梯度

11、不同的介質(zhì)上形成區(qū)帶，用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆?；蛎芏认嗨拼笮〔煌臉悠泛秃怂帷⒌鞍踪|(zhì)等成分。3.等密度離心：離心管中預(yù)先放好梯度介質(zhì)離心時，樣品的不同顆粒一直移動到與他們密度相等的特定梯度位置上，形成不同的區(qū)帶，用于分離大小相近而密度不同的樣品。5. 如何進(jìn)行離心區(qū)帶的收集？答：1.用注射器和滴管由離心管上部吸出2.用針刺穿離心管底部滴出3.用針刺穿離心管區(qū)帶部分的管壁，把樣品區(qū)帶抽出4.用一根細(xì)管插入離心管底，泵入超過梯度介質(zhì)最大密度的取代液，將樣品和梯度介質(zhì)壓出，用自動部分收集器收集。第五章 分光光度技術(shù)1. 名詞：朗伯-比爾定律、吸收光譜、吸收光譜曲線答：朗伯-比爾定律：當(dāng)一束平行

12、單色光通過含有吸光物質(zhì)的稀溶液時，吸光度與溶液的濃度、液層厚度的乘積成正比A=KCL。吸收光譜：通常分子處于基態(tài)，當(dāng)他吸收一定能量躍遷到激發(fā)態(tài)，則產(chǎn)生吸收光譜。吸收光譜曲線：若逐漸改變照射某物質(zhì)的入射光的波長，并測定物質(zhì)對各種波長光的吸收程度或透射程度，以波長作橫坐標(biāo)，“A（吸光度）”或“T（透光度）”為縱坐標(biāo)，畫出連續(xù)的“A-”或“T-”曲線。5. 圖示說明分光光度計的基本結(jié)構(gòu)答：6. 分光光度計的光源及適用范圍答：光源要求：1.能提供連續(xù)的輻射；2.光強(qiáng)度足夠大；3.在整個光譜區(qū)內(nèi)光譜強(qiáng)度不隨波長有明顯變化；4.光譜范圍寬；5.使用壽命長、價格低。熱輻射光源用于可見光和近紅外光區(qū)的光源如鎢

13、燈和鹵鎢燈，使用波長范圍是3201100nm，氣體放電光源用于紫外光區(qū)的如氫燈和氘燈，使用波長范圍是195400nm。7. 分光光度計分析條件的選擇（見講義）答1.儀器測量條件的選擇；2.顯色反應(yīng)條件的選擇3.參比溶液的選擇。8. 為什么要進(jìn)行顯色反應(yīng)？顯色反應(yīng)需要滿足哪些要求？影響顯色反應(yīng)的因素有哪些？答：響顯色反應(yīng)的因素有：顯色劑用量,溶液酸度,顯色時間,溫度,溶劑9. 分光光度法在核酸與蛋白質(zhì)的純度分析中的應(yīng)用原理答：可用A260/A280的比值鑒定其純度純DNA比值為1.8，純RNA比值為1.0。第六章 免疫化學(xué)技術(shù)1.雙向免疫擴(kuò)散法 答：是以瓊脂為介質(zhì)的Ag-Ab沉淀反應(yīng)。2.闡述2

14、種免疫電泳的原理（對流免疫電泳、火箭免疫電泳）答：3.對流免疫電泳與雙向免疫擴(kuò)散法的異同答：對流免疫電泳：是在凝膠介質(zhì)中將電泳法和擴(kuò)散法相結(jié)合的一種免疫化學(xué)方法。雙向免疫擴(kuò)散法：是以瓊脂為介質(zhì)的Ag-Ab沉淀反應(yīng)。異：對流免疫電泳是抗原、抗體分子在電場作用下定向運(yùn)動，雙向免疫擴(kuò)散法是自由擴(kuò)散。同：都基于瓊脂凝膠為介質(zhì)的一種沉淀反應(yīng)的特性，根據(jù)沉淀出現(xiàn)與否及沉淀量的多寡，可定性定量地檢測出樣品中抗原或抗體的存在及含量。4.ELISA及其基本原理 答：酶聯(lián)免疫吸附法是指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上，進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量方法。第七章 固定化技術(shù)1. 固定化酶、固定化細(xì)胞的概念答

15、：固定化酶：將水溶性酶用物理化學(xué)方法處理，固定于不溶性載體上，稱為不溶于水，但仍有酶活性的一種酶制劑形式。固定化細(xì)胞：就是被限制自由移動的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并能反復(fù)或連續(xù)使用。2. 固定化酶的優(yōu)點(diǎn)，答：優(yōu)點(diǎn)：1.純化簡單2.酶的穩(wěn)定性有所改進(jìn)；3.酶的使用效率提高，可以反復(fù)利用；4.反應(yīng)條件容易控制。3. 固定化酶的制備方法答：1）吸附法：利用離子鍵、物理吸附等方法，將酶固定在纖維素、瓊脂糖、多孔玻璃等載體上；2）包埋法：用物理方法把酶包埋在凝膠細(xì)小的格子中，或包圍在半透膜或聚合物中，酶本身不參與反應(yīng)；3）共價結(jié)合法：酶與不溶于水的

16、載體以共價鍵形式結(jié)合制備固定話酶的方法；4）交聯(lián)法：雙功能試劑或多功能試劑與酶分子中的氨基酸殘基作用，使酶與酶之間交聯(lián)成網(wǎng)。4. 固定化細(xì)胞比固定化酶有何優(yōu)點(diǎn)？答：第八章 生物大分子制備技術(shù) 1.生物大分子的制備的一般步驟是哪些？答：2.生物大分子制備物均一性要滿足什么鑒定要求？答：3.細(xì)胞破碎的方法答：反復(fù)凍融法；自溶法；溶脹法；有機(jī)溶劑處理法；表面活性劑處理法。5. 蛋白質(zhì)的分離純化方法及簡述（分四大類，p142）答：1.以分子大小和形態(tài)的差異為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾等；2.以溶解度的差異為依據(jù)的方法：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結(jié)晶等；3.以電荷差異為

17、依據(jù)的方法：電泳、電滲析、等電點(diǎn)沉淀、吸附層析和離子交換層析等；4.以生物學(xué)功能專一性為依據(jù)的方法：親和層析等。2. 如何檢測、判斷、提高提取DNA的質(zhì)量通過測定它的濃度和OD值。DNA溶液稀釋20-30倍后，測定OD260/OD280比值，明確DNA含量和質(zhì)量。通過分光光度計判斷。5.什么是膜分離、透析、超濾、鹽析法膜分離：用具有選擇透過膜性能的薄膜（分離膜），在外力推動下對多組分溶質(zhì)和溶劑進(jìn)行分離、提純、濃縮的方法。透析：是通過小分子經(jīng)過半透膜擴(kuò)散到水（或緩沖液）的原理，將小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術(shù)。超濾：是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑

18、的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。鹽析：溶液中加入無機(jī)鹽類而使某種物質(zhì)溶解度降低而析出的過程6. DNA、RNA的定量答：7. 生物大分子濃縮、干燥的方法答：濃縮的方法：1.減壓加溫蒸發(fā)濃縮2.空氣流動蒸發(fā)濃縮3.冰凍法4.吸收法5.超濾法。干燥的方法：1.真空干燥2.真空冷凍干燥第九章 放射性同位素技術(shù)1.什么是同位素示蹤法，有什么特點(diǎn)？答：是利用放射性核素作為示蹤劑對研究對象進(jìn)行標(biāo)記的微量分析方法。特點(diǎn)：1.靈敏度高2.測量方法簡便易行3.能準(zhǔn)確地定量定位4.符合研究對象的生理條件。2. 放射性防護(hù)的三原則答：放射實(shí)踐的正當(dāng)化、放射防護(hù)的

19、最優(yōu)化、個人劑量限制第十章 PCR1.什么是PCR，PCR的主要步驟是什么？答：聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷三磷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶進(jìn)行的酶促合成反應(yīng)。主要步驟：1.雙鏈DNA模板加熱變性成單鏈(變性)；2.在低溫下引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對（退火）；在適宜溫度下TaqDNA聚合酶催化引物沿著模板DNA延伸（延伸）。2. 什么是PCR-SSCP，簡述它的基本原理、主要應(yīng)用。答：實(shí)驗(yàn)部分1. 蛋白質(zhì)（酶）分離純化的一般步驟、鑒定方法、注意事項1. 分光光度計使用時，在波長360nm1000nm內(nèi)，用 熱輻射光源 作光源，在波長200nm350nm范圍內(nèi)，用 氣

20、體放電光源作光源；其測定值A(chǔ)在 0.20.8 范圍內(nèi)誤差較小。2. Biogel P 中文名是 聚丙烯酰胺凝膠 ，其型別P300表示 排阻極限為4*105 。3. 離心轉(zhuǎn)頭是離心機(jī)的主要部件之一，主要可分為 角度轉(zhuǎn)頭 、 垂直轉(zhuǎn)頭 、 甩平式轉(zhuǎn)頭 、 區(qū)帶轉(zhuǎn)頭 、 連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭 等。4. DNA常用紫外分光光度法進(jìn)行定量，通常1 OD260相當(dāng)于 50µg/ml 雙鏈DNA 。1. 帶電顆粒在電場中的電泳分離取決于下列哪項因素：（ABCDE ）A.電場強(qiáng)度 B.顆粒所帶凈電荷數(shù)及其大小形狀C. 支持物的電滲作用D.溶液的pH值E.溶液的離子強(qiáng)度 2. 偶然誤差是由于某些難以預(yù)料的偶然因素或是測定過程中某些不易控制的因素引起的誤差。請問下列哪些方法可以減少偶然誤差？ （ CE ）A.儀器校正 B. 對照實(shí)驗(yàn) C. 平均取樣 D. 空白實(shí)驗(yàn) E. 多次取樣3.下列哪些方法可用于細(xì)菌細(xì)胞的破碎？ （ABCDE ）A.超聲波處理 B. 高壓擠壓勻漿C. 纖維素酶處理 D. 溶菌酶處理 E.搗碎機(jī)1. 吸收光譜：處于基態(tài)和低激發(fā)態(tài)的原子或分子吸收具有連續(xù)分布的某些波長的光而躍遷到各激發(fā)態(tài)，形成了按波長排列的暗線或暗帶組成